コレステロール流出アッセイ

1。 ^[3 H] -コレステロールの調製

1. ドラフトでは、1.5ミリリットル遠心チューブ（0.5ウェル当たりμCiの（19放射能）が典型的なアッセイのために必要とされる）に^[3 H]コレステロールの必要量を分注する。
2. ^[3 H] -コレステロールをトルエン中に懸濁されている場合は、同様に1μCi（37放射能/μL。ボルテックスし、ミックスの最終濃度の100％エタノールのN2ガスを再懸濁して完全にそれを乾燥させてください。

2。メッキ細胞およびラベリング細胞コレステロール

ヒト単球^4,5、THP-1ヒト単球-マクロファージ^6,7,8、RAW 264.7マウスマクロファージ^{5,9,10,11、HeLa}細胞^12、内皮細胞、ヒト臍帯静脈：このプロトコルは、次のセルタイプを使用してテストされています血小板由来の細胞（HUVEC）、BHK-21細胞^9、ヒトとマウスの線維芽細胞^{13,14、HepG2}細胞、ヒト肝癌細胞¹⁵と、修正された形で、<> 16のsup。

1. 細胞を再懸濁し、それらをカウントします。 0.9ミリリットルの完全培地でウェルあたり0.2x10 ^6個の細胞の最終濃度で12ウェルプレートに細胞をプレート。細胞が成長し続け、流出実験の時間帯によって、ウェルあたり0.8×10 ^6個の細胞に到達します。そのような分化したTHP-1細胞として分裂しない細胞については、播種密度は、ウェルあたり0.8×10 ^6個の細胞である必要があります。それぞれ、24ウェルプレート、ダブルまたはウェルあたりの細胞数の半分 - 6を使用している場合。井戸の数は、各実験条件のために四重決定のための十分なはずです。
2. THP-1細胞の分化が必要な場合は、48〜72時間のためにメディアにPMA（最終濃度0.1μg/ ml）を追加します。
3. ^[3 H]コレステロールを含むマイクロチューブにメディアの小アリコートを追加します。
4. 完全なメディアの別のアリコート（100μl/ウェル）に^[3 H] ^のコレステロールを添加する前にメディアでチューブの側面を洗ってください。
<LI>細胞（ウェルあたり最終容量が1 mlである）で各ウェルに^[3 H]コレステロールを含むメディアを追加します。細胞のない治療がラベリングの前に必要でない場合、細胞は^、[3 H]コレステロール含有培地に播種することができます。
5. 細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で48時間細胞をインキュベートします。

3。平衡インキュベーション

1. 48時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは健康であり、約80％コンフルエントであることを確認してください。
2. ^[3 H]コレステロールを含むメディアを削除します。 PBSで穏やかに細胞を洗浄します。 3洗浄回数を繰り返します。
3. 無血清培地を準備します。血清フリー培地に、必要な場合には、LXRアゴニスト（例えば、1から4 mmol / lの時TO-901317など）やcAMPを（唯一のマウス由来の細胞を0.3モル/ l）を添加することにより細胞を活性化する。
4. 各ウェルに500μlの無血清培地を追加します。
5. （37℃、5％CO _2）細胞培養インキュベーター中で18時間インキュベートする。

1. 無血清培地で18時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは（最低80％のコンフルエンシー）健康とコンフルエントであることを確認します。
2. 無血清培地中のコレステロール流出受容体の溶液を調製します。受容体の例は次のとおりです。
   アポリポタンパク質AI（アポA-I）（最終濃度10μg/ ml）を
   高密度リポタンパク質（HDL）（最終濃度20μg/ ml）を
   シクロデキストリン（最終濃度200μg/ ml）を
   血漿（最終濃度1-2％）
3. PBSで穏やかに細胞を洗浄します。
4. 各ウェルにアクセプターと無血清培地250μlを添加します。
5. 背景の流出を（NOアクセプターと無血清培地への流出）を決定するために井戸のセットを1つ残す
6. 細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で2時間細胞をインキュベートします。必要に応じて流出インキュベーションの持続時間は30分〜8時間と異なる場合があります。

5。処理土mples

1. 2時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞を確認してください。
2. 1.5mlマイクロチューブにメディアを収集します。細胞の残骸を削除するには、室温で1から10分間14,000 rpmでスピン。
3. 7mlのシンチレーションバイアルに100μlのメディアを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で、残りのサンプルを保存
4. 30分のために冷凍庫にプレートを置きます。各ウェルに500μlのdH ₂ Oを追加します。すべての細胞がウェルの底から持ち上げていることを確認し顕微鏡下で細胞を確認してください。まだ付着した場合、4℃で一晩またはこすっ井戸でdH ₂ Oでプレートを残してどちらか。
5. すべてのセルがリフトオフした後、細胞塊を分割するために上下にピペッティングします。 7mlのシンチレーションバイアルに100μLを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で残りのプレートを保存
6. シンチレーションカウンターでシンチレーションバイアルを置きます。 ^[3 H]のカウントでカウンタの構成DPMユニット。

6。結果を分析する

1. コレステロール流出の速度は通常アクセプターへの細胞から移動したコレステロールの割合として表されます。次の式が使用されます。

2. 特定の流出は、受容体の存在下または非存在下（ブランク）の流出の差として計算されます。

7。タイムライン

8。代表的な結果

コレステロール流出実験の結果の例を図に示されています。 1。この実験では、THP-1ヒト単球があった別の受容体にマクロファージやコレステロール流出に分化したテストされています。ないアクセプター（ "空白"）と媒体へのコレステロール流出は0.79％であり、この値は、非特定の流出とみなされ、他の値から差し引いた。人間のアポA-I（終濃度30μg/ mlの）へのコレステロール流出は4.75％であった。リファレンス·血漿サンプルは、間実験の変動を監視するには、この実験に含まれていました。参照サンプルは、実験の多数間でのデータの正規化に使用されるが、我々はばらつきが大きい場合、検定を繰り返すことが賢明見つけることができます。患者は薬で治療した前と後の患者の血漿（最終濃度2％）がテストされています。それはこの患者の薬のコレステロール流出をサポートするために、プラズマの能力にマイナスの影響を与えたと結論された。

流出実験の結果の別の例を図に示されています。 2。この実験ではRAW 264.7マクロファージはLXRアゴニストTO-901317で一晩インキュベートした（最終濃度によって活性化または活性化されていない1μmol/ Lの）およびヒト血漿の同じサンプル（2％）へのコレステロール流出を試験した。これは、LXRアゴニストとABCトランスポーターの細胞内発現の活性化が細胞外受容体にコレステロールを解放するためにセルの容量を増加させると結論された。

図1。様々なアクセプターへのTHP-1細胞からのコレステロール流出。コレステロール流出の割合は、（すなわち、標識されたコレステロールの割合は、細胞から指定されたアクセプターに移動）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P <0.05。

図2。コレステロール流出のRAW 264.7ヒト血漿にLXRアゴニストにより活性化または有効になっていません。割合（すなわち、標識コレステロールの割合からのコレステロール流出は細胞からに移動指定されたアクセプター）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P <0.001。

コレステロール流出を測定するために記載した方法は、細胞外コレステロール受容体への細胞からのコレステロールの動きを測定するために設計されています。この方法論を理解する上で、いくつかの重要な考慮事項があります。

ラベルと平衡

記載された方法論で標識されたコレステロールは血清含有血清に追加されます。詳細に調べなかったが、それはコレステロールは血清リポタンパク質に組み込まれ、それらが細胞に取り込まれることを想定しています。取り上げられるようにリポタンパク質およびコレステロールはリポタンパク質から細胞膜に移動するのに十分な時間を許可することが重要です。通常24時間標識は十分ですが、48時間のラベリングは、細胞内コレステロールの高い比活性を実現しています。それは^[14 C]コレステロールは^[3 H]コレステロール（二重標識実験などで）、特定の行為の代わりに使用されている場合ことを考慮する必要があります前者のivityは非常に低く、意図した特定の活動を達成するために十分な標識されたコレステロールを追加すると、細胞のコレステロール含量を変更して、結果に影響を与える可能性があります。それは、標識コレステロールまたはコレステロールは急速に非固有の転送を介して受容体に援用されるように非特異的に細胞表面上に捕捉されたリポタンパク質が存在しない（I）ことも重要であると、（ii）標識されたコレステロールは、様々な細胞の間で平衡化プール。我々の経験では無血清培地で24時間平衡のインキュベーションは、これらの目標を達成するの​​に十分であるが、通常48時間のインキュベーションが使用されます。多くの細胞型は、無血清培地であっても、48時間または24時間生存していません。このケースでは0.1％BSAは（本質的に脂肪酸フリー）の代替として機能することができます。血清または様々な血清代替サプリメントは最後の手段として使用することができますリポ枯渇が、それはリポタンパク質欠損血清を行い、血清代替サプリメントよい、Cを認識することが重要です。アポリポタンパク質をontain、それが結果に影響を及ぼす可能性があります。残念ながらメーカーはしばしばサプリメントの組成物を開示することはありません。

流出のインキュベーション期間

コレステロール流出は細胞内、細胞外受容体とコレステロールの枯渇へのコレステロールのロードにつながる。細胞や受容体の両方のコレステロール含有量の変化は、コレステロール流出の速度と他の特性に影響を及ぼす可能性があります。また、アクセプターは、コレステロールが含まれている場合（例えば、HDL）、それは細胞にアクセプターから移動することがあり、アクセプターのコレステロールの比活性が顕著になる場合、その結果の解釈が複雑になります。したがって、標識されたコレステロールのに十分な量のためにしかし時間が信頼性の高い検出を有効にするには、細胞からアクセプターに移動​​することができ、可能な限り短く流出インキュベーションを維持する最善の方法です。一般的に2から6時間は、推奨される時間です。 24時間より長いインキュベーションはequiliの状態を反映するbriumそのためではなくコレステロール流出の速度よりもコレステロールを蓄積する受容体の能力の指標となります。

アクセプター

別の受容体は、コレステロール流出の異なる経路に特異的である。特定のコレステロール流出を測定する場合には、アポA-IはABCA1依存排出しながら、HDLまたはABCG1とSR-B1-依存性の経路の再構成HDLを反映するために使用されています。シクロデキストリンは、しばしば非特異的流出を評価するために使用されています。実験で死んだ細胞を崩壊から放出されるコレステロールとコレステロールの非特異的解離の寄与を測定するために、全くアクセプターが含まれていません "空白"のサンプルを含めることが重要である。

受容体の濃度

コレステロールの流出は、（i）細胞によるコレ​​ステロールの放出と受容体によって（ii）その取り込みが含まれており、両方の手順では、レート制限することができます。実験的な目標は、変化を調査する場合（例えば、トランスフェクション後、またはノックダウン）コレステロールを放出する細胞の能力は、その受容体の濃度は、レート制限ではありません。アポA-IおよびHDL用に30から50μg/ mlの濃度は、通常、レート制限はないです。コレステロール流出をサポートするためのアクセプターの容量は、調査の目的（例えば、コレステロールの排出をサポートするために、患者や動物から分離されたHDLまたは血漿サンプルの容量）である場合は、アクセプターの濃度が律速である必要があります。アポA-IおよびHDLは、これは、通常10μg/ mlで血漿サンプルの場合、これは通常1-2％ですが、正しい濃度を見つけるための予備的な用量依存性の実験では、用量を選択することが重要である。

細胞の活性化

特定のコレステロール流出の責任の重要な要素は、2つのABCトランスポーター、ABCA1とABCG1があります。両方がLXRとLXRアゴニストによる細胞のプレインキュベーションによって規制されている（最も人気のある化合物がSIGからTO-901317利用可能です濃度が1から4モル/ Lで使用されるMA）は大幅に特定のコレステロール流出の割合を増加させます。そのようなRAW 264.7またはJ774としてマウス由来の細胞は、またcAMPの（0.3ミリモル/ L）によって活性化することができます。

コレステロールの細胞のローディング

それらのアセチル化またはLDL酸化またはシクロデキストリン-コレステロール複合体とプレインキュベートすることにより、コレステロールの細胞からロードすると、またコレステロール流出を刺激する。それはコレステロールの変化、代謝の多くの側面、特に細胞、マクロファージをロードすることに留意する必要があります。モデルの選択は（コレステロールがロードされて対コレステロールませロード）研究の科学的な目標に依存します。

結果のプレゼンテーション

通常、コレステロール流出実験の結果は、細胞から放出されるコレステロールの割合として表示されます：これは、個々のウェルに、ラベリング効率の細胞数からの変動を排除します。しかし、目治療は、アクセプター（ブランク）の非存在下でのコレステロールの取り込みと排出に影響を与えなかった場合にのみ有効です。これらの二つの条件は、実験的に実証されている必要があります。

理論的にはこの方法は、細胞外受容体への細胞の構成員の流出を研究するために使用することができます。コレステロールとは異なり、そのような化合物が代謝され、場合は、分析の精製工程は含まれている必要があります。化合物は細胞内で合成されている場合は、さらに、合成前駆体は、標識に使用することができます。たとえば^、[14 C]酢酸および^[3 H]水は新たに合成されたコレステロールの流出を研究するために使用され、リン脂質の流出を研究するための^[14 C]コール酸。このケースでは、新しく合成されたコレステロールは、通常、薄層クロマトグラフィーによって、前駆体および中間体から分離する必要があります。