Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

Vue d'ensemble

Les protocoles sont fournis à d'abord définir le dosage de l'agent mutagène menant à un meurtre de 70% des parasites (protocole 1). La procédure suivante est prévue pour enrichir les mutants induits évacuation d'un bassin mutagénisé parasite (protocole n ° 2, figure 2). Cette opération est suivie par un protocole pour tester l'incidence de mutants d'évacuation dans la piscine enrichi, ou pour valider le phénotype de sortie dans des mutants individuels (protocole 3). Enfin, un protocole est prévu pour générer des clones de parasites unique à partir de populations enrichies en limitant la dilution (protocole 4).

1. Le titrage de mutagène

Utilisez une prudence particulière, tels que des gants doubles, lorsque l'on travaille avec des composés hautement mutagènes et liquides. Collecter les déchets liquides séparément pour une élimination appropriée.

1. Inoculer T25 flacons de culture tissulaire avec l'homme confluentes de fibroblastes de prépuce (HFF), les cellules avec 1 ml de tachyzoïtes fraîchement lysées et la croissance 18-25 heures à 37 °; C sous 5% de CO ₂ dans Ed1 moyennes (D-MEM supplémenté avec 1% inactivé par la chaleur du sérum de veau foetal, 0,2 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline, 50 pg / ml de streptomycine, et 0,25 pg / ml d'amphotéricine B ). Voir Roos et al. pour la croissance et les médias de cellules HFF et les parasites ^21.
2. Remplacer milieu avec 10 ml de 0,1% à moyen Sérum fœtal bovin (dilué 1:10 dans Ed1 D-MEM) et laisser dans humidifié 37 ° C sous incubateur 5% de CO ₂ (appelé "37 ° C incubateur» à partir d'ici) pendant 10 min .
3. Ajouter 0, 12,5, 25, 50, ou 100 ENU ul (1 Stock M dans le DMSO) ou EMS (1 Stock M dans le DMSO) par flacon (dilutions mutagènes de travail sera de 1,25, 2,5, 5, et 10 mM, respectivement). Ajouter DMSO à 100 pi pour chaque flacon. Incuber pendant 4 heures dans un incubateur à 37 ° C.
4. Laver trois fois pendant 10 secondes à température ambiante par rinçage de la monocouche avec 10 ml de PBS froid (pré-refroidi à 4 ° C).
5. Ajouter 5 ml de PBS, gratter la monocouche lâche avec une spatule en caoutchouc (cellulaire scraper), passer les cellules grattées à travers une aiguille de 26,5 g pour éliminer physiquement le parasite à partir des fibroblastes (couper l'arbre à l'extérieur de l'aiguille avec des ciseaux lourds à ne pas exposer l'aiguille), et le filtre de 3,0 um filtre en polycarbonate. Passages d'aiguilles multiples augmentera l'efficacité de la libération des parasites de la cellule hôte.
6. Comptez la concentration des parasites à l'aide d'un hémocytomètre. Laissez les parasites se contenter de 5 min dans le hemocytomer avant le comptage.
7. Diluer les parasites à 10.000 parasites par 3 ml dans Ed1 (pour 10 ml 33.333 parasites sont nécessaires).
8. Inoculer un puits dans une plaque à 6 puits avec 3 ml des parasites dilué (contenant 10.000 parasites). Série diluer les parasites de 10 fois plus de 3 puits dans un affluent plaque à 6 puits avec des cellules HFF contenant 2,7 ml Ed1 en transférant 300 pi sur le premier puits. Laisser les plaques vierges dans l'incubateur à 37 ° C pendant 7 jours.
9. Aspirer à moyen, fixer 15 min avec 3 ml / puits d'éthanol à 100%, de la teintureavec 3 ml / puits solution de cristal violet (12,5 g de violet cristallisé dans 125 ml d'éthanol mélangé avec 500 ml d'oxalate d'ammonium à 1%) pendant 15 min, rincer avec de 3 ml / puits de PBS (1 minute) et l'air sec. Tout à la température ambiante.
10. Comptez plaques et sélectionnez la concentration du mutagène nécessaire pour atteindre la survie de 30% des parasites exposés (70% tuant dosage: voir figure 1). Une dose de meurtre 70% a été utilisé historiquement ¹⁴ et induit moins de 100 mutations ponctuelles par génome (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrit soumis).

2. Enrichissement de mutants d'évacuation (Figure 2)

1. Effectuer mutagenèse comme décrit ci-dessus en utilisant une dose mutagène induire meurtre de 70%. Grow up de la population mutagénisé pour un passage dans un nouveau flacon de cellules hôtes.
2. Infecter un T25, HFF flacon confluent de culture tissulaire avec 120.000 parasites fraîchement lysées à partir d'une population mutagénisé dans 10 ml Ed1. Incuber pendant 2 heures dans un incubateur à 35 ° C sous 5% de CO2 et humidifié (à partir de maintenant appelé «incubateur à 35 ° C").
3. Aspirer à moyen et rincer 10 secondes avec 10 ml de PBS froid, puis ajouter 10 ml Ed1 milieu supplémenté avec 25 mg / ml de sulfate de dextrane (DS) ^13. Incuber pendant 26 heures dans un incubateur à 40 ° C sous 5% de CO ₂ et humidifié (à partir de maintenant appelé «incubateur à 40 ° C").
4. Préparer la solution de travail d'exhausteurs de sortie. Diluer l'inducteur de sortie de choix à la concentration de travail dans un tube Falcon de 15 ml contenant 10 ml HBSSc complété avec 25 mg / ml DS. Préchauffer les dilutions pendant 30 min dans un bain-marie à 37 ° C. Voir le tableau 1 pour les concentrations de travail.
5. Aspirer milieu à partir des flacons parasités et ajouter préchauffé solution inducteur de sortie. Incuber dans l'incubateur à 37 ° C pendant les temps indiqués dans le tableau 1.
6. Aspirer à moyen et rincer 10 secondes avec 10 ml de PBS froid, puis ajouter 10 ml Ed1 additionné de 25 mg / ml et 50 uM DS pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC: add 5 pi de 100 mM dans du PBS PDTC Stock) ^13. Incuber 5 heures dans un incubateur à 35 ° C.
7. Aspirer à moyen et rincer 10 secondes une fois avec 10 ml de PBS (température ambiante), puis ajouter 10 ml Ed1 moyennes. Mettez flacons de retour dans l'incubateur à 35 ° C jusqu'à ce que les parasites de détruire la monocouche: flacons agités par jour. Cette reprise prend environ 7 jours.

3. La validation des phénotypes mutants par des essais d'évacuation

Après avoir effectué l'écran d'enrichissement et de plus en plus la population enrichie pour un passage dans les cellules HFF, les phénotypes doivent être confirmés par un dosage ^11,13 évacuation. Ce test devrait également être utilisée pour valider des clones individuels après le protocole 4.

1. Inoculer 20.000 parasites par puits dans une plaque de 24 puits contenant des cellules HFF cultivées sur des lamelles confluentes (1 ml Ed1 milieu par puits). Incuber 8 heures dans un incubateur à 35 ° C, puis transférer dans un incubateur à 40 ° C pendant 24 heures.
2. Laver avec 1 ml / puits de PBS (10 secondes à la température ambiante). Ajouter 1 ml d'évacuation des inducteurs (inclure une DMSO ne contrôle négatif), les pré-chauffées et dilué dans HBSSc et les incuber pendant les périodes décrites dans le tableau 1.
3. Aspirer à moyen et à fixer avec 1 ml / puits du méthanol à 100% pendant 15 min à température ambiante.
4. Si les parasites mères exprimant une protéine autofluorescente ont été utilisés pour la mutagenèse, passez à l'étape # 3.5 ^13. Si les parasites protéines fluorescentes non-exprimant ont été utilisés comme ligne de parent, de la teinture des lamelles fixes avec Diff-Quick tache pendant 1 min à ¹¹ température ambiante.
5. Laver 5 min avec 1 ml / puits de PBS dans la plaque de 24 puits à température ambiante.
6. Pour les parasites protéines fluorescentes exprimant: rincer rapidement la lamelle dans le trou DDH ₂ O (trempage) et monter sur des lames sous gelmount pour protéger le signal de fluorescence. Pour Diff-Quick parasites colorés, se laver de 10 secondes dans l'éthanol à 100% et laissez sécher à l'air avant de monter sur la diapositive.
7. Utilisation d'un microscope à fluorescence () avec un40-60x objectif de compter le pourcentage de vacuoles évacué par rapport aux vacuoles qui sont restés intracellulaire (voir Figure 4).

4. Cloner mutants d'évacuation en limitant la dilution

Après validation du phénotype de la population de sortie en utilisant le protocole enrichi mutante 3, la population polyclonaux doit être cloné pour obtenir des clones uniques parasites.

1. Dénombrement de la population du parasite dans un hémocytomètre et diluer à une concentration de 500 parasites par ml dans Ed1 moyennes.
2. Dans une plaque de 384 puits contenant une monocouche confluente de cellules HFF, remplacer le milieu avec 40 ul / puits de Ed1 milieu à l'aide d'une pipette multi-canaux. Comme le montre la Figure 5, quatre populations polyclonales peuvent être clonées par plaque comme suit: pipette 40 ul / puits de dilution mutant 1 dans les puits C3-C12, un mutant 2 dans les puits C13-C22, un mutant 3 dans des puits H3-H12, et mutant 4 dans les puits H13-H22 (volume final dans les puits est désormais de 80 pi). L'utilisation d'un multi-canal pipette, pipette le solution de haut en bas 5 fois, puis de transférer 40 ul à la ligne en dessous de la ligne de départ (à partir de la ligne C à D ou de la ligne H à I). Continuer ces dilutions de 2 fois en série dans le rang G (mutants 1 et 2) ou de la ligne N (mutants 3 et 4). Jeter le supplément de 40 ul de la dernière rangée. Incuber dans un incubateur à 35 ° C pendant 7-10 jours sans perturber la plaque.
3. Vérifier les puits sur un microscope inversé avec un objectif 10-20x pour la présence de plaques uniques, visible en tant que des trous 'dans la monocouche.
4. Pick 4 puits par mutant avec une seule plaque et transférer les parasites dans un flacon de culture de tissu confluente avec des cellules HFF et rempli de Ed1 moyennes. Grow les parasites dans un incubateur à 35 ° C; secouer les flacons par jour pour disperser les parasites extracellulaires. Cela prend habituellement de 7 jours.

5. Les résultats représentatifs

Le ENU mutagènes et EMS ne sont pas stables lorsqu'ils sont conservés sur de longues périodes de temps. Par conséquent, tester le pouvoir mutagène dedes stocks est cruciale pour obtenir des résultats reproductibles. Les résultats de titrage typiques et tuant des courbes à la fois pour ENU et les EMS sont présentés dans la figure 1. Cependant, il est recommandé d'effectuer des essais de plaque pour chaque expérience de mutagenèse afin de s'assurer que la dose appropriée a été utilisée. Pour maintenir la diversité dans la population parasite mutagénisé, il est important de procéder à l'écran de sortie mutant le plus rapidement possible. En règle générale, un passage des parasites dans un nouveau flacon est effectué pour laisser les parasites survivants de récupérer avant d'aller de l'avant avec l'écran. Il faut garder à l'esprit que, ce faisant cela se traduira dans la division des mutants. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que plusieurs mutants isolés clonales après avoir terminé toute la procédure contiennent exactement le même génotype. Pour éviter d'isoler les mutants mêmes plusieurs fois, il est recommandé d'isoler seulement un mutant de sortie unique par mutagenèse, à moins que leurs phénotypes (par exemple les différentes sensibilités d'évacuation inducteurs) sonttrès différente de l'autre. D'autre part, ne sont pas tous les résultats du dépistage dans l'isolement de mutants avec le phénotype souhaité. En particulier, le Ca ^{2 +-ionophore} A23187 phénotype de résistance est rare et exige de multiples expériences de mutagenèse et les écrans d'isoler un mutant de sortie unique. Par conséquent, il est recommandé d'effectuer une mutagenèse 5-10 et expériences d'écran en parallèle.

La puissance d'enrichissement de l'écran a été testé par le mélange d'un mutant de sortie connue avec des parasites de type sauvage à des taux différents. Ces mélanges ont été soumis à l'écran et l'incidence du phénotype mutant dans la population enrichi a été évaluée. En utilisant des parasites de type sauvage exprimant cytoplasmique DP et une ligne mutante exprimant YFP cytoplasmique des incidences pourraient être rapidement mis en place par cytométrie en flux (Figure 3) ^13. Les résultats montrent que les phénotypes mutants peuvent être régulièrement enrichi à 80% de pureté en commençant par 1 parasite mutant de sortie pour 10.000 sauvage de type parasites ^13. Toutefois, lorsque la sortie mutant: de type sauvage rapport de démarrage parasite est 1:100,000 parasites, la population isolée est seulement 1-2% des mutants de sortie (1:100). Par conséquent, le pouvoir d'enrichissement de l'écran est de 1000 fois. Depuis l'écran commence par l'inoculation de 120.000 parasites, dont 70% sont généralement viable, nous avons généralement effectuer deux tours de l'enrichissement. Les parasites isolés ont grandi entre les deux tours d'enrichissement. Cette procédure aboutit à une population de 100% mutant, même si à partir de 1:1,000,000 évacuation mutantes: les parasites de type sauvage.

Le dosage de sortie pour valider et caractériser les phénotypes nécessite une multiplicité d'infection cellule hôte qui permet la différenciation de vacuoles individuels. Cela est particulièrement important lors de l'analyse des conditions avec des pourcentages élevés d'évacuation que les parasites individuels sont dispersés autour. Comme le montre la figure 4, si les populations ne sont pas sortis de l'avion bien séparés, il est facile de sous-estimer le pourcentaged'évacuation en comptant deux vacuoles évacué comme un vacuole. Depuis l'évacuation et l'invasion sont des processus connexes, ainsi que certains phénotypes sensibles à la température présentent un phénotype légère à la plus basse température, tous les mutants auront l'efficacité d'invasion similaires. De tels mutants doivent donc être inoculée à plusieurs plis des dosages plus élevés pour obtenir une densité suffisamment élevée pour vacuole une évaluation précise de leur phénotype de sortie. En outre, certains inducteurs d'évacuation ne sont pas stimuler efficacement la sortie de vacuoles contenant quatre parasites ou moins. En tant que tel, il est important que les vacuoles contiennent huit parasites ou plus lors du démarrage du test de sortie. Dans notre laboratoire, nous mutants écran isolé avec un amplificateur de sortie particulier contre les exhausteurs d'évacuation d'autres. En dressant le profil de leur réactivité croisée des mutants peuvent être regroupés dans des classes différentes. Enfin, tous les mutants d'évacuation sera sensible à la température. Chez les mutants isolés particuliers avec des inducteurs d'évacuation de déclenchement des mesures avant la sortie de intracellular de Ca ^{2 +} sont susceptibles de ne pas la température phénotypes sensibles. Cela est dû à des voies parallèles qui peuvent conduire à sortir de l'avion avant que le signal converge sur la libération de Ca ^{2 +} intracellulaire.

Figure 1. Titration chimique mutagène dosage. Dosages Plaque A. effectué dans une plaque à 6 puits à l'aide de diverses concentrations EMS et les numéros de divers parasites par puits comme indiqué. Les taches blanches sont des plaques de parasites formés dans la monocouche HFF. B, C. Les courbes de survie des parasites lors de l'exposition à des doses différentes de SME (B) et ENU (C). La survie a été évaluée par des tests de plaque. Une dose induisant meurtre de 70% est choisi pour des expériences de mutagenèse. Moyennes de trois expériences indépendantes + / - écart-type sont indiqués.

et al. ^13.

Figure 3. L'enrichissement typique d'évacuation phénotypes mutants. Résultats d'enrichissement d'un mutant de sortie mélangé à des parasites de type sauvage à des taux différents (axe X). Le pourcentage de phénotypes mutants d'évacuation de la population grandi après l'écran est représentée sur l'axe des y et a été évaluée par cytométrie de flux (évacuation des parasites mutants exprimé YFP cytoplasmique, les parasites de type sauvage a exprimé cytoplasmic DP). Les résultats de trois expériences indépendantes sont représentées par des points de données en rouge, bleu et vert. Adoptée à partir Eidell et al. ^13.

Figure 4. Les résultats typiques d'un essai de sortie. A Flèches marquer quatre différentes vacuoles intactes contenant des parasites 4-8. B. Les flèches marquent quatre groupes de parasites épars reflétant quatre indépendants vacuoles évacué. L'évacuation a été induite par A23187 (B) ou le DMSO comme un contrôle négatif (A). Parasites exprimer cytoplasmique YFP ^22.

Figure 5. Dilution en série pour les lignes parasites clonales. Quatre populations polyclonales (rouge, bleu, jaune, vert) sont dilués en série dans un affluent plaque de 384 puits unique avec des cellules HFF. Rangée C et je reçois 10 parasites par puits etsont 2 fois plus dilué (40 pl + 40 pl) jusqu'à ce que les lignes H et N, respectivement. La nuance de gris indique la diminution du nombre de parasites par puits. En règle générale, les clones isolés et se trouvent dans les lignes DF et JL.

* Nigéricine ne peut pas être utilisé dans la enrichirment l'écran que les parasites ne survivent pas à la stimulation nigéricine; utiliser uniquement nigéricine à la validation des mutants de sortie.

Tableau 1 inducteurs Egress. Utilisés dans des procédures. Diluer dans 10 ml contenant HBBSc 25 mg / ml pour DS l'écran, ou aucun DS pour la validation mutant (test de sortie). Tous les composés de Sigma-Aldrich.

Le protocole décrit fournit une méthode efficace pour isoler des mutants de Toxoplasma avec un défaut de sortie. Nous avons réussi à isoler des mutants ainsi que différentes étapes de la voie de sortie, dont certains ont un phénotype invasion double ^13. Les effets potentiels sur l'invasion peut être déterminé en utilisant la soi-disant test rouge-vert, ce qui différencie envahi de non-envahis par des parasites coloration des anticorps différentiel ^23,24. Pour les tests d'invasion et de sortie des deux il pourrait être pratique pour exprimer une protéine marqueur autofluorescente dans le cytoplasme des parasites ^13,22. Toutefois, si les parasites étant mutagénisé déjà exprimer une protéine fluorescente cela pourrait interférer avec la caractérisation phénotypique supplémentaires par immunofluorescence plus tard. Il est toujours possible d'ajouter un marqueur fluorescent à un mutant après son isolement. Tel que décrit, un simple, non-fluorescente alternative est Diff-Quick coloration pour la sortie.

Bien qu'une grande variété d'inducteurs d'évacuation de déclenchement différents aspects de la voie de signalisation sont décrites dans le tableau 1, il existe d'autres agents pharmacologiques connus pour agir sur les processus nécessaires pour l'évacuation. Par exemple, la caféine a été montré à induire la sécrétion microneme en parasites extracellulaires, qui est nécessaire pour à la foisl'évacuation et l'invasion ^7,26,27. Toutefois, la caféine ne peut pas être utilisé pour déclencher l'évacuation à partir de cellules hôtes infectées, probablement parce que la caféine n'est pas efficace diffuse à travers la cellule hôte à l'égard des parasites qui résident dans un compartiment vacuolaire. De même, un déclencheur de sortie est l'accumulation de l'acide abscissique, mais il est impossible à l'écran pour les mutants de cette voie, car l'acide abscissique ne pas diffuser dans la cellule ²⁸ hôte. Et comme il est indiqué dans le tableau 1, le K +-ionophore nigéricine est un inducteur de sortie efficace ^5, toutefois, les parasites ne survivent pas à la stimulation nigéricine. Par conséquent, ce composé n'est pas non plus approprié pour l'écran. Dans une variante, la procédure de dépistage plus élaborée pour les mutants ionophores il a été signalé que de nombreux mutants avec un retard dans l'évacuation ionophore induit une exposition prolongée à survivre extracellulaire ionophore ^11. Cependant, aucun des mutants résistants à évacuation ionophore de sortie induite ont été isolés dans cet écran, ce qui rend les phénotypesplus faible. Il est à l'heure actuelle difficile de savoir si les mutants présentant une résistance à une exposition prolongée à des inducteurs d'évacuation d'autres peuvent être obtenus.

Depuis il semble y avoir plusieurs voies parallèles qui peuvent conduire à l'évacuation, la question se pose de savoir lequel serait le plus pertinent dans une infection (expérimentale). Il semble que les attaques du système immunitaire sur la cellule infectée sont le principal élément déclencheur de la sortie ^29. Il est possible d'utiliser ces déclencheurs dans l'écran de mutant. Par exemple, les cellules T CD8 peut stimuler l'évacuation par le biais à la fois un Fas-médiation et une voie perforine-médiation ^30. Par conséquent, en utilisant une expression de FasL humaine des cellules T en tant que cellule hôte dans l'écran de sortie, la sortie peut être déclenchée par une incubation avec un anticorps anti-Fas à enrichir de mutants dans cette voie.

Pour cartographier les mutations génétiquement sous-tendent les phénotypes de sortie, deux approches différentes sont disponibles dans le toxoplasme. Contrairement à des organismes modèles génétiques, tous lesla ségrégation elic par croisement n'est pas une option, car le cycle sexuel du parasite ne peut être déclenché dans l'intestin du chat. Mis à part l'impossibilité et l'efficacité des pauvres de ce processus, les souches de parasites cultivés en laboratoire très vite perdre la capacité d'infecter les chats. Pour contourner ce problème, une efficacité de type sauvage approche cosmide complémentation bibliothèque a été développée, qui a complété 90% de mutants de la division cellulaire ^18. En outre, nous avons récemment mis en place complète du génome reséquençage protocoles pour identifier toutes les mutations induites dans le génome (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrit soumis). Typiquement nous identifions 20-70 polymorphismes de nucléotides simples dans mutants chimiquement induites. Entre ces deux approches que nous avons été en mesure d'identifier la mutation responsable de tous les mutants chimiquement induites caractérisés à ce jour.

Pris dans leur ensemble, l'écran décrit fournit un outil polyvalent qui permettra la dissection génétique de l'avantles voies de sortie. Nous nous attendons à ce identifiera plusieurs composants de la voie de signalisation connue pour exister sur la base de données pharmacologiques, mais pour lesquels aucun gène de bons candidats ont pu être identifiés dans le génome de Toxoplasma.