高效的小鼠胚胎干细胞分化成运动神经元

1。步骤1：小鼠胚胎干细胞（MES）文化（定时：3天）

1。电镀主小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）

1. 大衣4个100毫米组织培养皿中，用明胶PMEF粘附。加入8毫升0.1％的明胶溶液（干细胞），每道菜，并在室温下30分钟的孵育。
2. 去除多余的明胶从菜肴。不要冲洗碗碟。
3. 稀包含约一小瓶丝裂霉素C灭活PMEF（Millipore公司）。 5×10 ⁶细胞（配方见表1），到PMEF媒体40毫升到4个100毫米组织培养皿板。 PMEF提供一个mES细胞的饲养层。
4. PMEF应镀加入MES细胞培养前至少一天。 PMEF可使用1周后镀。

2。电镀MES细胞

监察MES细胞分化成运动神经元的效率，我们使用HBG3，下控制运动神经元特异性启动子HB9表达EGFP转基因小鼠的胚胎干细胞系。

1. 除霜1小瓶的HBG3 mES细胞在37℃水浴中（约1×10 ^7，由道格拉斯·克尔博士，美国约翰霍普金斯大学提供）。加入5毫升和15毫升管ES介质（配方见表1）降速为5分钟800转的细胞。
2. 吸出上清液，重悬MES细胞的ES媒体20毫升新鲜新增的白血病抑制因子（LIF），在终浓度为10毫微克/毫升。注：应添加LIF的一天的使用，并须保持在未分化状态的细胞MES。
3. 从每道菜的PMEF 10的毫升PMEF媒体和添加10毫升的HBG3胚胎干细胞悬液，每道菜。
4. 24小时后，电镀，MES细胞形成小菌落，大小类似箭头表示在图1B殖民地。 72小时后，电镀，coloniES尺寸的增加，许多直径约100微米（ 图1B，用箭头表示）。这些细胞分化的准备。媒体应每天更换，以维持细胞的增殖。

2。第2步：神经诱导（定时：2天）

诱导分化成运动神经元的MES细胞，mES细胞需要分开从PMEF和悬挂的环境中培养。明胶涂层烧瓶用于分离mES细胞PMEF。

1. 当MES殖民地准备神经诱导（分化第0天），涂0.1％明胶（18毫升/瓶），在室温为30分钟2 T150烧瓶，然后去除多余的明胶和用1X PBS三倍。注：每100毫米的菜文化需要一个T150-明胶涂层烧瓶分离PMEF。
2. 小心取出，通过抽吸的介质，确保不打跑松散的连接菌落。添加10毫升PBS简要LY然后愿望删除完成清洗步骤。
3. 分开从PMEF的MES细胞，加入0.25％胰蛋白酶/ EDTA（3毫升/碟，干细胞技术），并在37°C孵育3-5分钟，直到干细胞和PMEF脱离板。无LIF和吸管细胞加入15毫升新鲜的ES媒体向上和向下突破殖民地（约15-20倍）。然后，添加0.1％的明胶涂层T150烧瓶，孵育30分钟，在37°C。孵化后，PMEF应重视糊化表面，而胚胎干细胞应漂浮。收集到50毫升管浮动mES细胞。
4. 降速在10毫升的神经分化培养基（配方见表1），在800 rpm和重悬细胞。
5. 使用到100毫米的细菌或暂停培养皿1血细胞计数板约2×10 ⁶ mES细胞的细胞计数。这些板块允许悬浮培养的生长，促进形成胚状体（EBS）。
6. 上分化TION第1天，MES细胞形成的小浮动总量（EBS），光学显微镜下可见。任何结转PMEF附加菜。悬浮细胞和媒体转移到了15​​毫升管和低速离心3分钟（500转）。仔细吸干媒体，添加10毫升新鲜的神经分化培养基颗粒胚，然后板细胞中一种新的细菌菜。在除了补益媒体，这一步删除任何PMEF，从之前的步骤进行。
7. 分化第2天，EBS是随时可以诱导成运动神经元。

3。第三步：运动神经元规格（定时：5天）

1. 在分化第2天，漩涡培养皿和15毫升管转移到媒体和EBS。让胚比重（约10分钟），或在低速离心3分钟（500转）定居。
2. 在10毫升（国防部）中型运动神经元分化的培养基认真吸重悬胚（见配方
3. 在分化第7天，EBS应该在直径约150 - 200微米，并应对此表示强烈的绿色荧光信号（ 图1C）。这些胚准备涂层菜或盖玻片上poly-DL-ornithine/laminin分离和镀金。

4。第4步：制备Poly-DL-ornithine/laminin涂层盖玻片（定时：2天）

前两天游离胚（即在分化第5天），准备poly-DL-ornithine/laminin-coated盖玻片。

1. 地方12毫米的圆形盖玻片的24孔板底部（华纳仪器）。溶解聚-DL-鸟氨酸（Sigma-Aldrich公司），25毫升25毫克无菌双蒸水（D _{2·H 2} O）的获得10倍的股票解决方案（1毫克/毫升）。当准备使用，使H _{2 O 2}与D 1/10稀释的聚-DL-鸟氨酸获得concent口粮100微克/毫升。加入0.5毫升，每4°C间良好的24孔板孵育过夜。
2. 翌日（分化第6天），吸聚-DL-鸟氨酸，让组织文化罩板和盖玻片空气干燥。 D ₂ H _{2 O}三次冲洗液体。让我们为一个小时，空气干燥。
3. 1毫克小鼠层粘连蛋白（Millipore公司）溶于5毫升冰冷的1×PBS 100X原液（200微克/毫升）。当准备使用，使在冰冷的1X PBS（粘连2微克/毫升）稀释1/100。添加0.5毫升/ 24孔板孵育4℃过夜。播种前细胞，多余的粘连应该被删除，并两次用1X PBS冲洗井。盖玻片可以存储在国防部中等（0.5毫升/孔）。

5。第5步：轴突伸长率（执行时间：2天）

1. 在分化的第7天，收集到15毫升管EBS和允许胚定居（约3分钟）。抽吸媒体和重新-S在PBS uspend胚。允许胚定居，然后吸PBS。重复此步骤3次。加入1毫升到EBS Accumax（Millipore公司），轻轻混匀，静置室温5分钟。然后吸过剩Accumax涵盖了EBS。
2. 游离EBS，添加3毫升国防部介质。吸取了上下20次使用1毫升的Eppendorf微量（蓝色提示）扰乱胚。孵育室温2分钟。悬浮细胞与细胞过滤帽（屋宇署猎鹰）转移到12x75毫米管，获得单细胞悬液。重复此剩余的团块，并保留通过过滤器，以丰富的单细胞产量细胞的分离步骤。最后的单细胞悬液，将6毫升。
3. 轻轻混匀这个单细胞悬液，用血球计数细胞。稀释细胞密度2×10 ⁵细胞每毫升入国防部培养基（辅以10毫微克/毫升每个脑源性神经营养因子GDNF的，睫状神经营养因子，和NT-3）。 24孔板含宝加入细胞悬液（0.5毫升/）ly-DL-ornithine/laminin涂层盖玻片（事先准备好的如上所述）。分化的细胞扩大培养后2天（ 图1D）长突起。

6。代表结果

图1A显示了一个协议的轮廓。在第1步，MES细胞培养PMEF LIF的补充，以防止自发分化。在一般情况下，未分化的MES殖民地是圆而紧凑，并有明确界定的边缘。殖民地是不能彼此接触。通常情况下，应mES细胞分裂1:4的比例，每2〜3天。然而，每个人的细胞会以不同的速率增长，必须凭经验确定分流比。在图1B箭头指示后，在3天的PMEF饲养层培养mES细胞的典型外观。这些殖民地是大（直径在50-100微米），但仍保持轮和界定边缘第在这个阶段的殖民地分化或亚文化。在图1B箭头显示一个小的MES殖民地您通常电镀后24小时。电镀后4天，MES细胞变得杂草丛生。他们表现出一个扁平的外观和损失定义的边界，这表明他们已经开始分化。这种细胞分化成神经细胞的最佳。

mES细胞分化成运动神经元，mES细胞需要培养悬浮条件允许的EB形成。在第2步，胚胎干细胞被转移到无饲养层，以促进EB形成一种文化表面。在这一步，他们培养Noggin的，碱性成纤维细胞生长因子，FGF-8辅以2天直接向神经系细胞的神经分化中等。小EBS可以分化第1天在显微镜下观察。他们应漂浮在培养基。也可以在第1天发现结转PMEF分化，必须拆除。坚持这些细胞被淘汰时胚代到一个新的细菌菜细菌菜肴。因此，分化2天，很少或根本没有PMEF应看到，在培养皿中。在第3步，继续EBS转移到新的菜肴，应确保去除任何剩余PMEF的。胚培养运动神经元分化（国防部）与RA补充媒体和凹陷分化成运动神经元细胞为5天。在培养过程中，EBS继续扩大规模，并可以通过肉眼看到，在分化第3天〜4次。 图1C显示EBS的分化第7天的微观外观。不同的是未分化的细胞，EBS显示较强的荧光，由于GFP的表达。这些胚是最佳的分化和分离的准备。流式细胞仪检测表明，51％±0.8％游离胚细胞分化成绿色荧光蛋白表达细胞^5。在步骤5中，日文化ESE电机神经元GDNF的，睫状神经营养因子，脑源性神经营养因子，延长长期性轴索预测和NT3结果存在。 图1D显示分化细胞分离胚电镀后第2天的外观。注意镀细胞的细胞体延伸的长突起。免疫荧光染色显示，GFP +细胞表达泛神经元标记（神经丝蛋白中链）和两个运动神经元的特异性标志物，（胰岛-1和胆碱乙酰转移酶， 图2）。

图1。mES细胞分化成运动神经元（从武等图片修改^。5）。 a）计划mES细胞运动神经元的分化协议。二）MES的未分化细胞形成的成纤维细胞饲养层的顶部的圆形菌落。他们有弱的绿色荧光蛋白表达。 c）MES细胞分开饲养层和cultu在低附着菜红，形成胚。在第一天的分化过程中，细胞暴露于50毫微克/毫升Noggin的20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子，20 ng / ml的FGF-8。随后，他们被诱导分化为1μm维甲酸和1μM的5天的刺猬激动剂凹陷。 MES的分化细胞中表达GFP荧光强。 d）经过7天的分化，胚分离poly-DL-ornithine/laminin涂层板镀。分化的细胞延长2天中文化后的很长的神经过程。比例尺= 200微米。百万=电机的神经元。 B，C和D是亮场图像和乙'，C'和D'是相应的荧光图像。

图2 MES细胞衍生的运动神经元表征。免疫荧光染色神经丝蛋白中链NF-M（红色），聊天（红色），胰岛-1（红色）与GFP（绿色）expr的重合分裂国家。的DAPI（蓝色）被用来确定原子核。比例尺= 50微米。

mES细胞的质量是最关键的参数为运动神经元的高效发电。 mES细胞必须培养，对PMEF防止自发分化。此外LIF的帮助mES细胞保持在未分化状态。由于MES细胞分裂每12至15小时，培养基变得枯竭迅速，必须每天更换。

高效活化Shh的途径是一个关键的参数，需要引起运动神经元的规范。 Shh蛋白（研发体系），Shh信号激动剂，如HH激动剂HhAg1.3（Curis公司），purmorphamine（Calbiochem公司），凹陷（EMD的化学品），都被用来促进运动神经元的形成^{1-3 ，10,11。}我们发现凹陷是一个更有效的分子比purmorphamine在分化细胞迈向运动神经元型^5。 1 - 2.5μM的1μM天雨purmorphamine从未放弃的分化效率超过20％。然而在我们手中，RA和1微米，1微米的凹陷的组合，都没有神经诱导步骤分化过程中的约25％的效率。

为了进一步加强分化的效率，我们添加了一个为期2天的神经感应步前运动神经元的规范步骤。这种方法需要Noggin与FGF信号是至关重要的早期神经诱导胚胎干细胞时首次进入神经 ​​系^6-9的优势。 FGF信号在神经诱导，维持神经前体细胞的培养。在发展中国家中脑FGF8过度导致的神经前体的人口在急剧扩张的脑室区^12。 FGFs和Noggin的组合协同作用在诱导神经组织的形成，促进后神经身份^9。因此，在为期2天的神经感应步旨在引导mES细胞对神经系的运动神经元的规范的过程开始之前。

这里描述的协议是先前描述¹成立的原始协议的修改和增强。虽然运动神经元产生的时间轴是相同的，我们已经做了一些修改，以简化程序，提高运动神经元的收益。通过添加一个神经诱导分化协议的步骤，我们是能够提高分化效率从25％到50％。我们的协议提供了一个有效的方法，以丰富mES细胞衍生的运动神经元。运动神经元不能得到SMA患者和健康状况不佳的主要运动神经元从SMA的小鼠排除足够的数量，质量和纯度，这种疾病影响的蛋白质进行定量分析细胞的分离。使用这个MES细胞的协议，我们能够获得足够的权运动神经元细胞人口tity和纯度的蛋白组学的研究，以确定在脊肌萎缩症⁵影响的分子途径。