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 JoVE Clinical and Translational Medicine

Essai efflux de cholestérol

, ,

Baker IDI Heart and Diabetes Institute

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Cite this Article: Essai efflux de cholestérol

Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. J. Vis. Exp. (61), e3810, doi:10.3791/3810 (2012).

Abstract: Essai efflux de cholestérol

La teneur en cholestérol des cellules doit être maintenue dans les limites très étroites, trop ou trop peu de cholestérol dans quelques résultats de cellules dans la perturbation des membranes cellulaires, l'apoptose et nécrose 1. Les cellules peuvent cholestérol source à partir de la synthèse intracellulaire et de lipoprotéines plasmatiques, les deux sources sont suffisantes pour satisfaire pleinement les exigences des cellules pour le cholestérol. Les processus de synthèse du cholestérol et l'absorption sont strictement réglementées et les carences de cholestérol sont de 2 rares. Le taux de cholestérol excessif est de 3 problème le plus courant. À l'exception des hépatocytes et des cellules corticosurrénales degré, les cellules sont incapables de dégrader le cholestérol. Les cellules ont deux options pour réduire leur teneur en cholestérol: pour convertir le cholestérol en esters de cholestérol, une option avec une capacité limitée que la surcharge des cellules avec des esters de cholestérol est également toxique, et l'efflux de cholestérol, une option avec une capacité potentiellement illimitée. Efflux de cholestérol est un specprocessus de l'IFIC qui est réglementée par un certain nombre de transporteurs intracellulaires, comme liaison de l'ATP des protéines transporteur ABC A1 (ABCA1) et G1 (ABCG1) et de type B1 scavenger receptor. L'accepteur naturel de cholestérol dans le plasma est lipoprotéines de haute densité (HDL) et de l'apolipoprotéine AI.

Le test d'efflux de cholestérol est conçu pour quantifier le taux de l'efflux de cholestérol à partir de cellules cultivées. Il mesure la capacité des cellules à maintenir efflux de cholestérol et / ou la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le dosage comprend les étapes suivantes. Etape 1: étiquetage cholestérol cellulaire en ajoutant cholestérol marqué à milieu contenant du sérum et incubation avec des cellules de 24-48 h. Cette étape peut être combiné avec le chargement de cellules avec le cholestérol. Étape 2: l'incubation des cellules dans un milieu sans sérum pour équilibrer le cholestérol marqué parmi tous les bassins cholestérol intracellulaire. Cette étape peut être combiné avec l'activation de cellules chtransporteurs olesterol. Étape 3: l'incubation des cellules avec l'accepteur extracellulaire et la quantification du mouvement du cholestérol marqué à partir de cellules à l'accepteur. Si précurseurs du cholestérol ont été utilisés pour étiqueter le taux de cholestérol nouvellement synthétisé, une quatrième étape, la purification du cholestérol, peuvent être nécessaires.

Le test fournit les informations suivantes: (i) la façon dont un traitement particulier (une mutation, un knock-down, une surexpression ou un traitement) affecte la capacité de la cellule au cholestérol efflux et (ii) la façon dont la capacité d'accepteurs de plasma à accepter le taux de cholestérol est affecté par une maladie ou d'un traitement. Cette méthode est souvent utilisée dans le contexte de la recherche cardiovasculaire, des troubles métaboliques et neurodégénératives, infectieuses et maladies de la reproduction.

Protocol: Essai efflux de cholestérol

1. Préparation de la [3 H]-cholestérol

  1. Dans la hotte, distribuer la quantité requise de cholestérol [3 H] dans un tube de 1,5 ml de micro (0,5 pCi (19 kBq) par puits est nécessaire pour un essai typique).
  2. Si [3 H]-cholestérol est en suspension dans le toluène, le sécher complètement avec du gaz N2 et remettre en suspension avec de l'éthanol à 100% pour une concentration finale de 1 pCi (37 kBq / ul. Vortex et bien mélanger.

2. Étalement des cellules et à l'étiquetage du cholestérol cellulaire

Ce protocole a été testé en utilisant les types de cellules suivants: 4,5 monocytes humains THP-1, les monocytes-macrophages humains 6,7,8, RAW 264.7 de macrophages murins 5,9,10,11, les cellules HeLa 12, veine ombilicale humaine endothéliale cellules (HUVEC), des cellules BHK-21 9, les fibroblastes humains et de souris, les cellules HepG2 13,14 hépatocarcinome humain 15 et, dans une forme modifiée, à partir de plaquettes <sup> 16.

  1. Remettre en suspension les cellules et les compter. Cellules de la plaque dans des plaques 12 puits à la densité finale de 0.2x10 6 cellules par puits dans 0,9 ml de milieu complet. Cellules continuera de croître et atteindra 0.8x10 6 cellules par puits au moment de l'expérience efflux. Pour les cellules qui ne se divisent pas, comme différenciées cellules THP-1, la densité de semis doit être 0.8x10 6 cellules par puits. Si vous utilisez 6 - ou plaques à 24 puits, double ou la moitié du nombre de cellules par puits, respectivement. Le nombre de puits devrait être suffisant pour les déterminations de quadruples pour chaque condition expérimentale.
  2. Si la différenciation des cellules THP-1 est nécessaire, ajouter PMA (concentration finale 0,1 pg / ml) pour les médias pendant 48-72 h.
  3. Ajouter une petite aliquote des médias dans le microtube contenant la [3 H] cholestérol.
  4. Laver les côtés du tube avec les médias avant d'ajouter [3 H] cholestérol dans une partie aliquote de séparée des médias complets (100 pl / puits).
    5. <li> Ajouter des médias contenant [3 H] cholestérol dans les puits avec des cellules (volume final par puits est de 1 ml). Si aucun traitement de cellules est nécessaire avant le marquage, les cellules peuvent être étalées dans la [3 H] cholestérol milieu contenant.
  5. Incuber les cellules pendant 48 heures dans incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2).

3. Incubation d'équilibration

  1. Après 48 heures d'incubation, vérifier les cellules sous le microscope. Assurez-vous qu'ils sont en bonne santé et sont à environ 80% de confluence.
  2. Retirez le support contenant [3 H] cholestérol. Laver les cellules délicatement avec du PBS. Répétez 3 fois de lavage.
  3. Préparer un milieu sans sérum. Si nécessaire, activer les cellules en ajoutant un agoniste LXR (comme A-901 317 à 1-4 mmol / L) ou d'AMPc (0,3 mmol / L; pour les cellules d'origine de la souris uniquement) pour le sérum de libre-médias.
  4. Ajouter 500 ul milieux exempts de sérum dans chaque puits.
  5. Incuber pendant 18 heures dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2).
<p class = "jove_title"> 4. Incubation efflux de cholestérol

  1. Après 18 heures d'incubation dans un milieu sans sérum, vérifier les cellules sous le microscope. Assurez-vous qu'ils sont en bonne santé et anastomosé (minimum de 80% de confluence).
  2. Préparer une solution de cholestérol accepteurs d'efflux dans un milieu sans sérum. Exemples d'accepteurs comprennent:
    L'apolipoprotéine AI (apoA-I) (concentration finale de 10 pg / ml)
    Lipoprotéines de haute densité (HDL) (concentration finale de 20 pg / ml)
    Cyclodextrine (concentration finale 200 pg / ml)
    Plasma (concentration finale 1-2%)
  3. Laver les cellules délicatement avec du PBS.
  4. Ajouter 250 pi de milieu sans sérum avec des accepteurs à chaque puits.
  5. Laisser un ensemble de puits pour déterminer fond efflux (efflux de milieux exempts de sérum avec NO accepteur)
  6. Incuber les cellules pendant 2 heures dans incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2). Durée de l'incubation efflux peut varier de 30 min à 8 h si nécessaire.

5. Traitement Samples

  1. Après 2 heures d'incubation vérifier cellules sous le microscope.
  2. Recueillir des médias dans 1,5 ml microtubes. Centrifuger à 14000 rpm pour 1-10 min à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires.
  3. Transfert de 100 médias ul en 7 ml flacon à scintillation. Ajouter 5 ml d'Insta-Gel Plus (PerkinElmer) et le mélange de vortex. Conserver les échantillons restants à 4 ° C.
  4. Placez les plaques dans le congélateur pendant 30 minutes. Ajouter 500 ul dH 2 O dans chaque puits. Vérifiez les cellules sous le microscope pour s'assurer que toutes les cellules ont levé du fond de puits. Si encore adhérent, soit laisser les assiettes avec dH 2 O à 4 ° C durant la nuit ou gratter les puits.
  5. Une fois que toutes les cellules ont décollé, pipeter et pour briser les mottes de cellules. Transférer 100 ul en 7 flacons de scintillation ml. Ajouter 5 ml d'Insta-Gel Plus (PerkinElmer) et le mélange de vortex. Stocker les plaques restantes à 4 ° C.
  6. Placez des flacons à scintillation sur un compteur à scintillation. Configurer compteur pour compter de [3 H] dansunités dpm.

6. L'analyse des résultats

  1. Le taux de l'efflux de cholestérol est habituellement exprimé en proportion du cholestérol déplacé à partir de cellules à l'accepteur. La formule suivante est utilisée:

L'équation 1

  1. L'efflux spécifique est calculé comme une différence entre l'efflux de la présence ou l'absence de l'accepteur (vide).

L'équation 2

7. Chronologie

Figure 1

8. Les résultats représentatifs

Un exemple de résultat d'une expérience d'efflux de cholestérol est indiqué dans la Fig. 1. Dans cette expérience, THP-1 monocytes humains ont été différenciées en macrophages et l'efflux de cholestérol à des accepteurs différents étaittesté. Efflux de cholestérol à moyen sans accepteurs ("blank") était de 0,79% et cette valeur a été considérée comme un efflux non spécifique et a été soustraite des autres valeurs. Efflux de cholestérol pour la santé humaine apoA-I (concentration finale de 30 pg / ml) était de 4,75%. Un échantillon de plasma de référence a été inclus dans cette expérience pour surveiller la variabilité inter-expérimentale. Un échantillon de référence peut être utilisé pour la normalisation des données à travers un grand nombre d'expériences, mais nous avons trouvé qu'il était prudent de répéter le dosage si la variabilité est élevée. Un plasma du patient (concentration finale de 2%) a été testé avant et après que le patient a été traité avec des médicaments. Il a été conclu que, dans ce médicament aux patients ont eu un impact négatif sur la capacité du plasma à soutenir l'efflux de cholestérol.

Un autre exemple d'un résultat de l'expérience efflux est montré dans la figure. 2. Dans cette expérience, les macrophages RAW 264.7 ont été activés ou non activés par une nuit d'incubation avec un agoniste de LXR TO-901 317 (concentration finale1 umol / L) et l'efflux de cholestérol au même échantillon de plasma humain (2%) a été testé. Il a été conclu que l'activation de l'expression cellulaire des transporteurs ABC avec un agoniste de LXR augmente la capacité des cellules à libérer le cholestérol à l'accepteur extracellulaire.

Figure 1
Figure 1. Efflux de cholestérol à partir de cellules THP-1 à différents accepteurs. Pourcentage de l'efflux de cholestérol (c.-à-la proportion de cholestérol marqué déplacé à partir de cellules à l'accepteur spécifié) est affiché après la soustraction des valeurs vides. Moyenne ± écart-type de déterminations quadruples, * p <0,05.

Figure 2
Figure 2. Efflux de cholestérol à partir de RAW 264.7 activée ou non activée avec un agoniste LXR pour le plasma humain. Pourcentage de l'efflux de cholestérol (c.-à-la proportion de cholestérol marqué déplacé à partir de cellules de laaccepteur spécifié) est affiché après la soustraction des valeurs vides. Moyenne ± écart-type de déterminations quadruples, * p <0,001.

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Discussion: Essai efflux de cholestérol

Le procédé décrit à mesurer efflux de cholestérol est conçu pour mesurer le mouvement du cholestérol des cellules à un accepteur de cholestérol extracellulaire. Il ya plusieurs considérations clés pour la compréhension de cette méthode.

L'étiquetage et l'équilibration

Dans la méthodologie décrite cholestérol marqué est ajouté au sérum contenant le sérum. Bien que n'ayant jamais étudié en détail, il est supposé que le taux de cholestérol est incorporé dans les lipoprotéines sériques et ils sont absorbés par les cellules. Il est important de laisser suffisamment de temps pour les lipoprotéines à prendre et pour le cholestérol des lipoprotéines de se déplacer à des membranes cellulaires. Habituellement 24 h étiquetage est suffisant, mais l'étiquetage pour 48 h réalise activité spécifique plus élevée du cholestérol intracellulaire. Il doit être pris en compte que si [14 C] cholestérol est utilisé à la place du cholestérol [3 H] (par exemple dans les expériences de double marquage), l'acte spécifiqueivité de la première est très faible et en ajoutant le taux de cholestérol assez marqué pour atteindre destiné activité spécifique peut changer la teneur en cholestérol des cellules et donc influer sur le résultat. Il est également important que (i) il n'y a pas de cholestérol ou lipoprotéines marquée non piégées spécifiquement sur ​​la surface de la cellule que ce taux de cholestérol sera rapidement intégrée par un accepteur non spécifique par le biais de transfert, et (ii) le taux de cholestérol marqué est équilibrée entre les différents intracellulaire piscines. Bien que, dans notre expérience une incubation de 24 h à l'équilibration du milieu sans sérum est suffisante pour atteindre ces objectifs, le plus souvent 48 h d'incubation est utilisé. De nombreux types de cellules ne survivent pas pendant 48 h ou même 24 h dans un milieu sans sérum. Dans ce cas, 0,1% de BSA (essentiellement des acides gras libres) peuvent agir comme substitut. Lipoprotein-appauvri de sérum ou de sérum de remplacement différents compléments peuvent être utilisés qu'en dernier recours, mais il est important de reconnaître que le sérum des lipoprotéines de carence en fait et de sérum de remplacement des suppléments peuvent contain apolipoprotéines et qui peuvent influer sur le résultat. Malheureusement les fabricants ne sont souvent pas divulguer la composition des suppléments.

Durée de l'incubation d'efflux

Efflux de cholestérol conduit à charger du cholestérol à un accepteur extracellulaire et la déplétion de cholestérol dans les cellules. Les changements dans la teneur en cholestérol des deux cellules et accepteurs peuvent affecter le taux et les autres propriétés de l'efflux de cholestérol. En outre, si l'accepteur contient du cholestérol (HDL, par exemple), il peut passer d'accepteur pour les cellules et si l'activité spécifique du cholestérol dans l'accepteur devient significatif, qui compliquent l'interprétation des résultats. Ainsi, il est préférable de garder l'incubation efflux aussi court que possible, tout en permettant cependant de temps pour une quantité suffisante de cholestérol marqué à se déplacer à partir de cellules à l'accepteur pour permettre une détection fiable. Généralement 2-6 h est le temps recommandé. Les incubations de plus de 24 h serait reflètent un état de equilibreBrium et sera donc représentatif de la capacité de l'accepteur d'accumuler le taux de cholestérol plutôt que le taux de l'efflux de cholestérol.

Accepteur

Différents accepteurs sont spécifiques à différentes voies de l'efflux de cholestérol. Pour mesurer l'efflux de cholestérol spécifique, l'apoA-I est utilisé pour refléter ABCA1-dépendante HDL tout en efflux ou HDL reconstituée pour ABCG1 et SR-B1-voies dépendantes. Cyclodextrine est souvent utilisé pour évaluer la non-spécifique efflux. Il est important d'inclure dans l'expérience un «blanc» de l'échantillon, qui ne contient pas du tout accepteur, de mesurer la contribution de la non-dissociation spécifique du cholestérol et du cholestérol libéré de désintégration des cellules mortes.

Concentration de l'accepteur

Efflux de cholestérol comprend (i) la libération du cholestérol par les cellules et (ii) son absorption par un accepteur, les deux étapes peut être limitante. Si l'objectif expérimental est d'étudier les changements dans lela capacité des cellules à libérer le cholestérol (par exemple après transfection ou knock-down), alors la concentration de l'accepteur ne doit pas être limitation de débit. Pour l'apoA-I et les concentrations de HDL de 30-50 pg / ml sont généralement non de limitation de vitesse. Si la capacité de l'accepteur d'appuyer efflux de cholestérol est l'objectif de recherche (par exemple la capacité de HDL isolé ou d'échantillons de plasma provenant de patients ou d'animaux à soutenir efflux de cholestérol), alors la concentration de l'accepteur doit être limitante. Pour l'apoA-I et le HDL ce qui est généralement 10 pg / ml, pour des échantillons de plasma ce n'est généralement 1-2%, mais un préalable à la dose la dépendance expérience pour trouver une bonne concentration est essentiel de choisir la dose.

L'activation des cellules

Les principaux éléments responsables de l'efflux de cholestérol spécifique sont deux transporteurs ABC, l'ABCA1 et ABCG1. Les deux sont régis par LXR et pré-incubation des cellules avec un agoniste de LXR (composé le plus populaire est de 901 317-disponibles à partir de Sigma) utilisés à des concentrations 1-4 mmol / L augmente de manière significative la proportion de l'efflux de cholestérol spécifique. Les cellules d'origine de la souris, tels que 264,7 RAW ou J774, peuvent également être activée par l'AMPc (0,3 mmol / L).

Chargement des cellules avec le taux de cholestérol

Chargement des cellules avec le taux de cholestérol en pré-incubation avec les complexes acétylé ou LDL oxydées ou cyclodextrine-cholestérol stimule également l'efflux de cholestérol. Il doit être gardé à l'esprit que le chargement des cellules, en particulier les macrophages avec des changements de cholestérol de nombreux aspects de leur métabolisme. Choix du modèle (le taux de cholestérol chargés ou à ne pas le taux de cholestérol chargé) dépend de l'objectif scientifique de l'étude.

Présentation des résultats

Habituellement, les résultats de l'expérience efflux de cholestérol sont présentées comme un pourcentage de cholestérol libéré par les cellules: ce qui élimine la variabilité du nombre de cellules dans des puits individuels et de l'efficacité de l'étiquetage. Toutefois, eest n'est valable que si le traitement n'a pas d'incidence sur l'absorption du cholestérol et l'efflux en l'absence de l'accepteur (blanc). Ces deux conditions doivent être expérimentalement prouvée.

Théoriquement, cette méthode peut être utilisée pour étudier l'efflux de toute circonscription cellulaire à un accepteur extracellulaire. Si, contrairement au cholestérol, ce composé est métabolisé, puis une étape de purification d'analyse doit être inclus. En outre, si le composé est synthétisé dans la cellule, des précurseurs synthétiques peuvent être utilisés pour l'étiquetage. Par exemple, [14 C] acétate et [3 H] de l'eau ont été utilisés pour étudier l'efflux de cholestérol nouvellement synthétisé et [14 C] cholate pour étudier l'efflux de phospholipides. Dans ce cas, le taux de cholestérol nouvellement synthétisé doit être séparée à partir de précurseurs et de produits intermédiaires, généralement par chromatographie sur couche mince.

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Disclosures: Essai efflux de cholestérol

Les auteurs déclarent pas les conflits d'intérêts liés à cette étude.

Acknowledgements: Essai efflux de cholestérol

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Santé nationale et du Medical Research Council de l'Australie (NHMRC) (526 615 545 906 et) et en partie par le programme gouvernemental victorienne OIS. DS est un membre de NHMRC.

References: Essai efflux de cholestérol

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