Ensayo de eflujo de colesterol

1. Preparación de ^[3 H]-colesterol

1. En la campana de humos, dispensar la cantidad necesaria de colesterol ^[3 H] en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (0,5 Ci (19 kBq) por pocillo se requiere para un ensayo típico).
2. Si ^[3 H]-colesterol se suspendió en tolueno, que se seque por completo con gas N2 y resuspender con 100% de etanol a una concentración final de 1 Ci (37 kBq / l. Vortex y se mezcla bien.

2. Células en placas y al etiquetado de colesterol celular

Este protocolo ha sido probado con los siguientes tipos de células: monocitos humanos ^4,5, THP-1 monocitos humanos macrófagos ^6,7,8, RAW 264,7 macrófagos murinos ^5,9,10,11, células HeLa ^12, endoteliales de vena umbilical humana las células (HUVEC), las células BHK-21 ^9, fibroblastos humanos y de ratón, las células HepG2 ^13,14 hepatocarcinoma humano ¹⁵ y, en forma modificada, a partir de plaquetas <sup> 16.

1. Resuspender las células y contar con ellos. Células de la placa en placas de 12 pocillos en la densidad final de 0.2x10 ⁶ células por pocillo en 0,9 ml de medio completo. Las células seguirá creciendo y llegará a 0.8x10 ⁶ células por pocillo en el momento del experimento de flujo de salida. Para las células que no se dividen, como diferenciadas células THP-1, la densidad de siembra debe ser 0.8x10 ⁶ células por pocillo. Si se utiliza 6 - o placas de 24 pocillos, doble o la mitad del número de células por pocillo, respectivamente. El número de pozos debe ser suficiente para las determinaciones cuadruplicadas para cada condición experimental.
2. Si la diferenciación de células THP-1 se requiere, añadir PMA (concentración final 0,1 mg / ml) a los medios para 48-72 h.
3. Añadir una pequeña alícuota de los medios en el tubo de microcentrífuga que contiene la ^[3 H] colesterol.
4. Lave lados del tubo con los medios de comunicación antes de añadir ^{[3H]-colesterol} en una alícuota separada de medios completos (100 l / pocillo).
<li> Añadir los medios de comunicación que contienen ^[3 H] colesterol a los pozos con las células (volumen final por pocillo es de 1 ml). Si ningún tratamiento de las células se requiere antes de etiquetado, las células pueden ser cultivadas en ^[3 H] colesterol que contienen medio.
5. Se incuban las células durante 48 horas en cultivo celular incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).

3. Equilibrio de incubación

1. Después de la incubación de 48 horas, compruebe las células bajo el microscopio. Asegúrese de que estén sanos y se encuentran en aproximadamente el 80% de confluencia.
2. Retire los medios de comunicación que contiene ^[3 H] colesterol. Lave suavemente las células con PBS. Repita 3 veces el lavado.
3. Preparar medios libres de suero. Si es necesario, activar las células mediante la adición de agonistas de LXR (como A-901317 en 1.4 mmol / L) o cAMP (0,3 mmol / L; para las células de origen ratón) con el suero libre de los medios.
4. Añadir 500 l medios de comunicación libres de suero a cada pocillo.
5. Incubar durante 18 horas en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO _2).

1. Después de la incubación de 18 horas en medio libre de suero, comprobar las células bajo el microscopio. Asegúrese de que estén sanos y confluente (mínimo 80% de confluencia).
2. Preparar una solución de flujo de salida de colesterol aceptantes en medio libre de suero. Ejemplos de aceptadores incluyen:
   La apolipoproteína AI (ApoA-I) (concentración final de 10 mg / ml)
   Lipoproteína de alta densidad (HDL) (concentración final 20 ug / ml)
   Ciclodextrina (concentración final 200 mg / ml)
   Plasma (concentración final de 1-2%)
3. Lave suavemente las células con PBS.
4. Añadir 250 l de medio libre de suero con aceptores a cada pocillo.
5. Deja una serie de pozos para determinar el fondo de eflujo (flujo de salida de medio libre de suero con el NO aceptante)
6. Se incuban las células durante 2 horas en cultivo celular incubadora (37 ° C, 5% de CO _2). Duración de la incubación de eflujo puede variar desde 30 minutos a 8 horas si es necesario.

5. Procesamiento de Samples

1. Después de 2 horas de incubación revisar las células bajo el microscopio.
2. Recoger los medios de comunicación en tubos de 1,5 ml de microfuga. Girar a 14.000 rpm durante 1-10 min a temperatura ambiente para eliminar los desechos celulares.
3. Transferir 100 l medios en 7 ml de vial de centelleo. Añadir 5 ml de Plus Insta-gel (PerkinElmer) y la mezcla de vórtice. Almacenar las muestras restantes a 4 ° C.
4. Colocar las placas en el congelador durante 30 minutos. Añadir 500 l DH ₂ O a cada pocillo. Ver células bajo el microscopio para asegurar que todas las células han levantado desde el fondo de los pozos. Si todavía adheridas, o bien deje los platos con dH ₂ O a 4 ° C durante la noche pozos o rasguño.
5. Una vez que todas las células ya han despegado, pipetee hacia arriba y hacia abajo para romper agregados celulares. Transferir 100 l en 7 ml viales de centelleo. Añadir 5 ml de Plus Insta-gel (PerkinElmer) y la mezcla de vórtice. Guarde el resto de las placas a 4 ° C.
6. Coloque viales de centelleo en un contador de centelleo. Configurar el contador para contar a ^[3H] endpm unidades.

6. El análisis de los resultados

1. La tasa de eflujo de colesterol se expresa generalmente como una proporción de colesterol a partir de células movido al aceptor. La siguiente fórmula se utiliza:

2. El flujo de salida específica se calcula como la diferencia entre el flujo de salida en la presencia o ausencia del aceptor (blanco).

7. Línea de tiempo

8. Los resultados representativos

Un ejemplo de un resultado de un experimento eflujo de colesterol se muestra en la fig. 1. En este experimento, THP-1 monocitos humanos se diferencian en macrófagos y el eflujo de colesterol a receptores diferentes eraprobado. Eflujo de colesterol y medio sin aceptantes ("en blanco") fue de 0,79% y este valor fue considerado como un flujo de salida no son específicos y se restará de los demás valores. Eflujo de colesterol para la salud humana apoA-I (concentración final de 30 mg / ml) fue de 4,75%. Una muestra de plasma de referencia se incluyó en este experimento para controlar la variabilidad inter-experimental. Una muestra de referencia se puede utilizar para la normalización de datos a través de un gran número de experimentos, pero hemos encontrado prudente repetir el ensayo si la variabilidad es alta. Un plasma del paciente (concentración final 2%) se puso a prueba antes y después de que el paciente fue tratado con medicamentos. Se concluyó que en este medicamento paciente tenía un impacto negativo en la capacidad de plasma para apoyar el eflujo de colesterol.

Otro ejemplo de un resultado del experimento eflujo se muestra en la fig. 2. En este experimento RAW 264.7 macrófagos fueron activados o no activados por incubación durante la noche con agonista LXR A-901317 (concentración final1 mol / L) y el eflujo de colesterol a la misma muestra de plasma humano (2%) se ensayó. Se concluyó que la activación de la expresión celular de los transportadores ABC con agonista LXR aumenta la capacidad de las células para liberar el colesterol a aceptor extracelular.

Figura 1. Eflujo de colesterol de células THP-1 a aceptores diversos. Porcentaje de eflujo de colesterol (es decir, la proporción de colesterol marcado movido a partir de células al aceptor especificado) se muestra después de la sustracción de los valores en blanco. La media ± desviación estándar de las determinaciones de cuatro ejemplares, * p <0,05.

Figura 2. Eflujo de colesterol de RAW 264.7 activado o no activado con agonista LXR al plasma humano. Porcentaje de eflujo de colesterol (es decir, la proporción de colesterol marcada movido de células para elaceptor se especifica) se muestra después de la sustracción de los valores en blanco. La media ± desviación estándar de las determinaciones de cuatro ejemplares, * p <0,001.

El método descrito para medir el eflujo de colesterol está diseñado para medir el movimiento de colesterol de las células a un aceptor de colesterol extracelular. Hay varias consideraciones importantes en la comprensión de esta metodología.

Etiquetado y el equilibrio

En la metodología descrita colesterol marcado se añadieron al suero que contiene suero. Aunque nunca investigado en detalle, se supone que el colesterol se incorpora en las lipoproteínas de suero y que son absorbidos por las células. Es importante dejar tiempo suficiente para que las lipoproteínas que deben abordarse y para el colesterol para pasar de las lipoproteínas de las membranas celulares. Por lo general, el etiquetado 24 horas es suficiente, pero el etiquetado durante 48 horas logra una mayor actividad específica de colesterol intracelular. Hay que tener en cuenta que si ^[14 C] el colesterol se utiliza en lugar del colesterol ^[3 H] (por ejemplo, en los experimentos de doble etiquetado), el acto específicovidad de la primera es muy baja y la adición de colesterol lo suficiente marcado para lograr una actividad destinada específica puede cambiar el contenido de la celda de colesterol y por lo tanto influir en el resultado. También es importante que (i) no hay colesterol marcado o lipoproteínas no específicamente atrapados en la superficie celular como este colesterol será rápidamente incorporada por un aceptor no específico a través de transferencia, y (ii) el colesterol marcado se equilibra entre los diversos intracelular piscinas. Aunque en nuestra experiencia de incubación de 24 h en el equilibrio medio libre de suero es suficiente para lograr estos objetivos, por lo general 48 h de incubación se utiliza. Muchos tipos de células no sobreviven durante 48 horas o incluso 24 h en medio libre de suero. En este caso 0,1% de BSA (esencialmente libre de ácidos grasos) puede actuar como sustituto. Lipoproteína-empobrecido suero o varios suplementos de reemplazo de suero se puede utilizar como un último recurso, pero es importante reconocer que el suero lipoproteína-deficiente hace y suplementos de suero de recambio puede contain apolipoproteínas y que pueden afectar el resultado. Lamentablemente, los fabricantes no suelen revelar la composición de los suplementos.

Duración de la incubación eflujo

Eflujo de colesterol conduce a la carga de colesterol a un aceptor extracelular y el agotamiento de colesterol en las células. Los cambios en el contenido de colesterol de ambas células y aceptor pueden afectar la tasa y otras propiedades de eflujo de colesterol. Además, si el aceptor contiene colesterol (por ejemplo HDL) puede pasar de aceptor a las células y si la actividad específica de colesterol en el aceptor llega a ser significativo, que complican la interpretación de los resultados. Por lo tanto, lo mejor es mantener incubación eflujo tan corto como sea posible, permitiendo sin embargo el tiempo para una cantidad suficiente de colesterol marcado para mover a partir de células para el aceptor para permitir una detección fiable. Generalmente 2-6 horas es el tiempo recomendado. Las incubaciones de más de 24 horas que reflejan un estado de equilibrium y por lo tanto, será indicativa de la capacidad de aceptor de acumular colesterol en lugar de la tasa de eflujo de colesterol.

Aceptador

Aceptantes diferentes son específicos para las diferentes vías de salida del colesterol. Para la medición de flujo de colesterol específico, apoA-I se utiliza para reflejar ABCA1 dependiente de HDL, mientras que de salida o HDL reconstituido para ABCG1 y las vías de SR-B1-dependientes. Ciclodextrina se utiliza a menudo para evaluar no específica flujo de salida. Es importante incluir en el experimento un "blanco" de la muestra, que no contiene aceptor en absoluto, para medir la contribución de la no-específica disociación de colesterol y colesterol liberado de las células muertas de desintegración.

La concentración del aceptor

Eflujo de colesterol incluye (i) la liberación de colesterol por las células y (ii) su absorción por un aceptor, ambos pasos puede ser limitante de la velocidad. Si el objetivo experimental es investigar los cambios en elcapacidad de las células para liberar el colesterol (por ejemplo después de la transfección o derribo-), entonces la concentración del aceptor no debe ser limitante de la velocidad. Para apoA-I y HDL las concentraciones de 30-50 g / ml son generalmente no limitante de la velocidad. Si la capacidad del aceptor para apoyar el eflujo de colesterol es el objetivo de investigación (por ejemplo, capacidad de HDL aislada o muestras de plasma de pacientes o animales para apoyar el eflujo de colesterol), entonces la concentración del aceptor debe ser limitante de la velocidad. Para apoA-I y HDL esto suele 10 ug / ml, para muestras de plasma esto es generalmente 1-2%, pero una dependencia de la dosis preliminar experimento para encontrar una concentración correcta es esencial para elegir la dosis.

La activación de las células

Los principales elementos responsables de la salida del colesterol específico son dos transportadores ABC, ABCA1 y ABCG1. Ambos están regulados por LXR y de pre-incubación de las células con agonistas de LXR (compuesto más popular es-901.317 disponibles de SIGMA) que se utiliza en concentraciones 1-4 mol / L aumenta significativamente la proporción de eflujo de colesterol específico. Las células de origen de ratón, tales como RAW 264.7 o J774, también puede ser activada por el AMPc (0,3 mmol / l).

La carga de las células con colesterol

La carga de las células con el colesterol por la pre-incubación de las mismas con el complejo oxidado acetilado o LDL o colesterol-ciclodextrina también estimula el eflujo de colesterol. Hay que tener en cuenta que la carga de las células, especialmente macrófagos con los cambios de colesterol muchos aspectos de su metabolismo. Elección del modelo (el colesterol cargado contra el colesterol no se carga) depende de objetivo científico del estudio.

Presentación de los resultados

Por lo general, los resultados del experimento de eflujo de colesterol se presentan como un porcentaje de colesterol liberado de las células: esto elimina la variabilidad del número de células en pocillos individuales y en la eficiencia de etiquetado. Sin embargo, thes sólo es válida si el tratamiento no afectó la absorción de colesterol y la expulsión de la de la ausencia del aceptor (en blanco). Estas dos condiciones tienen que ser comprobado a nivel experimental.

Teóricamente, este método puede ser utilizado para estudiar flujo de salida de cualquier circunscripción celular a un aceptor extracelular. Si, a diferencia de colesterol, tal compuesto se metaboliza, entonces una etapa de purificación analítica necesita ser incluido. Además, si el compuesto se sintetizó en la célula, precursores sintéticos pueden ser utilizados para el etiquetado. Por ejemplo, ^[14 C] acetato y ^[3H]-el agua se utiliza para estudiar el flujo de salida de colesterol de nueva síntesis y ^[14 C] colato para estudiar el flujo de salida de los fosfolípidos. En este caso el colesterol recién sintetizado necesita ser separado a partir de precursores y productos intermedios, por lo general por cromatografía en capa fina.