Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

1. Шаг 1: мышь эмбриональных стволовых (ЭСК) культуры клеток (сроки: 3 дня)

1. Нанесение первичного эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ)

1. Пальто четыре 100-мм культуры тканей блюда с желатином для адгезии ПМЭФ. Добавить 8 мл 0,1% раствора желатина (StemCell технологий) для каждого блюда и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
2. Удалите излишки желатина из блюд. Не ополаскивать посуду.
3. Развести один флакон Митомицин С инактивированной ПМЭФ (Millipore), который содержит ок. 5 х 10 ⁶ клеток в 40 мл ПМЭФ средства массовой информации (см. рецепт в Таблице 1) и пластины на четыре 100-мм блюда культуре ткани. ПМЭФ обеспечить фидерного слоя для ЭСК.
4. ПМЭФ должны быть покрыты по крайней мере один день, прежде чем добавлять культуры ЭСК клетки. ПМЭФ может быть использовано до 1 недели после покрытия.

2. Покрытие ЭСК клетки

Для контроля эффективности клеточной дифференцировки ЭСК в моторные нейроны, Мы использовали HBG3, линия ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9.

1. Размораживание 1 флакон HBG3 ЭСК (примерно 1 х 10 ^7, способствовал д-р Дуглас Керр, Johns Hopkins University) в 37 ° С на водяной бане. Добавить 5 мл ES СМИ (см. рецепт в таблице 1) в 15 мл трубку и спином вниз клеток на 800 оборотов в минуту в течение 5 мин.
2. Аспирата супернатант и ЭСК клетки ресуспендируют в 20 мл среды ES с недавно добавила Лейкемия тормозной фактор (LIF) в конечной концентрации 10 нг / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: LIF должна быть добавлена ​​в день использования и обязаны поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние.
3. Удалить 10 мл ПМЭФ средств массовой информации в ПМЭФ в каждом блюде и добавьте 10 мл клеточной суспензии HBG3 ES в каждом блюде.
4. 24 ч после покрытия, МЧС клетки образуют небольшие колонии, похожие по размеру колонии указано стрелкой на рисунке 1b. 72 ч после покрытия, колоныэс увеличиваются в размерах, многие из которых около 100 мкм в диаметре (рис. 1В, показаны стрелками). Эти клетки готовы к дифференциации. СМИ должны быть заменены ежедневно для поддержания пролиферации клеток.

2. Шаг 2: Нейронные индукционные (Время проведения: 2 дня)

Чтобы стимулировать дифференцировку клеток ЭСК в моторные нейроны, ЭСК клетки должны быть отделены от ПМЭФ и культивировали в суспензии окружающей среды. Желатин покрытием колбы, используемый для разделения ПМЭФ из ЭСК.

1. Когда колонии ЭСК готовы к индукции нервной (определяемых как дифференциация день 0), 2 слой T150 колбы с 0,1% желатина (18 мл / колбы) в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем удалить излишки желатин и промыть 1x PBS в три раза. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый 100-мм блюдо культуры понадобится один-T150 желатин покрытием колбы отделить ПМЭФ.
2. Осторожно снимите СМИ стремление, следя, чтобы не выбить свободно прилагается колонии. Добавить 10 мл PBS краткиеют, а затем удалить стремлением завершить мыть шаг.
3. Чтобы отделить ЭСК клетки ПМЭФ, добавить 0,25% трипсин / ЭДТА (3 мл / блюдо, StemCell технологий) и инкубировать в течение 3-5 мин при температуре 37 ° C до стволовых клеток и ПМЭФ оторваться от плиты. Добавить 15 мл свежей среды ES без LIF и пипетки клетки вверх и вниз, чтобы сломать колоний (15-20 раз). Затем добавить 0,1% желатином покрытием колбы T150 и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C. После инкубации ПМЭФ должны приложить к поверхности, а желатинизированный ЭС клетки должны быть плавающим. Собери плавающих ЭСК в 50 мл трубку.
4. Спином вниз со скоростью 800 оборотов в минуту и ресуспендирования клеток в 10 мл нейронных среднего дифференциации (см. рецепт в таблице 1).
5. Подсчитайте клеток с использованием гемоцитометра а затем пластина примерно 2 х 10 ^{6 MES} клеток на 100-мм бактериальной или суспензионной культуре блюдо. Эти плиты позволяют роста суспензионных культур и способствовать формированию эмбриоидные тела (ЭТ).
6. На дифференциацииТион день 1 ЭСК клетки образуют небольшие плавающие агрегаты (EBS), которые видны под световым микроскопом. Любой перенос ПМЭФ придают блюду. Передача суспензии клеток и средств массовой информации в 15 мл и трубы центрифуги на низкой скорости (500 оборотов в минуту) в течение 3 мин. Аспирируйте СМИ тщательно, добавить 10 мл свежего нейронных среднего Дифференциация в гранулированной EBS, а затем пластина клеток в новые бактериальные блюдо. В дополнение к пополнению средств массовой информации, этот шаг снимает любую ПМЭФ, что перенести из предыдущего шага.
7. О разграничении день 2, ЭТ готовы быть вызван в моторные нейроны.

3. Шаг 3: Спецификация двигательных нейронов (сроки: 5 дней)

1. О разграничении 2-й день, вихревые культуры блюдо и передачи информации и ЭТ в 15 мл трубку. Пусть ЭТ поселиться под действием силы тяжести (~ 10 мин) или путем центрифугирования на низкой скорости (500 оборотов в минуту) в течение 3 мин.
2. Аспирируйте среднего тщательно и ресуспендируют ЭТ в 10 мл дифференциации двигательных нейронов (БДН) среды (см. рецепт в
3. О разграничении день 7 ЭТ должна быть примерно 150 - 200 мкм в диаметре и должна выражать сильные сигналы GFP (рис. 1в). Эти ЭТ готовы быть отделена и покрытием на poly-DL-ornithine/laminin покрытие посуды и покровные.

4. Шаг 4: Подготовка Poly-DL-ornithine/laminin покрытием Покровные (Время проведения: 2 дня)

За два дня до диссоциации ЭТ (т.е. дифференциация 5-й день), готовить poly-DL-ornithine/laminin-coated покровные.

1. Место 12-мм выстрел покровные (Warner Instruments) в нижней части 24-луночного планшета. Растворите 25 мг поли-DL-орнитин (Sigma-Aldrich) в 25 мл стерильной дважды дистиллированной воде (D ₂ H ₂ O), чтобы получить 10X маточного раствора (1 мг / мл). Когда все будет готово для использования, чтобы 1/10 разведения поли-DL-орнитин с D ₂ H ₂ O для получения концентрациямирацион 100 мкг / мл. Добавить 0,5 мл в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируют при температуре 4 ° С ночью.
2. На следующий день (дифференциация 6-й день), аспирации поли-DL-орнитин и пусть плиты и крышки скользит сухой воздух в капюшоне культуре ткани. Промыть пластины скважин с D ₂ H ₂ O в три раза. Пусть воздух сухой еще час.
3. Растворите 1 мг мыши ламинин (Millipore) в 5 мл ледяной холодной 1X PBS, чтобы 100x маточного раствора (200 мкг / мл). Когда все будет готово для использования, чтобы 1/100 разведения в ледяной холодной 1X PBS (2 мкг ламинин / мл). Добавить 0,5 мл / лунку в 24-луночного планшета и инкубировать в температуре 4 ° С ночью. Перед посевом клеток, избыток ламинин должны быть удалены и колодцев промыты 1X PBS в два раза. Покровные стекла могут быть сохранены в МНД среды (0,5 мл / лунку).

5. Шаг 5: Axon удлинение (Время проведения: 2 дня)

1. О разграничении 7 дней, собрать ЭТ в 15 мл трубки и позволяют решить ЭТ (около 3 мин). Аспирата СМИ и повторно сuspend ЭТ в PBS. Позвольте ЭТ отстояться и потом вдохнуть PBS. Повторите этот шаг в 3 раза. Добавить 1 мл Accumax (Millipore) в ЭТ, осторожно перемешать и выдержать в течение 5 мин при комнатной температуре. После аспирации избыточного Accumax покрытие EBS.
2. Чтобы отделить EBS, добавить 3 мл среды МНД. Внесите вверх и вниз 20 раз, с использованием 1 мл Eppendorf микропипетки (синий кончик), чтобы сорвать EBS. Выдержите в течение 2 мин при комнатной температуре. Передача клеточной суспензии для 12x75 мм труба с крышкой ячейки фильтра (BD Falcon) для получения суспензии отдельных клеток. Повторите этот шаг диссоциации с остальными и сгустки клеток сохраняется фильтр таким образом, чтобы обогатить выход отдельных клеток. Окончательный суспензии отдельных клеток будет 6 мл.
3. Аккуратно перемешайте этой суспензии отдельных клеток и подсчета клеток с использованием гемоцитометра. Развести клеток в МНД среды (с добавлением 10 нг / мл каждого BDNF, GDNF, CNTF и NT-3) плотностью 2x10 ⁵ клеток на миллилитр. Добавить клеточной суспензии (0,5 мл / лунку) в 24-луночных содержащие Роly-DL-ornithine/laminin покрытием покровные (ранее полученного, как описано выше). Дифференцированных клеток продлить долго невриты через 2 дня в области культуры (рис. 1D).

6. Представитель Результаты

Рисунок 1А показывает схему протокола. На шаге 1, ЭСК клетки культивируют на ПМЭФ и дополнены LIF для предотвращения спонтанной дифференцировки. В общем, недифференцированные ЭСК колонии круглые и компактные, и четко определены края. Колонии не находятся в контакте друг с другом. Как правило, ЭСК клетки должны быть разделены в соотношении 1:4 каждые 2 ~ 3 дня. Тем не менее, каждая клеточная линия будет расти с разной скоростью и коэффициенту распределения должен быть определен эмпирически. Стрелки на рисунке 1b показывают типичное появление ЭСК после культивирования на слой ПМЭФ подачи в течение 3 дней. Эти колонии крупные (50-100 мкм в диаметре), но по-прежнему поддерживать круглые и определены краяс. На этом этапе колонии готовы к дифференциации или субкультуры. Стрелка на рисунке 1b показывает небольшую колонию ЭСК, которые обычно находят через 24 ч после покрытия. Через четыре дня после покрытия, ЭСК клетки обрастают. Они показывают, плоский вид и потеря определенных границах, о том, что они начинают дифференцироваться. Такие клетки не являются оптимальными для дифференцировки в нервные клетки.

Чтобы дифференцировать ЭСК клетки в моторные нейроны, клетки ЭСК необходимо культивировать в суспензии, условия, позволяющие EB образования. В шаге 2, ЭС клетки переносятся на культуру поверхность без фидерного слоя содействовать EB образования. На этом этапе они инкубируют в нейронных среднего Дифференциация дополнить Noggin, bFGF и FGF-8 в течение 2 дней в прямом клеток нейронной линии. Малый ЭТ можно наблюдать под микроскопом на 1-й день дифференциации. Они должны быть плавающие в среду. Перенос ПМЭФ также можно найти на 1-й деньдифференциации и должны быть удалены. Эти клетки придерживаются бактериальных блюда так устраняются при ЭТ являются пассировать на новый бактериальный блюдо. Таким образом, 2-й день дифференциации, мало или совсем нет ПМЭФ следует рассматривать в культуре блюдо. На шаге 3, продолжение передачи ЭТ новые блюда должны обеспечить устранение любых оставшихся ПМЭФ. ЭТ культивировали в дифференциации двигательных нейронов (БДН) среде с РА и НКГ в течение 5 дней, чтобы дифференцировать клетки в моторные нейроны. В культуре, ЭТ продолжают расти в размерах и можно увидеть невооруженным глазом в дифференциации день 3 ~ 4. Рисунок 1С показывает микроскопических появление ЭТ на дифференциацию 7-й день. В отличие от недифференцированных клеток, EBS показывают сильную флуоресценцию в связи с выражением GFP. Эти ЭТ оптимально дифференцированной и готовы к диссоциации. Проточная цитометрия показала, что 51% ± 0,8% клеток из диссоциированных ЭТ были дифференцированы в GFP экспрессирующие клетки ^5. В пункте 5, культура йесе моторных нейронов в присутствии GDNF, CNTF, BDNF и NT3 результатов в расширении долго аксонального прогнозы. Рисунок 1D показывает появление дифференцированных клеток через 2 дня после покрытия диссоциированных EBS. Обратите внимание, долго невриты простирается от клеточных тел покрытием клеток. Иммунофлуоресцентного окрашивания показывает, что GFP + клеток выразить пан-нейронов маркер (нейрофиламентов среднего цепи) и двух двигательных нейронов специфических маркеров (остров-1 и холинацетилтрансферазы, рисунок 2).

Рисунок 1. Дифференциация ЭСК в моторные нейроны (картинка изменилась с Wu и соавт. ^5). А) схема дифференциации протокол от ЭСК клетки моторных нейронов. B) Недифференцированная ЭСК из круглых колоний в верхней части слоя подачи фибробластов. Они имеют слабое выражение GFP. C) ЭСК клетки были отделены от подачи слоев и cultuкрасный с низким уровнем вложений блюд для формирования ЭТ. В течение первых двух дней процесса дифференцировки, клетки подвергали воздействию 50 нг / мл Noggin, 20 нг / мл bFGF и 20 нг / мл FGF-8. Впоследствии они были вынуждены дифференцировать с 1 мкМ ретиноевой кислоты и 1 мкМ звуковой еж агонист SAG в течение 5 дней. Дифференцированных ЭСК решительно флуоресценции GFP. D) После 7-дневного дифференциации ЭТ были диссоциированы и покрытием на poly-DL-ornithine/laminin покрытие пластин. Дифференцированных клеток продолжительного нервных процессов, через 2 дня в области культуры. Шкала бар = 200 мкм. MN = двигательных нейронов. B, C и D являются яркие образы поля и B, C и D являются соответствующие флуоресцентные изображения.

Рисунок 2. Характеристика ЭСК клеточных производных моторных нейронов. Иммунофлуоресценции для окрашивания нейрофиламентов средней цепью (NF-M, красный), ЧАТ (красный), и остров-1 (красный) был совпадают с GFP (зеленый) выражениеession. DAPI (синий) был использован для идентификации ядер. Шкала бар = 50 мкм.

Качество ЭСК является наиболее важным параметром для эффективного производства моторных нейронов. ЭСК клетки должны быть выращены на ПМЭФ для предотвращения спонтанной дифференцировки. Добавление LIF помогает поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние. Как ЭСК клетки делятся каждые 12-15 ч, культуральной среде истощаются быстрее и должны быть заменены в день.

Эффективное активации Тсс путь является критическим параметром, необходимые для индуцирования двигательных нейронов спецификации. Тсс белка (R & D System), и Тсс сигнализации агонисты, такие как Hh агонист HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem) и SAG (EMD Chemicals) все были использованы для содействия формированию моторных нейронов ^{1-3 , 10,11.} Мы обнаружили, НКГ, чтобы быть более эффективным, чем молекулы purmorphamine в дифференциации клеток на двигатель нейронов фенотип ^5. 1 - 2,5 мкм purmorphamine с 1 мкМ РА никогда не давал дифференциации эффективность более чем на 20%. Однаков наших руках комбинация 1 мкМ РА и 1 мкМ SAG дал дифференциации эффективность примерно на 25% в процедурах без нейронной индукции.

Для дальнейшего повышения эффективности дифференциации, мы добавляем 2-дневный нервный индукции до спецификации шаг двигательных нейронов. Такой подход имеет преимущество в том, что оба Noggin и FGF сигнализации имеют решающее значение для ранней стадии индукции нервной, когда эмбриональные клетки сначала ввести нервные линии ^6-9. В дополнение к индукции нервной, FGF сигнализации поддерживает культуру как нейронные клетки-предшественники. Избыточная Fgf8 в развивающемся мозге приводит к резкому расширению нейронные популяции предшественников в желудочковой зоны ^12. Сочетание FGFs и Noggin действует синергически в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронных личности ^9. Таким образом, 2-дневный нейронной индукции предназначена направить ЭСК клетки кнейронных линии до начала процесса спецификации моторных нейронов.

Протокол, описанный здесь, представляет собой модификацию и расширение оригинального создан протокол, описанный ранее ^1. Хотя сроки получения моторных нейронов то же самое, мы сделали ряд изменений для упрощения процедуры и повышения выхода моторных нейронов. При добавлении нейронной индукции к дифференциации протокол, мы можем увеличить дифференциацию эффективности от 25% до 50%. Наш протокол обеспечивает эффективный подход к обогащению моторные нейроны, полученные из ЭСК. Моторные нейроны не могут быть получены из SMA пациентов и плохое состояние здоровья первичных двигательных нейронов от мышей SMA исключает выделение клеток достаточное количество, качество и чистота выполнения количественного анализа белков затронуты этим заболеванием. Используя этот протокол ЭСК клетки, мы смогли получить клетки двигательных нейронов населения достаточно квантовойTity и чистоты для протеомных исследований для определения молекулярных путей, пострадавших в спинальной мышечной атрофией ^5.