בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

1. שלב 1: עכבר גזע עובריים (MES) תרבית תאים (תזמון: 3 ימים)

1. ציפוי העיקריים עכבר fibroblasts עובריים (PMEF)

1. מעיל 4 100 מ"מ בתרבית רקמה מנות עם ג'לטין של הידבקות PMEF. הוסף 8 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1% (StemCell טכנולוגיות) לצלחת כל דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הסרת עודפי ג'לטין מן הכלים. אין לשטוף את הכלים.
3. לדלל 1 בקבוקון של mitomycin C-מומת PMEF (Millipore) המכיל כ. 5 x 10 ⁶ תאים לתוך 40 מ"ל של PMEF התקשורת (ראה מתכון טבלה 1) לבין צלחת על ארבע 100 מ"מ צלחות תרבית הרקמה. PMEF לספק שכבת מזין עבור תאים MES.
4. PMEF צריך להיות מצופה לפחות יום אחד לפני הוספת תרביות תאים MES. PMEF ניתן להשתמש עד שבוע 1 לאחר ציפוי.

2. ציפוי MES תאים

כדי לפקח על היעילות של התמיינות תאים MES אל הנוירונים המוטוריים, השתמשנו HBG3, תא ES קו נגזר עכבר מהונדס המבטא eGFP בשליטת היזם המנוע נוירון מסוים Hb9.

1. להפשיר 1 בקבוקון של HBG3 תאים MES (בערך 1 x 10 ^7, שנתרם על ידי ד"ר דאגלס קר, ג'ון הופקינס) ב C ° 37 אמבט מים. הוסף 5 מ"ל של ES התקשורת (ראה מתכון טבלה 1) בצינור 15 מ"ל ומסובב את התאים בסל"ד 800 דקות 5.
2. Aspirate supernatant ו resuspend תאים MES ב 20 מ"ל של התקשורת גזע עובריים עם גורם הוסיף טרי מעכבות לוקמיה (LiF) בריכוז סופי של 10 ng / mL. הערה: LiF יש להוסיף ביום השימוש יש צורך לשמור על התאים MES במדינה מובחן.
3. הסרה של 10 מ"ל התקשורת PMEF מ PMEF בכל צלחת ומוסיפים 10 מ"ל של השעיה ES HBG3 תא כל מאכל.
4. 24 שעות לאחר ציפוי, תאים MES ליצור מושבות קטנות, בגודל דומה המושבה שמסומן על ידי ראש חץ ב איור 1 ב. 72 שעות לאחר ציפוי, coloniגידול בגודל ES, רבים להיות כ 100 מיקרומטר קוטר (איור 1 ב, שמסומן על ידי חיצים). תאים אלו מוכנים בידול. בתקשורת יש להחליף מדי יום כדי לשמור על התרבות התאים.

2. שלב 2: השראה עצבית (תזמון: 2 ימים)

להשרות התמיינות של תאים MES אל הנוירונים המוטוריים, תאים MES צריך להיפרד PMEF, והוא גדל בסביבה ההשעיה. צלוחיות מצופה ג'לטין משמשים להפריד PMEF מתאי MES.

1. כאשר המושבות MES מוכנים אינדוקציה עצבית (כפי שמוגדר היום בידול 0), מעיל 2 T150 צלוחיות עם 0.1% ג'לטין (18 מ"ל / בקבוק) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסר ג'לטין עודף ולשטוף עם 1x PBS שלוש פעמים. הערה: כל התרבות 100 מ"מ צלחת תצטרך 1 T150-ג'לטין בקבוק מצופה להפריד PMEF.
2. מוציאים בזהירות את התקשורת על ידי שאיפה, כדי לוודא שלא לעקור מושבות המחוברים באופן רופף. הוסף 10 מ"ל PBS קצרLY ולאחר מכן הסר ידי השאיפה להשלים שלב הכביסה.
3. להפריד תאים MES מ PMEF, מוסיפים 0.25% טריפסין / EDTA (3 מ"ל / צלחת, StemCell Technologies) ו דגירה של 3-5 דק 'ב 37 ° C עד בתאי גזע PMEF להתנתק מהצלחת. הוסף 15 מ"ל טריים התקשורת גזע עובריים ותאי ללא LiF pipet למעלה ולמטה כדי לשבור המושבות (כ 15-20 פעמים). לאחר מכן, להוסיף בקבוק 0.1% T150 ג'לטין מצופה ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C. לאחר הדגירה, PMEF צריך לצרף אל פני השטח gelatinized תוך תאים ES יש צף. אוספים את התאים הצפים MES לתוך צינור 50 מ"ל.
4. ספין למטה על 800 סל"ד ותאי resuspend ב 10 מ"ל של מדיום בידול עצבית (ראה מתכון טבלה 1).
5. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ואז כ צלחת 2 x 10 ⁶ תאים MES על צלחת 100 מ"מ התרבות חיידקי או השעיה. לוחות אלו מאפשרים צמיחה של תרבויות ההשעיה ולקדם הקמת גופים embryoid (EBS).
6. על הפרשיום tion 1, תאים MES ליצור אגרגטים צף קטן (EBS) הנראים תחת מיקרוסקופ אור. כל PMEF שריד לצרף צלחת. להעביר את התאים ההשעיה ומדיה לתוך צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה במהירות נמוכה (500 סל"ד) 3 דקות. Aspirate התקשורת בזהירות, מוסיפים 10 מ"ל של מדיום חדש בידול עצבית אל EBS pelleted ולאחר מכן התאים צלחת בצלחת חיידקים חדש. בנוסף חידוש התקשורת, צעד זה מסיר כל PMEF כי לשאת על מהשלב הקודם.
7. ביום בידול 2, EBS מוכנים להיגרם אל הנוירונים המוטוריים.

3. שלב 3: Motor Neuron מפרט (תזמון: 5 ימים)

1. ביום בידול 2, לערבל את המנה התרבות ולהעביר את התקשורת EBS לתוך שפופרת 15 מ"ל. בואו EBS ליישב על ידי כוח הכבידה (~ 10 דקות) או על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (500 סל"ד) על 3 דקות.
2. Aspirate בינוני בזהירות resuspend EBS ב 10 מ"ל של התמיינות תא עצב מוטורי (MND), בינוני (ראו מתכון
3. ביום בידול 7, EBS צריך להיות כ 150 - 200 מיקרומטר בקוטר צריך להביע את אותות ה-GFP חזק (איור 1 ג). EBS אלה מוכנים להיות מנותק ולא מצופה על poly-DL-ornithine/laminin כלים מצופים או coverslips.

4. שלב 4: הכנת Coverslips מצופה Poly-DL-ornithine/laminin (תזמון: 2 ימים)

יומיים לפני מתנער EBS (כלומר ביום בידול 5), להכין coverslips poly-DL-ornithine/laminin-coated.

1. 12 מ"מ מקום עגולים coverslips וורנר (מכשירים) בחלק התחתון של צלחת של 24 באר. ממיסים 25 פולי-DL-ornithine (Sigma-Aldrich) ב 25 מ"ג מ"ל מים סטריליים, מזוקקים פעמיים (ד ₂ H ₂ O) כדי להשיג פתרון המניות 10X (1 מ"ג / מ"ל). כאשר מוכן לשימוש, לבצע דילול 1/10 של פולי-DL-ornithine עם ד ₂ H ₂ O להשיג concentמנה של 100 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף 0.5 מ"ל היטב כל צלחת 24 הבאר דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה.
2. למחרת (יום בידול 6), aspirate פולי-DL-ornithine ולתת את צלחות תלושי חיפוי אווירי יבשה מכסה המנוע בתרבית רקמה. שוטפים את בארות צלחת עם D ₂ H _{2 O} שלוש פעמים. תנו אוויר יבש עוד שעה.
3. ממיסים 1 מ"ג העכבר laminin (Millipore) ב 5 מ"ל של קר, קר 1X PBS לעשות פתרון המניות 100x (200 מיקרוגרם / מ"ל). כאשר מוכן לשימוש, להפוך את 1/100 דילול ב קר קר 1X PBS (2 מיקרוגרם laminin / ml). הוסף 0.5 מ"ל / גם בצלחת 24 גם וגם דגירה של 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. לפני זריעת תאים, laminin עודף יש להסיר בארות שטפה עם 1x PBS פעמיים. Coverslips ניתן לאחסן MND בינוני (0.5 מ"ל / טוב).

5. שלב 5: התארכות אקסון (תזמון: 2 ימים)

1. ביום בידול 7, לאסוף EBS לתוך צינור 15 מ"ל ולאפשר EBS להתיישב (כ -3 דקות). Aspirate התקשורת מחדש שלuspend EBS ב PBS. אפשר EBS להתיישב ואחר כך לשאוב PBS. חזור על פעולה זו 3 פעמים. הוסף 1 מ"ל של Accumax (Millipore) כדי EBS, בעדינות לערבב דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשאוב Accumax עודף המכסה את EBS.
2. כדי לנתק את EBS, להוסיף 3 מ"ל של מדיום MND. Pipet למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות 1 מ"ל Eppendorf micropipette (כחול בקצה) כדי לשבש את EBS. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את ההשעיה התא צינור 12x75 מ"מ עם תא מסננת שוק (BD פלקון) לקבל השעיה תא בודד. חזור על פעולה זו דיסוציאציה עם גושים ותאים הנותרים שמרו על מסנן כדי להעשיר את התשואה של תאים בודדים. ההשעיה הסופי תא בודד יהיה 6 מ"ל.
3. בעדינות מערבבים את ההשעיה תא בודד ולספור תאים באמצעות hemocytometer. לדלל את התאים לתוך MND בינוני (בתוספת 10 ng / ml של כל BDNF, GDNF, CNTF, ו NT-3) לצפיפות של 2x10 ⁵ תאים לכל מיליליטר. הוסף ההשעיה התא (0.5 מ"ל / טוב) ל 24 גם צלחות המכילות poly-DL-ornithine/laminin coverslips מצופים (שהוכן קודם לכן כמתואר לעיל). התאים הבדיל להאריך neurites זמן רב לאחר 2 ימי תרבות (1D איור).

6. נציג תוצאות

איור 1 א מציג את קווי המתאר של הפרוטוקול. בשלב 1, תאים MES מעובדות על PMEF שיושלם עם LiF למנוע התמיינות ספונטנית. באופן כללי, שלא עברו התמיינות מושבות MES עגולות קומפקטית, הגדירו באופן ברור הקצוות. המושבות אינם בקשר זה עם זה. בדרך כלל, בתאי MES יש פיצול ביחס של 1:4 כל 2 ~ 3 ימים. עם זאת, כל שורה התא היחיד יגדל בקצב שונה יחס הפיצול צריכה להיקבע באופן אמפירי. החצים מצביעים על תרשים 1 ב את המראה האופייני של תאים MES לאחר culturing על שכבת מזין PMEF במשך 3 ימים. מושבות אלה הן גדולות (50-100 מיקרומטר קוטר), אך עדיין לשמור על היתרון עגול מוגדרs. בשלב זה המושבות מוכנים בידול או תת. ראש חץ ב 1B איור מראה המושבה הקטנה MES, כי אתה בדרך כלל למצוא 24 שעות לאחר ציפוי. ארבעה ימים לאחר ציפוי, תאים MES להיות מגודל. הם מראים מראה שטוח ואובדן גבולות מוגדרים, המעיד על כך שהם מתחילים להבחין. תאים אלה אינם אופטימליים עבור בידול לתאים עצביים.

להבדיל תאים MES אל הנוירונים המוטוריים, תאים MES צריך לטפח בתנאי ההשעיה כדי לאפשר היווצרות EB. בשלב 2, בתאי גזע עובריים מועברים על גבי משטח תרבות ללא שכבת מזין לקדם הקמת EB. בשלב זה, הם מודגרות במדיום בידול עצבית להשלים עם ספלון, bFGF, ו FGF-8 ל -2 ימים לתאי ישירים שושלת עצבית. קטן EBS ניתן לראות תחת מיקרוסקופ על יום 1 של בידול. הם צריכים להיות מרחפת בתווך. שריד PMEF ניתן למצוא גם ביום 1בידול ויש להסירו. תאים אלה לדבוק מנות חיידקים כך בוטלו כאשר EBS הם passaged לצלחת חיידקי חדש. לפיכך, ביום 2 של בידול, PMEF מעטים, אם בכלל יש לראות בכלי התרבות. בשלב 3, המשיך העברת EBS על מנות חדשות להבטיח הסרת PMEF כל הנותר. EBS מתורבתים במנוע נוירונים (MND) התקשורת בידול השלימו עם RA ו לשקוע במשך 5 ימים כדי לבדל את התאים לתוך הנוירונים המוטוריים. במהלך התרבות, EBS ממשיכים לגדול בגודל שניתן לראות בעין בלתי מזוינת ביום בידול 3 ~ 4. איור 1 ג מראה מראה מיקרוסקופית של EBS ביום בידול 7. שלא כמו תאים שלא עברו התמיינות, EBS להראות הקרינה חזקה בשל הביטוי של ה-GFP. EBS אלה מובחנים בצורה אופטימלית והם מוכנים דיסוציאציה. Cytometry זרימת הראה כי 51% ± 0.8% מכלל התאים של EBS ניתק לא הבדיל את ה-GFP לבטא בתאי ^5. ב 5 אחר צעד, תרבות הדרום הנוירונים המוטוריים בנוכחות GDNF, CNTF, BDNF, ו NT3 תוצאות הרחבה של תחזיות axonal ארוכים. 1D איור מראה את המראה של תאים הבדיל 2 ימים לאחר ציפוי של EBS ניתק. הערה neurites ארוכות המשתרעות על גופי התא של התאים המצופים. מכתים Immunofluorescent עולה כי + תאים GFP לבטא את הסמן פאן העצבית (neurofilament בינוני שרשרת) ושני מנועי סמנים נוירונים ספציפיים (איילט-1 ו כולין acetyltransferase, איור 2).

באיור 1. התמיינות של תאים MES אל הנוירונים המוטוריים (תמונה שונה מ וו et al. ^5). א) תוכנית לפרוטוקול התמיינות מתאי MES אל הנוירונים המוטוריים. ב) שלא עברו התמיינות תאים MES ליצור מושבות עגולות על גבי שכבת מזין פיברובלסטים. יש להם ביטוי של GFP חלש. ג) תאים MES הופרדו שכבות מזין cultuאדום נמוך מצורפים כלים ליצירת EBS. במהלך היומיים הראשונים של תהליך התמיינות, התאים נחשפו 50 ng / ml noggin, 20 ng / ml bFGF, ו 20 ng / ml FGF-8. לאחר מכן, הם גרמו להבדיל עם חומצה רטינואית 1 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר סוניק הקיפוד SAG אגוניסט במשך 5 ימים. הבדיל תאים MES הביע GFP הקרינה חזקה. ד) לאחר התמיינות 7 ימים, היו EBS ניתק והוא מצופה בלוחות מצופים poly-DL-ornithine/laminin. התאים הבדיל הוארך תהליכים עצביים ארוכים אחרי 2 ימים בתרבות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. MN = נוירון מוטורי. B, C ו-D הם תמונות שדה בהירים ב ', ג'ו - ד' הם תמונות הקרינה המתאימים.

איור 2. אפיון MES תא הנגזרות הנוירונים המוטוריים. מכתים immunofluorescence לרשת neurofilament בינוני (NF-M, אדום), דברו (אדום), ואת איילט-1 (אדום) היה ביחד עם ה-GFP (ירוק) expression. DAPI (כחול) היה בשימוש כדי לזהות את הגרעינים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

איכות התאים MES הוא הפרמטר הקריטי ביותר עבור הדור יעיל של הנוירונים המוטוריים. תאים MES יש לטפח על PMEF למנוע התמיינות ספונטנית. תוספת של LiF מסייע לשמור על התאים MES במדינה מובחן. ככל שהתאים מתחלקים MES כל 12-15 שעות, בינוני התרבות הופכת תיגמר במהירות יש להחליף מדי יום.

הפעלה יעילה של מסלול ששש הוא פרמטר קריטי צריך לגרום מפרט המנוע נוירון. חלבון ששש (מו"פ מערכת), ו אגוניסטים איתות ששש כמו אגוניסט HH HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem), ו SAG (כימיקלים EMD) כולם נעשה שימוש כדי לקדם את הקמתה של המנוע נוירונים ^{1-3 , 10,11.} מצאנו לשקוע להיות יעיל יותר מאשר מולקולה purmorphamine ב להבדיל תאים כלפי פנוטיפ מנוע העצבית ^5. 1-2.5 מיקרומטר purmorphamine עם 1 מיקרומטר RA אף פעם לא נתן יעילות בידול של יותר מ -20%. אולםבידינו שילוב של 1 מיקרומטר של RA ו -1 מיקרומטר של SAG נתן יעילות בידול של כ 25% בפרוצדורות ללא צעד אינדוקציה עצבית.

כדי לשפר עוד יותר את יעילות בידול, נוסיף בשלב 2 ימים לפני הגיוס עצבית לשלב את מפרט המנוע נוירון. גישה זו מנצלת את העובדה כי הן noggin ואותות FGF הם קריטיים עבור שלב מוקדם של השראה עצבית כאשר תאים עובריים 1 להזין את השושלת עצבית ^6-9. בנוסף השראה עצבית, FGF איתות שומרת תרבויות כמו תאים מבשר עצביים. ביטוי יתר של המוח התיכון Fgf8 ב המתפתח מוביל הרחבה דרמטית של האוכלוסייה מבשר העצבית באזור חדרית ^12. שילוב של FGFs ו noggin פועל בסינרגיה של גרימת היווצרות רקמה עצבית באמצעות קידום הזהות עצבית האחורי ^9. כך צעד 2 ימים אינדוקציה עצבית נועד לכוון את התאים MES כלפישושלת עצבית לפני תחילת תהליך של מפרט נוירון מוטורי.

פרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי ושיפור של פרוטוקול הוקמה המקורי תיאר בעבר ^1. אף על פי ציר הזמן של יצירת נוירונים המנוע זהה, עשינו מספר שינויים כדי לייעל את התהליך ולשפר את התשואה של הנוירונים המוטוריים. על ידי הוספת שלב הגיוס עצבית לפרוטוקול בידול, אנו יכולים להגביר את היעילות בידול בין 25% עד 50%. פרוטוקול שלנו מספקת גישה יעילה להעשיר את הנוירונים המוטוריים שמקורם בתאי MES. הנוירונים המוטוריים לא ניתן לקבל חולים SMA ו בריאות לקויה של הנוירונים המוטוריים העיקריים של עכברים SMA מונע בידוד של תאים באיכות מספקת כמות, וטוהר לבצע ניתוחים כמותיים של חלבונים המושפעים במחלה זו. שימוש בפרוטוקול תא MES, הצלחנו לקבל תא הנוירון המוטורי אוכלוסיית קוואן מספיקtity וטוהר לחקר proteomic לזהות מסלולים מולקולריים שנפגעו ב ניוון שרירים ^5.