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 JoVE Clinical and Translational Medicine

कोलेस्ट्रॉल तपका परख

, ,

Baker IDI Heart and Diabetes Institute

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Cite this Article: कोलेस्ट्रॉल तपका परख

Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (61), e3810, doi:10.3791/3810 (2012).

Protocol: कोलेस्ट्रॉल तपका परख

1. कोलेस्ट्रॉल [3 घंटे] की तैयारी

  1. धूआं हुड में, एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब (0.5 प्रति μCi (19 kBq) के एक ठेठ परख के लिए आवश्यक है) में 3 [एच] कोलेस्ट्रॉल के लिए आवश्यक राशि वितरित.
  2. यदि 3 [एच] कोलेस्ट्रॉल टोल्यूनि में निलंबित कर दिया है, यह पूरी तरह से नीचे सूखी N2 गैस और 100% इथेनॉल के साथ resuspend 1 μCi के अंतिम एकाग्रता (37 भंवर / kBq के μl. और मिश्रण अच्छी तरह से.

2. चढ़ाना कोशिकाओं और सेलुलर कोलेस्ट्रॉल लेबलिंग

मानव monocytes 4,5, THP-1 से मानव एककेंद्रकश्वेतकोशिका मैक्रोफेज 6,7,8, रॉ 264.7 murine मैक्रोफेज 5,9,10,11, HELA कोशिकाओं 12, मानव नाल की शिरा endothelial: इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार का उपयोग किया गया परीक्षण किया गया है कोशिकाओं (HUVEC), मकान 21 - 9 कोशिकाओं, प्लेटलेटों से मानव और चूहे 13,14 fibroblasts, HepG2 मानव hepatocarcinoma 15 कोशिकाओं और संशोधित रूप में, <16> समर्थन.

  1. कोशिकाओं Resuspend और उन्हें गिनती. 12 अच्छी तरह से प्लेट में 0.9 मिलीलीटर पूरी मध्यम में अच्छी तरह से प्रति 0.2x10 6 कोशिकाओं की अंतिम घनत्व पर थाली कोशिकाओं. कोशिकाओं से बढ़ जारी रखने और तपका प्रयोग के समय से अच्छी तरह से प्रति 0.8x10 6 कोशिकाओं तक पहुँच जाएगा. विभेदित THP 1 कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं है कि विभाजन नहीं है, के लिए, बोने घनत्व 0.8x10 6 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से होना चाहिए. यदि या 24 प्लेट अच्छी तरह से, डबल या आधा अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की संख्या क्रमशः - 6 का उपयोग. कुओं की संख्या प्रत्येक प्रायोगिक हालत के लिए चार प्रतियों निर्धारण के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
  2. यदि THP 1 - कोशिकाओं की भेदभाव की आवश्यकता है, 48-72 घंटे के लिए मीडिया के लिए PMA (अंतिम एकाग्रता 0.1 / μg एमएल).
  3. Microfuge 3 [एच] कोलेस्ट्रॉल युक्त ट्यूब में मीडिया के एक छोटे अशेष भाजक जोड़ें.
  4. [3 एच] जोड़ने पूरा मीडिया एक अलग अशेष भाजक (100 μl अच्छी तरह /) में कोलेस्ट्रॉल से पहले मीडिया के साथ ट्यूब के पक्ष धो लें.
    5. <ली> मीडिया कुओं कोशिकाओं (प्रति अंतिम मात्रा 1 मिलीग्राम है) के साथ [3 एच] कोलेस्ट्रॉल युक्त जोड़ें. यदि कक्षों की कोई इलाज लेबलिंग से पहले आवश्यक है, कोशिकाओं 3 [एच] कोलेस्ट्रॉल युक्त मध्यम में चढ़ाया जा सकता है.
  5. सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में 48 घंटे के लिए (37 ° सी, 5% सीओ 2) कोशिकाओं को सेते हैं.

3. संतुलन ऊष्मायन

  1. 48 घंटे ऊष्मायन के बाद, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें. वे स्वस्थ हैं और लगभग 80% संगम पर हैं सुनिश्चित करें.
  2. मीडिया 3 [एच] कोलेस्ट्रॉल युक्त निकालें. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से धो. 3 धोने बार दोहराएँ.
  3. सीरम मुक्त मीडिया तैयार है. सीरम मुक्त मीडिया, यदि आवश्यक हो, LXR agonist (1-4 mmol / एल में इस तरह के रूप में करने के लिए 901,317) या शिविर (केवल माउस मूल की कोशिकाओं के लिए 0.3 μMol / एल) जोड़कर कोशिकाओं को सक्रिय.
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μl सीरम मुक्त मीडिया जोड़ें.
  5. सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में 18 घंटे के लिए सेते हैं (37 ° सी, 5% सीओ 2).
<पी वर्ग = "jove_title" 4>. कोलेस्ट्रॉल तपका ऊष्मायन

  1. सीरम मुक्त मध्यम में 18 घंटे ऊष्मायन के बाद, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें. वे स्वस्थ और मिला हुआ हैं (कम से कम 80% confluency) सुनिश्चित करें.
  2. तैयार समाधान सीरम मुक्त मध्यम में कोलेस्ट्रॉल तपका स्वीकारकर्ताओं की. स्वीकारकर्ताओं के उदाहरण में शामिल हैं:
    अपोलीपोप्रोटीन (apoA मैं) ऐ (अंतिम 10 एकाग्रता / μg एमएल)
    उच्च घनत्व लेपोप्रोटीन (एचडीएल) (अंतिम 20 / एकाग्रता μg मिलीलीटर)
    Cyclodextrin (अंतिम एकाग्रता 200 / μg एमएल)
    प्लाज्मा (अंतिम एकाग्रता 1-2%)
  3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से धो.
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए स्वीकार करने के साथ सीरम मुक्त मीडिया की 250 μl जोड़ें.
  5. कुओं का एक सेट छोड़ दो तपका पृष्ठभूमि (सीरम स्वतंत्र मीडिया तपका सं स्वीकर्ता के साथ) निर्धारित
  6. कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में 2 घंटे के लिए सेते हैं. तपका ऊष्मायन की अवधि 30 मिनट से 8 घंटे के लिए अलग अलग यदि आवश्यक हो सकता है.

5. प्रसंस्करण साmples

  1. 2 घंटे के बाद ऊष्मायन खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच.
  2. 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में मीडिया ले लीजिए. 1-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 rpm पर स्पिन करने के लिए सेलुलर मलबे को हटा दें.
  3. 7 मिलीग्राम जगमगाहट शीशी में 100 μl मीडिया स्थानांतरण. 5 इंस्टा जेल प्लस ला (PerkinElmer) और भंवर मिश्रण जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष नमूने स्टोर
  4. 30 मिनट के लिए फ्रीज़र में प्लेटें प्लेस. प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μl DH 2 हे. खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं कुओं के नीचे से उठाया है. यदि अभी भी पक्षपाती, या तो DH ओ 2 से 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात या परिमार्जन कुओं पर प्लेटों छोड़.
  5. एक बार सभी कोशिकाओं से उठाया है, विंदुक ऊपर और नीचे करने के लिए सेल clumps को तोड़ने. 7 मिलीग्राम जगमगाहट शीशियों में 100 μl स्थानांतरण. 5 इंस्टा जेल प्लस ला (PerkinElmer) और भंवर मिश्रण जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष प्लेट स्टोर
  6. पर जगमगाहट जगमगाहट काउंटर शीशियों रखें. [एच] 3 के लिए में गिनती करने के लिए काउंटर कॉन्फ़िगर करेंDPM इकाइयों.

6. परिणाम विश्लेषण

  1. कोलेस्ट्रॉल तपका की दर आमतौर पर कोलेस्ट्रॉल के अनुपात कोशिकाओं से स्वीकर्ता के लिए चले गए के रूप में व्यक्त किया है. निम्न सूत्र का उपयोग किया जाता है:

एक समीकरण

  1. विशिष्ट तपका स्वीकर्ता (रिक्त) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में तपका के बीच एक अंतर के रूप में गणना की है.

2 समीकरण

7. समयरेखा

चित्रा 1

8. प्रतिनिधि परिणाम

एक कोलेस्ट्रॉल तपका प्रयोग का एक परिणाम का एक उदाहरण छवि में दिखाया गया है. 1. इस प्रयोग में THP 1 मानव monocytes मैक्रोफेज और कोलेस्ट्रॉल तपका में अलग स्वीकारकर्ताओं के लिए भेदभाव किया गया थापरीक्षण किया गया. नहीं स्वीकारकर्ताओं ("रिक्त") के साथ मध्यम करने के लिए कोलेस्ट्रॉल तपका 0.79% था और इस मूल्य में एक गैर विशिष्ट तपका के रूप में माना गया था और अन्य मूल्यों से घटाया गया था. मानव apoA मैं (अंतिम 30 एकाग्रता / μg एमएल) के लिए कोलेस्ट्रॉल तपका 4.75% था. एक संदर्भ प्लाज्मा नमूना इस प्रयोग में शामिल किया गया था अंतर प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की निगरानी. एक संदर्भ नमूना प्रयोगों की एक बड़ी संख्या में डेटा को सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम परख दोहराना अगर परिवर्तनशीलता उच्च है समझदारी पाया. एक रोगी प्लाज्मा (अंतिम एकाग्रता 2%) पहले और बाद में मरीज को दवा के साथ इलाज किया गया था परीक्षण किया गया था. यह निष्कर्ष निकाला है कि इस मरीज को दवा में कोलेस्ट्रॉल तपका समर्थन करने के लिए प्लाज्मा की क्षमता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा.

तपका प्रयोग का एक परिणाम का एक और उदाहरण छवि में दिखाया गया है. 2. इस प्रयोग में रॉ 264.7 मैक्रोफेज सक्रिय हो गया है या नहीं रातोंरात LXR agonist में 901,317 के साथ ऊष्मायन (अंतिम एकाग्रता सक्रिय1 / μmol एल) और मानव प्लाज्मा का ही नमूना (2%) कोलेस्ट्रॉल तपका परीक्षण किया गया था. यह निष्कर्ष निकाला है कि एबीसी ट्रांसपोर्टरों के सेलुलर अभिव्यक्ति की LXR agonist के साथ सक्रियण कोशिकाओं की क्षमता बढ़ जाती है के कोशिकी स्वीकर्ता के लिए कोलेस्ट्रॉल जारी.

चित्रा 1
आकृति 1. THP-1 विभिन्न स्वीकारकर्ताओं कोशिकाओं से कोलेस्ट्रॉल तपका कोलेस्ट्रॉल तपका का प्रतिशत (यानी लेबल कोलेस्ट्रॉल के अनुपात कोशिकाओं से निर्दिष्ट स्वीकर्ता के लिए ले जाया गया). रिक्त मूल्यों के घटाव के बाद दिखाया गया है. ± चार प्रतियों निर्धारण के एसडी, * 0.05 <पी मतलब है.

चित्रा 2
चित्रा 2. कोलेस्ट्रॉल तपका का रॉ प्रतिशत 264.7 सक्रिय या मानव प्लाज्मा LXR agonist के साथ सक्रिय नहीं (यानी लेबल कोलेस्ट्रॉल के अनुपात से कोलेस्ट्रॉल तपका कोशिकाओं से ले जाया गयानिर्दिष्ट) स्वीकर्ता रिक्त मूल्यों के घटाव के बाद दिखाया गया है. ± चार प्रतियों निर्धारण के एसडी, * 0.001 <पी मतलब है.

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Discussion: कोलेस्ट्रॉल तपका परख

वर्णित विधि कोलेस्ट्रॉल तपका को मापने के लिए एक बाह्य कोलेस्ट्रॉल स्वीकर्ता कोशिकाओं से कोलेस्ट्रॉल के आंदोलन को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है. इस पद्धति को समझने में कई महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं.

लेबलिंग और संतुलन

वर्णित पद्धति में लेबल कोलेस्ट्रॉल सीरम युक्त सीरम के लिए जोड़ा जाता है. हालांकि विस्तार में जांच कभी नहीं, यह माना जाता है कि कोलेस्ट्रॉल सीरम लिपो प्रोटीन में शामिल किया है और वे कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है. लिपो प्रोटीन के लिए पर्याप्त समय लिया जा करने के लिए अनुमति देते हैं और लिपो प्रोटीन से कोलेस्ट्रॉल के लिए सेलुलर झिल्लियाँ के लिए स्थानांतरित करने के लिए यह महत्वपूर्ण है. आमतौर पर 24 घंटे लेबलिंग पर्याप्त है, लेकिन 48 घंटे के लिए लेबलिंग intracellular कोलेस्ट्रॉल के उच्च विशिष्ट गतिविधि प्राप्त होता है. यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि अगर [14] कोलेस्ट्रॉल सी [3 एच] कोलेस्ट्रॉल के बजाय प्रयोग किया जाता है (डबल लेबलिंग प्रयोगों में उदाहरण के लिए), विशिष्ट कार्यपूर्व की ivity बहुत कम है और पर्याप्त लेबल इरादा विशिष्ट गतिविधि को प्राप्त करने के लिए कोलेस्ट्रॉल जोड़ने सेल कोलेस्ट्रॉल सामग्री को बदलने और इस प्रकार परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि (i) कोई लेबल कोलेस्ट्रॉल या गैर विशेष रूप से कोशिका की सतह पर फंसे इस कोलेस्ट्रॉल के रूप में तेजी से गैर विशिष्ट हस्तांतरण के माध्यम से एक स्वीकर्ता द्वारा शामिल किया जाएगा लिपो प्रोटीन है, और (ii) लेबल कोलेस्ट्रॉल विभिन्न intracellular के बीच में equilibrated है पूल. हालांकि हमारे अनुभव में 24 घंटे सीरम मुक्त मध्यम में संतुलन ऊष्मायन इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, आमतौर पर 48 घंटे ऊष्मायन प्रयोग किया जाता है. कई प्रकार की कोशिकाओं 48 घंटे या यहाँ तक कि सीरम मुक्त मध्यम में 24 घंटे के लिए जीवित नहीं है. इस मामले में 0.1% BSA (फैटी एसिड अनिवार्य रूप से मुक्त) के विकल्प के रूप में कार्य कर सकते हैं. लेपोप्रोटीन समाप्त सीरम या विभिन्न सीरम बदलने की खुराक के एक अंतिम उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि लेपोप्रोटीन की कमी सीरम करता है और सीरम बदलने की खुराक पहचान सी हो सकता हैapolipoproteins ontain और है कि परिणाम को प्रभावित कर सकता है. दुर्भाग्य से अक्सर निर्माताओं की खुराक की संरचना को प्रकट नहीं करते.

तपका ऊष्मायन की अवधि

कोलेस्ट्रॉल तपका कोलेस्ट्रॉल की एक बाह्य और कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल की कमी स्वीकर्ता के लिए लोड करने के लिए होता है. दोनों कोशिकाओं और स्वीकर्ता की कोलेस्ट्रॉल सामग्री में परिवर्तन कोलेस्ट्रॉल तपका की दर और अन्य संपत्तियों को प्रभावित कर सकता है. इसके अलावा, यदि स्वीकर्ता कोलेस्ट्रॉल होता है (जैसे एचडीएल) है स्वीकर्ता से कोशिकाओं के लिए कदम है और यदि स्वीकर्ता में कोलेस्ट्रॉल की विशिष्ट गतिविधि महत्वपूर्ण हो जाता है, कि परिणामों की व्याख्या जटिल हो सकता है. इस प्रकार, यह सबसे अच्छा है के रूप में संभव के रूप में कम तपका ऊष्मायन रखना, लेकिन लेबल कोलेस्ट्रॉल के लिए पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं से स्वीकर्ता के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक विश्वसनीय पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए समय की अनुमति है. आम तौर पर 2-6 घंटे समय की सिफारिश की है. 24 घंटे से अधिक समय incubations equili के एक राज्य को प्रतिबिंबित करेगाbrium और इसलिए बल्कि कोलेस्ट्रॉल तपका की दर से कोलेस्ट्रॉल जमा स्वीकर्ता की क्षमता का संकेत होगा.

स्वीकर्ता

अलग स्वीकारकर्ताओं कोलेस्ट्रॉल तपका की अलग - अलग रास्ते के लिए विशिष्ट हैं. विशिष्ट कोलेस्ट्रॉल तपका को मापने के लिए, apoA मैं ABCA1 पर निर्भर तपका whilst के एचडीएल या लिए ABCG1 और SR-B1 पर निर्भर रास्ते पुनर्गठन एचडीएल को प्रतिबिंबित प्रयोग किया जाता है. Cyclodextrin अक्सर गैर विशिष्ट तपका का आकलन किया जाता है. यह प्रयोग एक "रिक्त" नमूना है, जो सब पर कोई स्वीकर्ता शामिल करने के लिए कोलेस्ट्रॉल और कोलेस्ट्रॉल मृत कोशिकाओं को बिखरने से जारी गैर विशिष्ट हदबंदी के योगदान को मापने में शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है.

स्वीकर्ता की एकाग्रता

कोलेस्ट्रॉल तपका कोशिकाओं द्वारा (मैं) कोलेस्ट्रॉल की रिहाई और (ii) एक स्वीकर्ता द्वारा अपने तेज भी शामिल है, दोनों कदम दर सीमित हो सकता है. यदि प्रायोगिक लक्ष्य में परिवर्तन की जांचकोशिकाओं की क्षमता कोलेस्ट्रॉल रिलीज (जैसे अभिकर्मक या तोड़े नीचे के बाद), तो स्वीकर्ता की एकाग्रता सीमित दर नहीं होना चाहिए. के लिए apoA मैं और एचडीएल की सांद्रता 30-50 μg / एमएल आमतौर पर धूम्रपान की दर को सीमित. यदि कोलेस्ट्रॉल तपका समर्थन करने के लिए स्वीकर्ता की क्षमता जांच का लक्ष्य (जैसे क्षमता पृथक एचडीएल या रोगियों या जानवरों से प्लाज्मा के नमूने कोलेस्ट्रॉल तपका समर्थन करने की) है, तो स्वीकर्ता की एकाग्रता दर सीमित होना चाहिए. के लिए apoA मैं और एचडीएल यह आमतौर पर 10 / μg एमएल है, प्लाज्मा नमूनों के लिए यह आमतौर पर 1-2% है, लेकिन एक प्रारंभिक खुराक निर्भरता प्रयोग के लिए एक सही एकाग्रता खोजने के लिए खुराक का चयन आवश्यक है.

कोशिकाओं की सक्रियता

कुंजी विशिष्ट कोलेस्ट्रॉल तपका के लिए जिम्मेदार तत्वों दो एबीसी ट्रांसपोर्टरों, ABCA1 और ABCG1 हैं. दोनों LXR और LXR agonist के साथ कोशिकाओं के पूर्व ऊष्मायन द्वारा विनियमित रहे हैं (सबसे लोकप्रिय परिसर से 901,317 हस्ताक्षर से उपलब्ध है) मा 1-4 सांद्रता में इस्तेमाल किया / μmol एल काफी विशिष्ट कोलेस्ट्रॉल तपका का अनुपात बढ़ जाती है. माउस मूल के 264.7 रॉ या J774 जैसे, कोशिकाओं, भी शिविर (0.3 mmol / एल) से सक्रिय किया जा सकता है.

कोलेस्ट्रॉल के साथ कोशिकाओं के लोड हो रहा है

उनके साथ acetylated या एलडीएल ऑक्सीकरण या cyclodextrin कोलेस्ट्रॉल जटिल पूर्व incubating के द्वारा कोलेस्ट्रॉल के साथ कोशिकाओं के लोड हो रहा है यह भी कोलेस्ट्रॉल तपका उत्तेजित करता है. यह ध्यान में रखा जा सकता है कि कोलेस्ट्रॉल अपनी चयापचय के कई पहलुओं में परिवर्तन के साथ कोशिकाओं, विशेष रूप से मैक्रोफेज लोड की जरूरत है. मॉडल के विकल्प (कोलेस्ट्रॉल लोड बनाम नहीं कोलेस्ट्रॉल लोड) के अध्ययन के वैज्ञानिक लक्ष्य पर निर्भर करता है.

परिणामों की प्रस्तुति

आमतौर पर कोलेस्ट्रॉल तपका प्रयोग के परिणाम कोशिकाओं से जारी कोलेस्ट्रॉल के एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं: यह अलग - अलग कुओं में और लेबलिंग की दक्षता में सेल नंबर से परिवर्तनशीलता समाप्त. हालांकि वें,केवल वैध है अगर उपचार कोलेस्ट्रॉल और स्वीकर्ता (रिक्त) की अनुपस्थिति में बहाव तेज प्रभावित नहीं किया. इन दो स्थितियों के लिए प्रयोगात्मक सिद्ध करने की आवश्यकता है.

सिद्धांततः इस विधि के लिए एक बाह्य स्वीकर्ता के लिए किसी भी सेलुलर निर्वाचन क्षेत्र के तपका अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि कोलेस्ट्रॉल के विपरीत, इस तरह के यौगिक metabolised है, तो एक विश्लेषणात्मक शुद्धि कदम को शामिल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, अगर यौगिक सेल में संश्लेषित है, सिंथेटिक व्यापारियों लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, [14 सी एच] एसीटेट और [3] पानी के लिए नव संश्लेषित कोलेस्ट्रॉल के तपका अध्ययन इस्तेमाल किया गया और [14 सी phospholipids के तपका के अध्ययन के लिए cholate. इस मामले में नव संश्लेषित कोलेस्ट्रॉल के व्यापारियों और मध्यवर्ती से अलग है, आमतौर पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा किया जाना चाहिए.

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Disclosures: कोलेस्ट्रॉल तपका परख

लेखक कोई परस्पर विरोधी हितों इस अध्ययन से संबंधित घोषणा.

Acknowledgements: कोलेस्ट्रॉल तपका परख

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) (526,615) और 545,906 से और भाग में विक्टोरियन सरकार OIS प्रोग्राम द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. डी एस NHMRC के एक साथी है.

References: कोलेस्ट्रॉल तपका परख

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