Efflusso test Colesterolo

1. Preparazione di ^[3 H]-colesterolo

1. Nella cappa, erogare la quantità di ^[3 H] colesterolo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml (0,5 pCi (19 kBq) per pozzetto è richiesto per un saggio tipico).
2. Se ^[3 H]-colesterolo viene sospeso in toluene, asciugare completamente con gas N2 e risospendere con etanolo al 100% ad una concentrazione finale di 1 microCi (37 kBq / pl. Vortex e mescolare bene.

2. Cellule placcatura e all'etichettatura dei prodotti colesterolo cellulare

Questo protocollo è stato testato con i seguenti tipi di cellule: monociti umani ^4,5 THP-1, i monociti-macrofagi umani ^6,7,8, RAW 264.7 macrofagi murini ^5,9,10,11, cellule HeLa ^12, vena ombelicale umano endoteliale cellule (HUVEC), cellule BHK-21 ^9, fibroblasti umani e mouse ^13,14, cellule di epatocarcinoma umano HepG2 ¹⁵ e, in forma modificata, da parte delle piastrine <sup> 16.

1. Risospendere le cellule e contarli. Cellule in piastre 12-pozzetti alla densità finale di 0.2x10 ⁶ cellule per pozzetto in 0,9 ml di mezzo completo. Le cellule continuerà a crescere e raggiungerà 0.8x10 ⁶ cellule per pozzetto dal tempo dell'esperimento efflusso. Per le celle che non dividono, come differenziati cellule THP-1, la densità di semina dovrebbe essere 0.8x10 ⁶ cellule per pozzetto. Se si utilizza 6 - o 24-pozzetti, doppio o metà del numero di cellule per pozzetto, rispettivamente. Il numero di pozzi dovrebbe essere sufficiente per le determinazioni quadruplicato per ogni condizione sperimentale.
2. Se la differenziazione di cellule THP-1 è richiesto, aggiungere PMA (concentrazione finale 0,1 mg / ml) ai mezzi per 48-72 h.
3. Aggiungere una piccola aliquota di supporto nella provetta da microcentrifuga contenente il ^[3 H] colesterolo.
4. Lavare lati del tubo di supporto prima di aggiungere ^[3 H] colesterolo separato in una aliquota di mezzi completi (100 pl / pozzetto).
<li> Aggiungi i supporti contenenti ^[3 H] colesterolo nei pozzetti con le cellule (volume finale per pozzetto è di 1 ml). Se nessun trattamento di cellule è necessario prima di etichettatura, le cellule possono essere placcato ^[3 H]-mezzo contenente colesterolo.
5. Incubare le cellule per 48 ore in incubatore per colture cellulare (37 ° C, 5% CO _2).

3. Equilibrazione incubazione

1. Dopo 48 ore di incubazione, controllare le cellule al microscopio. Assicurarsi che sono in buona salute e sono a circa l'80% di confluenza.
2. Rimuovere i supporti contenenti ^[3 H] colesterolo. Lavare delicatamente le cellule con PBS. Ripeti 3 volte lavaggio.
3. Preparare senza siero media. Se necessario, attivare le cellule aggiungendo agonista LXR (come TO-901317 a 1-4 mMol / L) o cAMP (0,3 mmol / L; per le cellule di origine solo il mouse) al siero free-media.
4. Aggiungere 500 microlitri di siero dei media liberi in ciascun pozzetto.
5. Incubare per 18 ore in incubatore per colture cellulari (37 ° C, 5% CO _2).

1. Dopo incubazione di 18 ore in terreno privo di siero, le cellule controllare sotto microscopio. Assicurarsi che siano sani e confluenti (minimo 80% di confluenza).
2. Preparare la soluzione di colesterolo accettori di efflusso in terreno privo di siero. Esempi di accettori comprendono:
   Apolipoproteina AI (apoA-I) (concentrazione finale 10 pg / ml)
   Lipoproteine ​​ad alta densità (HDL) (concentrazione finale 20 pg / ml)
   Ciclodestrina (concentrazione finale 200 pg / ml)
   Plasma (concentrazione finale 1-2%)
3. Lavare delicatamente le cellule con PBS.
4. Aggiungere 250 pl di siero mezzi privi con accettori a ciascun pozzetto.
5. Lascia una serie di pozzi per determinare gli efflusso (efflusso di siero mezzi di comunicazione liberi con NO accettore)
6. Incubare le cellule per 2 ore in incubatore per colture cellulari (37 ° C, 5% CO _2). Durata della incubazione efflusso possono variare da 30 minuti a 8 ore se necessario.

5. Elaborazione Samples

1. Dopo 2 ore di incubazione controllare le cellule al microscopio.
2. Raccogliere media in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Spin a 14.000 rpm per 1-10 min a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari.
3. Trasferire 100 pl supporti in 7 ml fiala di scintillazione. Aggiungere 5 ml di Insta-gel Plus (PerkinElmer) e la miscela di vortice. Conservare i campioni rimasti a 4 ° C.
4. Posizionare le piastre in freezer per 30 minuti. Aggiungere 500 ul dH ₂ O in ciascun pozzetto. Controllare cellule sotto microscopio a garantire che tutte le cellule hanno sollevato dal fondo dei pozzetti. Se ancora aderente, o lasciare le piastre con dH ₂ O a 4 ° C durante la notte pozzi o raschiare.
5. Una volta che tutte le cellule sono cominciate, pipettare su e giù per rompere grumi di cellule. Trasferire 100 pl in fiale di scintillazione 7 ml. Aggiungere 5 ml di Insta-gel Plus (PerkinElmer) e la miscela di vortice. Conservare le piastre rimangono a 4 ° C.
6. Posizionare fiale di scintillazione sul contatore a scintillazione. Configurare contatore di contare per ^[3 H] indpm di unità.

6. Analizzando i risultati

1. La velocità di efflusso di colesterolo è solitamente espresso in percentuale del colesterolo trasferito da cellule al accettore. La formula viene utilizzata la seguente:

2. L'efflusso specifico viene calcolato come differenza tra l'efflusso in presenza o assenza del accettore (vuoto).

7. Timeline

8. Risultati rappresentativi

Un esempio di un risultato di un esperimento efflusso colesterolo è mostrato in fig. 1. In questo esperimento THP-1 monociti umani sono state differenziate in macrofagi e di efflusso del colesterolo ad accettori diverse è statatestato. Efflusso colesterolo per mezzo senza accettori ("bianco") era 0,79% e questo valore è stato considerato come un non-specifica efflusso ed è stata sottratta da altri valori. Efflusso di colesterolo per la salute umana apoA-I (concentrazione finale 30 ug / ml) è stato 4,75%. Un campione di plasma di riferimento è stato incluso in questo esperimento di monitorare la variabilità inter-sperimentale. Un campione di riferimento può essere utilizzata per la normalizzazione dei dati attraverso un gran numero di esperimenti, ma abbiamo trovato prudente ripetere il dosaggio se la variabilità è elevata. Un plasma del paziente (concentrazione finale 2%) è stato testato prima e dopo la paziente è stata trattata con farmaci. Si è concluso che in questo farmaco paziente ha avuto un impatto negativo sulla capacità di plasma per supportare efflusso colesterolo.

Un altro esempio di un risultato dell'esperimento efflusso è mostrato in fig. 2. In questo esperimento i macrofagi RAW 264.7 sono stati attivati ​​o non attivata tramite incubazione per una notte con agonista LXR TO-901317 (concentrazione finale1 mmol / L) e colesterolo efflusso allo stesso campione di plasma umani (2%) è stato testato. Si è concluso che l'attivazione di espressione cellulare di trasportatori ABC con agonista LXR aumenta la capacità delle cellule di rilasciare il colesterolo per accettore extracellulare.

Figura 1. Efflusso colesterolo da cellule THP-1 ad accettori diverse. Percentuale di efflusso colesterolo (cioè la percentuale di colesterolo marcato spostato da cellule all'accettore specificato) è mostrato dopo sottrazione dei valori vuoti. Media ± SD di determinazioni quadruplicato, * p <0,05.

Figura 2. Efflusso di colesterolo da RAW 264,7 attivata o disattivata con agonista LXR al plasma umano. Percentuale di efflusso di colesterolo (cioè la percentuale di colesterolo marcato spostato da celle aaccettore specificato) viene mostrato dopo la sottrazione di valori vuoti. Media ± SD di determinazioni quadruplicato, * p <0,001.

Il metodo descritto per misurare il colesterolo efflusso è progettato per misurare il movimento del colesterolo da cellule ad un accettore colesterolo extracellulare. Ci sono diverse considerazioni critiche nella comprensione di questa metodologia.

Etichettatura ed equilibratura

Nella metodologia descritta colesterolo marcato viene aggiunto siero contenente siero. Sebbene non esaminati in dettaglio, si presume che il colesterolo è incorporato in lipoproteine ​​sieriche e sono assorbita dalle cellule. E 'importante disporre del tempo sufficiente per le lipoproteine ​​da prendere e per il colesterolo per spostarsi da lipoproteine ​​alle membrane cellulari. Di solito l'etichettatura 24 h è sufficiente, ma di etichettatura per 48 ore raggiunge una maggiore attività specifica del colesterolo intracellulare. Si deve tener conto che se ^[14 C] colesterolo viene usato al posto di ^[3 H] colesterolo (ad esempio in esperimenti di doppia marcatura), l'atto specificoivity della prima è molto bassa e aggiungendo colesterolo marcato sufficiente per raggiungere destinato attività specifica può cambiare colesterolo contenuto della cella e quindi influenzare il risultato. È anche importante che (i) non c'è colesterolo marcato o lipoproteine ​​non specificamente intrappolati sulla superficie cellulare come questo colesterolo sarà rapidamente incorporato da un accettore via non-specifico di trasferimento, e (ii) colesterolo marcato è equilibrata tra intracellulare varie piscine. Sebbene nella nostra esperienza 24 h di incubazione equilibrazione in terreno privo di siero è sufficiente per raggiungere questi obiettivi, di solito 48 h di incubazione viene utilizzato. Molti tipi di cellule non sopravvivono per 48 ore o 24 ore in terreno privo di siero. In questo caso 0,1% BSA (principalmente acidi grassi liberi) può fungere da sostituto. Lipoprotein-impoverito di siero o di siero di ricambio vari integratori può essere usato come ultima risorsa, ma è importante riconoscere che lipoproteine ​​deficit di siero fa e siero di ricambio integratori possono contain apolipoproteine ​​e che possano influire sul risultato. Purtroppo i produttori spesso non rivelare la composizione dei supplementi.

Durata della incubazione efflusso

Efflusso di colesterolo conduce a carico del colesterolo ad un accettore extracellulare e la deplezione del colesterolo nelle cellule. I cambiamenti nel contenuto di colesterolo di entrambe le cellule e l'accettore può influenzare il tasso e altre proprietà di efflusso di colesterolo. Inoltre, se l'accettore contiene colesterolo (ad es HDL) può spostarsi da accettore alle cellule e se l'attività specifica del colesterolo nel accettore diventa significativo, che complicare l'interpretazione dei risultati. Pertanto, è preferibile mantenere efflusso di incubazione più breve possibile, consentendo però il tempo per quantità sufficiente di colesterolo marcato per passare da cellule al accettore per permettere un rilevamento affidabile. In genere 2-6 ore è il tempo consigliato. Incubazioni più lunghe di 24 h rifletterebbe uno stato di equilibrium e pertanto sarà indicativo della capacità di accettore di accumulare colesterolo piuttosto che la velocità di efflusso colesterolo.

Accettante

Accettori Diversi sono specifici per le diverse vie di efflusso di colesterolo. Per la misurazione specifico di efflusso del colesterolo, apoA-I viene utilizzato per riflettere ABCA1 HDL-dipendente, mentre efflusso o HDL ricostituita ABCG1 e SR-B1-dipendenti percorsi. Ciclodestrina viene spesso utilizzato per valutare non-specifica efflusso. È importante includere nell'esperimento un campione "bianco", che non contiene accettore affatto, per misurare il contributo di non-specifica dissociazione di colesterolo e colesterolo rilasciato dalla disintegrazione cellule morte.

Concentrazione della accettore

Efflusso colesterolo include (i) rilascio di colesterolo da cellule e (ii) il suo assorbimento da parte di un accettore, entrambe le fasi possono essere limitante. Se l'obiettivo è di investigare sperimentale variazionicapacità delle cellule di rilasciare il colesterolo (ad esempio dopo la trasfezione o knock-down), allora la concentrazione del accettore non dovrebbe essere limitante. Per apoA-I e le concentrazioni di HDL 30-50 mg / ml sono solitamente non rate-limiting. Se la capacità del accettore per supportare efflusso colesterolo è l'obiettivo di indagine (ad esempio capacità di HDL isolato o campioni di plasma da pazienti o animali per supportare efflusso colesterolo), allora la concentrazione del accettore dovrebbe essere limitante. Per apoA-HDL e questo viene di solito 10 pg / ml, per i campioni di plasma è generalmente 1-2%, ma una preliminare dipendenza dalla dose esperimento per trovare una corretta concentrazione è essenziale per scegliere la dose.

Attivazione di cellule

Gli elementi principali responsabili di efflusso del colesterolo specifico sono due trasportatori ABC, ABCA1 e ABCG1. Entrambi sono regolati da LXR e pre-incubazione di cellule con agonista LXR (composto più popolare è TO-901317 disponibile dal Sigma) utilizzato a concentrazioni 1-4 mmol / L aumenta significativamente la percentuale di efflusso del colesterolo specifica. Cellule di origine murina, come 264,7 RAW o J774, possono anche essere attivato da cAMP (0,3 mmol / L).

Caricamento delle cellule con livelli di colesterolo

Caricamento delle cellule con livelli di colesterolo pre-incubazione con complessi acetilati o LDL ossidate o ciclodestrina-colesterolo stimola anche l'efflusso di colesterolo. Deve essere tenuto presente che celle di carico, in particolare i macrofagi con i cambiamenti di colesterolo molti aspetti della loro metabolismo. Scelta del modello (colesterolo caricato contro il colesterolo non caricati) dipende obiettivo scientifico dello studio.

Presentazione dei risultati

Solitamente i risultati dell'esperimento efflusso colesterolo vengono presentati come percentuale di colesterolo rilasciato dalle cellule: questo elimina la variabilità da numero di cellule in pozzetti singoli e in efficienza di etichettatura. Comunque, thsi è valido solo se il trattamento non ha influenzato la captazione del colesterolo e l'efflusso in assenza di accettore (vuoto). Queste due condizioni devono essere sperimentalmente provata.

Teoricamente questo metodo può essere usato per studiare efflusso di qualsiasi circoscrizione cellulare ad un accettore extracellulare. Se, a differenza di colesterolo, tale composto viene metabolizzato, quindi uno step di purificazione analitico deve essere incluso. Inoltre, se il composto viene sintetizzato nella cella, precursori sintetici possono essere utilizzati per l'etichettatura. Ad esempio, ^[14 C] acetato e ^[3 H] acqua sono stati usati per studiare l'efflusso di colesterolo neosintetizzata e ^[14 C] colato per studiare l'efflusso di fosfolipidi. In questo caso il colesterolo neosintetizzata deve essere separato dai precursori e intermedi, di solito mediante cromatografia su strato sottile.