En genetisk skærm for at isolere Toxoplasma gondii Host-celle afstigningstrin Mutants

Oversigt

Protokoller er tilvejebragt først at definere den dosis af mutagen fører til en 70% drab af parasitter (protokol 1). Den næste procedure til berige inducerede udgangs-mutanter fra en mutageniseret parasit pool (protokol nr. 2, figur 2). Dette efterfølges af en protokol til at teste forekomsten af ​​udgangs mutanter i den berigede pool eller validere udgang fænotype i individuelle mutanter (protokol 3). Endelig er en protokol, forudsat at generere en enkelt parasit kloner fra beriget befolkninger ved begrænsende fortynding (protokol 4).

1. Titrering af mutagen

Brug særlig forsigtighed, såsom dobbelt handsker, når du arbejder med meget mutagene forbindelser og væsker. Saml flydende affald separat for korrekt bortskaffelse.

1. Inokulere T25-vævskulturkolber konfluente med humane forhuds fibroblast (HFF) celler med 1 ml frisk lyserede tachyzoitter og vokse 18-25 timer ved 37 °; C under _5% CO2 i ED1 medium (D-MEM suppleret med 1% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 0,2 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin, 50 ug / ml streptomycin og 0,25 ug / ml amphotericin B ). Se Roos et al. til generel vækst og medier HFF-celler og parasitter ^21.
2. Erstatte mediet med 10 ml 0,1% føtalt bovint serum-medium (fortyndet ED1 1:10 i D-MEM) og efterlader i befugtet 37 ° C inkubator under _5% CO2 (kaldet "37 ° C inkubator" herfra) i 10 minutter .
3. Tilsættes 0, 12,5, 25, 50 eller 100 pi ENU (1 M stamopløsning i DMSO) eller EMS (1 M stamopløsning i DMSO) per kolbe (mutagen arbejder fortyndinger vil være 1,25, 2,5, 5 og 10 mM). Tilsættes DMSO til 100 pi for hver kolbe. Inkuberes i 4 timer i et 37 ° C inkubator.
4. Vaskes tre gange i 10 sekunder ved stuetemperatur ved at skylle monolag med 10 ml kold PBS (præ-afkølet ved 4 ° C).
5. Tilsæt 5 ml PBS, skrabe monolag løs med en gummispatel (celle scraper), passerer skrabet celler gennem en 26,5 G nål til fysisk fjernelse af parasitten fra fibroblaster (klip af akslen uden nålen med tunge saks til at udsætte nål), og filter med 3,0 um polycarbonatfilter. Multiple nåle passager vil forøge effektiviteten af ​​frigivelse parasitter fra værtscellen.
6. Tæller parasitten koncentration ved anvendelse af et hæmocytometer. Lad parasitter bundfælde i 5 minutter i hemocytomer inden tællingen.
7. Fortynd parasitter til 10.000 parasitter pr 3 ml i ED1 (for 10 ml 33.333 parasitter der er behov).
8. Inokulere en brønd i en 6 brønds plade med 3 ml af de fortyndede parasitter (indeholdende 10.000 parasitter). Serielt fortyndet parasitter 10-fold i løbet af 3 brønde i en 6-brønds plade konfluente med HFF-celler indeholdende 2,7 ml ED1 ved at overføre 300 gl af den første brønd. Pladerne henstår uforstyrret i 37 ° C inkubator i 7 dage.
9. Aspireres mediet, fastgøres 15 minutter med 3 ml / brønd 100% ethanol, farvesmed 3 ml / brønd krystalviolet-opløsning (12,5 g krystalviolet i 125 ml ethanol blandet med 500 ml 1% ammoniumoxalat) i 15 minutter, skylles med 3 ml / brønd PBS (1 minut) og lufttørres. Alle ved stuetemperatur.
10. Tæller plaques og vælge koncentration af mutagen for at opnå overlevelse af 30% af de eksponerede parasitter (70% drab dosering: se figur 1). En dosis på 70% drab er anvendt historisk ¹⁴ og induceres mindre end 100 punktmutationer pr genom (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript indsendt).

2. Berigelse af udgangs mutanter (figur 2)

1. Udføre mutagenese som beskrevet ovenfor under anvendelse af en mutagen dosis inducere 70% drab. Vokser op mutageniseret population for en passage i en ny kolbe af værtsceller.
2. Inficerer en T25, HFF sammenflydende vævskulturkolbe med 120.000 frisk lyserede parasitter fra en mutageniseret population i 10 ml ED1. Inkuber i 2 timer i en 35 ° C inkubator under 5% COz2 og befugtet (herfra kaldet "35 ° C inkubator").
3. Aspirer medium og skyl 10 sekunder med 10 ml kold PBS og derefter tilsættes 10 ml ED1 medium suppleret med 25 mg / ml dextransulfat (DS) ^13. Inkuber i 26 timer i en 40 ° C inkubator under _5% CO2 og befugtet (herfra kaldet "40 ° C inkubator").
4. Forbered arbejder opløsning af udgangs-forstærkere. Fortynd udgang inducer valg ved brugskoncentration i et 15 ml Falcon-rør indeholdende 10 ml HBSSc suppleret med 25 mg / ml DS. Opvarme fortyndinger i 30 minutter i et 37 ° C vandbad. Se tabel 1 for arbejder koncentrationer.
5. Aspirere medium fra parasit-inficerede kolber, og der tilsættes forvarmet udgang inducer opløsning. Inkuber i 37 ° C inkubator i de tidspunkter der er angivet i tabel 1.
6. Aspirer mellemstore og skyl 10 sekunder med 10 ml kold PBS og derefter tilsættes 10 ml ED1 suppleret med 25 mg / ml DS og 50 pM pyrrolidin dithiocarbamat (PDTC: annonced 5 gl 100 mM PDTC Stock i PBS) ^13. Inkuber 5 timer i en 35 ° C inkubator.
7. Aspirer mellemstore og skyl 10 sekunder en gang med 10 ml PBS (stuetemperatur) og derefter tilsættes 10 ml ED1 medium. Sættes kolber tilbage til 35 ° C inkubator indtil parasitter ødelægge monolaget: rystekolber dagligt. Dette opsving tager omkring 7 dage.

3. Validering af mutante fænotyper af udgangs-assays

Efter udførelse af berigelse skærmen og vokser op den berigede population for en passage i HFF celler, skal de fænotyper at blive bekræftet af en udgang analyse ^11,13. Dette assay bør også anvendes til at validere enkelte kloner efter protokol 4.

1. Inokulere 20.000 parasitter per brønd i en 24-brønds plade indeholdende konfluente HFF-celler dyrket på dækglas (1 ml ED1 medium per brønd). Inkuber 8 timer i en 35 ° C inkubator derefter overføres til en 40 ° C inkubator i 24 timer.
2. Vaskes med 1 ml / brønd PBS (10 sekunder ved stuetemperatur). Tilsæt 1 ml udgangs inducere (omfatte en DMSO alene negativ kontrol), præ-opvarmet og fortyndet i HBSSc og inkuberes i den tid, der er beskrevet i tabel 1.
3. Aspirer medium og fastgøres med 1 ml / brønd 100% methanol i 15 minutter ved stuetemperatur.
4. Hvis forældre parasitter, der udtrykker en autofluorescerende protein blev brugt til mutagenese, skal du fortsætte til trin # 3,5 ^13. Hvis ikke-fluorescerende protein udtrykkende parasitter blev anvendt som forældrelinie, farves de faste dækglassene med Diff-Quick farvning i 1 minut ved stuetemperatur ^11.
5. Vaskes 5 minutter med 1 ml / brønd PBS i 24-brønds plade ved stuetemperatur.
6. For fluorescerende proteiner, der udtrykker parasitter: hurtigt skylles dækglasset i _ddH2O (dypning) og monteres på objektglas under gelmount at beskytte fluorescenssignal. For Diff-Quick farvede parasitter, vask 10 sekunder i 100% ethanol og lad lufttørre før montering på dias.
7. Med en (fluorescens) mikroskop med en40-60x objektiv tælle procentdelen af ​​vakuoler egressed versus vakuoler, der forblev intracellulær (se figur 4).

4. Klone udgangs mutanter ved begrænsende fortynding

Efter validering af fænotypen af ​​det berigede udgang mutanten population ved anvendelse af protokol 3, skal det polyklonale population, der skal klones til opnåelse af en enkelt parasit kloner.

1. Tæl parasit befolkningen i en hæmocytometer og fortyndes til en koncentration på 500 parasitter per ml i ED1 medium.
2. I en 384-brønds plade indeholdende et konfluent monolag af HFF-celler, erstattes mediet med 40 gl / brønd af ED1 medium ved anvendelse af en multi-kanal pipette. Som vist i figur 5, kan fire polyklonale populationer klones per plade som følger: pipette 40 gl / brønd fortyndet mutant 1 i brønde C3-C12, mutant 2 i brønde C13-C22, mutant 3 i brønde H3-H12, og mutant 4 i brønde H13-H22 (ultimo volumen i brønde er nu 80 pl). Ved hjælp af en multi-kanal pipette, pipette solution op og ned 5 gange, derefter overføre 40 pi til rækken under start række (fra række C til D eller række H til I). Videreføre disse to-fold seriefortyndinger gennem rækken G (mutanter 1 og 2) eller p N (mutanter 3 og 4). Kassér ekstra 40 pi fra den sidste række. Inkuber i en 35 ° C inkubator i 7-10 dage uden at forstyrre pladen.
3. Se brøndene på et inverteret mikroskop med en 10-20x mål for tilstedeværelsen af ​​enkelte plaques, synlig som har huller 'i monolaget.
4. Pick 4 brønde pr mutant med en enkelt plak og overføre parasitter i en vævsdyrkningskolbe sammenflydende med HFF-celler og fyldt med ED1 medium. Dyrke parasitter i en 35 ° C inkubator, rystes kolberne dagligt for at dispergere de ekstracellulære parasitter. Det tager typisk 7 dage.

5. Repræsentative resultater

Den mutagene ENU og EMS er ikke stabile, når de opbevares over længere tidsperioder. Derfor teste mutagene kraftbestandene er afgørende for at opnå reproducerbare resultater. Typiske titrering resultater og drab kurver for både ENU og EMS er vist i figur 1. Imidlertid anbefales det at udføre plakanalyser for hver mutagenese eksperiment for at sikre, at den passende dosis blev anvendt. At opretholde diversitet i mutageniserede parasitten populationen, er det vigtigt at fortsætte med udgang mutant skærmen så hurtigt som muligt. Typisk er den ene passage af parasitter i en ny kolbe udført for at lade overlevende parasitter genvinde før de går videre med skærmen. Det skal erindres, at gøre dette vil resultere i spaltning af mutanterne. Derfor kan det ikke udelukkes, at flere klonede mutanter isoleret efter afslutningen hele proceduren indeholder nøjagtig den samme genotype. For at undgå at isolere de samme mutant flere gange anbefales det at isolere kun en enkelt udgang mutant pr mutagenese, medmindre deres fænotyper (f.eks differentierede udgangs-inducer følsomheder) ermeget forskellige fra hinanden. På den anden side. Ikke hvert skærmen resulterer i isolering af mutanter med den ønskede fænotype Især ^{Ca2 +-ionophor} A23187 resistent fænotype er sjælden og kræver multiple mutageneseeksperimenter og skærme til at isolere en enkelt udgang mutant. Det anbefales derfor at udføre 5-10 mutagenese og skærmen eksperimenter parallelt.

Berigelsen effekt af skærmen blev testet ved at blande en kendt udgang mutant med vildtype-parasitter i forskellige forhold. Disse blandinger blev underkastet skærmen og forekomsten af ​​mutant fænotype i den berigede population blev vurderet. Ved anvendelse af vildtype-parasitter, som udtrykker cytoplasmatisk RFP og en mutant, der udtrykker cytoplasmatisk YFP forekomsten kan hurtigt etableres ved hjælp af flowcytometri (fig. 3) ^13. Resultaterne viser, at mutante fænotyper kan rutinemæssigt beriget til 80% renhed ved at starte med en udgang mutant parasit per 10.000 vildtype parasites ^13. Når udgangsventilen mutant: vildtype parasit starten forholdet 1:100.000 parasitter, isoleret population er kun 1-2% (1:100) udgangs-mutanter. Derfor berigelse effekt af skærmen er 1000 gange. Siden skærmen starter med podning af 120.000 parasitter, hvoraf typisk 70% er levedygtige, vi typisk udfører to runder af berigelse. De isolerede parasitter er vokset op mellem berigelse runder. Denne fremgangsmåde fører til en 100% mutant populationen, selv når der startes med 1:1.000.000 udgangs mutant: vildtype-parasitter.

Udgangsventilen assay til at validere og karakterisere fænotyper kræver en flerhed af værtscelle-infektion, som tillader differentiering af individuelle vakuoler. Dette er især kritisk, når man analyserer vilkår med høje procentdele af nødudgange de enkelte parasitter er spredt rundt omkring. Som vist i figur 4, hvis egressed populationer ikke er godt adskilte er det let at undervurdere den procentviseudløbspunktet ved at tælle to egressed vakuoler som en vakuolen. Idet udgangs-og invasion er relaterede processer, og nogle temperaturfølsomme fænotyper viser en mild fænotype ved den lavere temperatur, vil ikke alle mutanter har lignende invasion effektiviteter. Disse mutanter skal derfor podes på flere gange højere doser for at opnå en tilstrækkelig høj vakuole tæthed for en nøjagtig vurdering af deres udgang fænotype. Desuden har nogle udgangs-induktorer ikke effektivt stimulerer udstrømning af vakuoler, der indeholder fire parasitter eller mindre. Som sådan er det vigtigt, at vakuoler indeholder otte parasitter eller mere, når startes udgang assay. I vores laboratorium har vi screene mutanter isoleret med en bestemt udgang enhancer mod andre udgangs enhancere. Ved at profilere deres krydsreaktivitet mutanterne kan inddeles i forskellige klasser. Endelig, vil ikke alle udgangs-mutanter være temperatur-følsomme. Især mutanter isoleret med udgangs-induktorer udløser trin før udgivelsen af ​​intracellular ^{Ca2 +} er tilbøjelige til ikke-temperaturfølsomme fænotyper. Dette skyldes, at de parallelle veje, der kan føre til udtræde før signalet konvergerer på frigivelsen af intracellulære ^{Ca2 +.}

Figur 1. Kemisk mutagen dosistitrering. A. Plakanalyser udført i en 6-brønds plade under anvendelse af forskellige EMS koncentrationer og forskellige antal parasitter per brønd som angivet. De hvide pletter er parasit plaques dannet i HFF monolag. B, C. Overlevelseskurver for parasitter ved udsættelse for forskellige doser af EMS (B) og ENU (C). Overlevelse blev vurderet ved plaque-assays. En dosis inducere 70% drab vælges til mutagenese eksperimenter. Gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter + / - standardafvigelse er vist.

et al. ^13.

Figur 3. Typisk berigelse af udgangs mutante fænotyper. Enrichment resultaterne af en udgangs-mutant blandet ind i vildtype-parasitter i forskellige forhold (x-akse). Procentdelen af ​​udgangs mutante fænotyper i populationen vokset op efter skærmen er afbildet på Y-aksen, og blev vurderet med flowcytometri (udgangs mutante parasitter udtrykt cytoplasmatisk YFP, vildtype-parasitter udtrykt cytoplasmic RFP). Resultaterne af tre uafhængige eksperimenter er repræsenteret af røde, blå og grønne datapunkter. Vedtaget af Eidell et al. ^13.

Figur 4. Typiske resultater af en udgang assay. A. Pile markerer fire forskellige intakte vakuoler indeholdende 4-8 parasitter. B. Pile markerer fire grupper af spredte parasitter afspejler fire uafhængige egressed vakuoler. Udgang blev induceret ved A23187 (B) eller DMSO som en negativ kontrol (A). Parasitter udtrykke cytoplasmisk YFP ^22.

Figur 5. Seriel fortynding for klonale parasit linier Fire polyklonale populationer (rød, blå, gul, grøn) seriefortyndes i en enkelt 384-brøndplade konfluente med HFF-celler. Række C og jeg får 10 parasitter per brønd oger 2-fold fortyndet (40 pi + 40 ul) til p H og N, hhv. Den nuance af grå angiver det faldende antal parasitter per brønd. Typisk enkelte kloner fundet i rækker DF og JL.

* Nigericin kan ikke anvendes i berigeling skærmen som parasitter overlever ikke Nigericinet stimulation; kun bruge Nigericinet i validering af udgangs-mutanter.

Tabel 1. Udgangs-induktorer anvendes til forsøg. Fortynd i 10 ml HBBSc indeholdende 25 mg / ml DS til skærmen, eller ingen DS til mutant validering (egress assay). Alle forbindelser fra Sigma-Aldrich.

Den beskrevne protokol giver en effektiv metode til at isolere Toxoplasma mutanter med en udgang defekt. Vi har med held isoleret mutanter langs forskellige trin udgangsventilen pathway, hvoraf nogle har en dobbelt invasion fænotype ^13. Potentielle virkninger på invasion kan bestemmes ved hjælp af den såkaldte rød-grønne analyse, som adskiller invaderede fra ikke-invaderet parasitter ved forskellen antistoffarvning ^23,24. For både invasion og afstigning assays kan det være bekvemt at udtrykke en autofluorescerende proteinmarkør i cytoplasmaet af parasitterne ^13,22. Imidlertid, hvis de parasitter, der mutageniseret allerede udtrykker et fluorescerende protein dette kunne interferere med yderligere fænotypisk karakterisering ved hjælp af immunfluorescens senere. Det er altid muligt at tilsætte en fluorescerende markør til en mutant efter isolation. Som beskrevet en simpel, ikke-fluorescerende alternativ er Diff-Quick-farvning for udgang.

Skønt en bred vifte af udgangs inducere udløser forskellige aspekter af signalvejen er beskrevet i tabel 1, er der andre farmakologiske midler, der vides at virke på processer, der kræves til udgang. For eksempel har koffein blevet vist at inducere microneme sekretion i ekstracellulære parasitter, som kræves for bådeudgang og invasion ^7,26,27. Imidlertid kan koffein ikke bruges til at udløse udgang fra inficerede værtsceller, sandsynligvis fordi koffein ikke effektivt diffunderer gennem værtscellen mod parasitter, der er bosiddende i en vakuolær rum. Tilsvarende er en udgang trigger er en ophobning af abscisinsyre, men det er umuligt at screene for mutanter i denne pathway, idet abscisinsyre ikke diffundere ind i værtscellen ^28. Og som angivet i tabel 1, K +-ionophor nigericin er en effektiv udgang inducer ^5, imidlertid har parasitter ikke overleve nigericin stimulering. Derfor er denne forbindelse er heller ikke egnet til skærmen. I en alternativ, mere omfattende screening procedure for ionofor mutanter blev det rapporteret, at mange mutanter med en forsinkelse i ionofor induceret udgang overleve langvarig ekstracellulære udsættelse for ionofor ^11. Der blev imidlertid ikke udgangs-mutanter er resistente over for ionophor induceret udgang isoleret i denne skærm, hvilket gør fænotypersvagere. Det er på nuværende ikke klart, om mutanterne med resistens over for langvarig udsættelse for andre udgangs inducere kan opnås.

Da der synes at være flere parallelle veje der kan føre til udgang, opstår spørgsmålet om, hvilken en ville være den mest relevante i en (eksperimentel) infektion. Det ser ud til, at immunsystemet angriber på den inficerede celle er den vigtigste udløsende faktor for udgang ^29. Det er muligt at anvende sådanne udløser i mutanten skærmen. For eksempel kan CD8 T-celler stimulerer udgang gennem både en Fas-medieret og perforin-medieret vej ^30. Derfor, ved at anvende en FasL udtrykker humane T-celler som en værtscelle i udgangsventilen skærmen kan udgang udløses ved inkubation med et anti-Fas-antistof for at berige for mutanter i denne pathway.

Genetisk kortlægning af mutationer ligger udgangsventilen fænotyper, to forskellige fremgangsmåder er tilgængelige i Toxoplasma. Modsætning genetiske modelorganismer, alleelic adskillelse ved krydsning er ikke en mulighed, idet den seksuelle cyklus af parasitten kun kan udløses i tarmen hos katte. Bortset fra upraktisk og dårlig effektivitet af denne proces, parasit-stammer dyrket i laboratoriet meget hurtigt mister evnen til at inficere katte. For at omgå dette problem en effektiv vildtype kosmidbibliotek komplementering fremgangsmåde er blevet udviklet, som suppleret 90% af celledeling mutanter ^18. Derudover for nylig vi etableret komplette genom resekventering protokoller til at identificere alle mutationer induceres i genomet (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript indsendt). Typisk vi identificerer 20-70 enkelt nukleotid polymorfier i kemisk inducerede mutanter. Mellem disse to tilgange har vi været i stand til at identificere den sygdomsfremkaldende mutation i alle kemisk inducerede mutanter karakteriseret til dato.

Tilsammen den beskrevne skærmen giver et alsidigt værktøj, der vil give videre genetiske dissektion afudgangsventilen veje. Vi forventer, at dette vil identificere flere komponenter i signalvejen kendt for at eksistere baseret på farmakologiske data, men hvor der ikke gode kandidatgener kunne identificeres i Toxoplasma genomet.