Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

1. Passo 1: Mouse Embryonic Stem Cultura de Células (MES) (Timing: 3 dias)

1. Plating primárias embrionárias fibroblastos de rato (PMEF)

1. Revestimento quatro 100-mm de tecido pratos de cultura com a gelatina, para adesão PMEF. Adicionar 8 ml de 0,1% de solução de gelatina (StemCell Technologies) a cada prato e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
2. Retirar o excesso de gelatina a partir de pratos. Não lave os pratos.
3. Diluir um frasco de Mitomicina C-inactivado PMEF (Millipore) que contém aprox. 5 x 10 ⁶ células em 40 ml de PMEF meios (ver receita na Tabela 1) ea placa para quatro 100-mm pratos de cultura de tecidos. O PMEF proporcionar uma camada alimentadora de células MES.
4. PMEF deve ser revestida pelo menos um dia antes da adição de culturas de células de MES. PMEF pode ser usada até 1 semana após o plaqueamento.

2. Cultivo de células MES

Para monitorizar a eficiência do MES diferenciação celular em neurónios motores, Utilizou-se HBG3, uma linha de células ES derivado de um ratinho transgénico expressando eGFP sob o controlo do promotor de neurónio motor específico Hb9.

1. Degelo 1 frasco de HBG3 células MES (aprox. 1 x 10 ^7, pelo Dr. Douglas Kerr, da Universidade Johns Hopkins), em banho-maria a 37 ° C. Adicionar 5 ml de meios ES (ver receita na Tabela 1) em um tubo de 15 ml e girar para baixo células a 800 rpm durante 5 min.
2. Aspirar o sobrenadante e Ressuspender as células MES em 20 ml de meio recém-acrescentado ES com factor de Leucemia inibitória (LIF), a uma concentração final de 10 ng / ml. NOTA: LIF deve ser adicionado no dia da utilização e é necessária para manter as células MES em um estado indiferenciado.
3. Remover 10 ml de meio PMEF a partir do PMEF em cada prato e adicionar 10 ml da suspensão de células ES HBG3 para cada prato.
4. 24 h após o plaqueamento, as células de MES formar colónias pequenas, semelhantes em tamanho para a colónia indicado pela seta na Figura 1B. 72 h após o plaqueamento, Coloniaumento es em tamanho, muitos sendo de aproximadamente 100 um de diâmetro (Figura 1B, indicado pelas setas). Estas células estão prontas para a diferenciação. Os meios devem ser substituídos por dia para manter a proliferação de células.

2. Passo 2: Indução Neural (Timing: 2 dias)

Para induzir a diferenciação de células de MES em neurónios motores, as células de MES precisam de ser separado do PMEF e cultivado em um ambiente de suspensão. Gelatina frascos revestidos são utilizados para separar PMEF a partir de células de MES.

1. Quando as colónias MES estão prontos para a indução neural (definido como o dia diferenciação 0), o revestimento 2 T150 frascos com 0,1% de gelatina (18 ml / balão) durante 30 min à temperatura ambiente e depois remover o excesso de gelatina e lavar com PBS 1X três vezes. NOTA: Cada cultura prato de 100 mm vai precisar de um balão T150-gelatina revestido para separar PMEF.
2. Cuidadosamente remova a mídia por aspiração, tomando cuidado para não desalojar colônias frouxamente conectados. Adicionar 10 ml breve PBSly e remova por aspiração para concluir a etapa de lavagem.
3. Para separar as células de MES a partir de PMEF, adicionar 0,25% de tripsina / EDTA (3 ml / prato, StemCell Technologies) e incubar durante 3-5 min a 37 ° C até que as células-tronco e PMEF destacar a partir da placa. Adicionar 15 ml de meio ES frescos sem LIF e células de pipeta para cima e para baixo para quebrar colônias (cerca de 15-20 vezes). Em seguida, adicionar a uma 0,1% de gelatina revestido T150 balão e incubar durante 30 min a 37 ° C. Após a incubação, PMEF deve anexar à superfície gelatinizada, enquanto as células-tronco embrionárias devem estar flutuando. Recolher as células flutuantes MES para um tubo de 50 ml.
4. Girar para baixo a 800 rpm e Ressuspender as células em 10 ml de Meio de Diferenciação Neural (ver receita na Tabela 1).
5. Contar as células utilizando um hemocitómetro e, em seguida, placa aproximadamente 2 x 10 ⁶ células MES para um prato de cultura de 100 mm bacteriana ou suspensão. Estas placas de permitir o crescimento de culturas em suspensão e promover a formação de corpos embrióides (EBS).
6. Em diferenciaçãoção dia 1, as células de MES formar pequenos agregados flutuantes (EBS) que são visíveis sob um microscópio de luz. Qualquer PMEF transição anexar ao prato. Transferir as células em suspensão e meios de comunicação para um tubo de 15 ml e centrifugar a baixa velocidade (500 rpm) durante 3 min. Aspirar meios cuidadosamente, adicionar 10 ml de Meio fresco Diferenciação Neural ao EBS peletizadas e, em seguida células da placa em um prato de novo bacteriana. Além disso para reabastecer os meios de comunicação, este passo remove qualquer PMEF que carregam a partir do passo anterior.
7. No dia 2 diferenciação, EBs está pronto para ser induzido em neurónios motores.

3. Passo 3: Motor Neuron Especificação (Cronograma: 5 dias)

1. No dia 2 de diferenciação, redemoinho da placa de cultura e transferir os meios de comunicação e EBS em um tubo de 15 ml. Deixe EBs resolver por gravidade (~ 10 min) ou por centrifugação a baixa velocidade (500 rpm) durante 3 min.
2. Aspirar cuidadosamente médio e ressuspender EBs em 10 ml de Motor Neuron Diferenciação (MND), média (ver receita em
3. No dia 7 diferenciação, EBS deve ser de aproximadamente 150 a 200 um de diâmetro e deve expressar sinais fortes GFP (Figura 1C). Estes EBs está pronto para ser dissociada e banhado em poly-DL-ornithine/laminin pratos revestidos ou lamelas.

4. Etapa 4: Preparação de Poly-DL-ornithine/laminin Lamelas revestidos (Timing: 2 dias)

Dois dias antes dissociar EBs (ou seja, no dia diferenciação 5), preparar as lamínulas poly-DL-ornithine/laminin-coated.

1. Lamelas lugar 12-mm de diâmetro (Warner Instruments) no fundo de uma placa de 24 cavidades. Dissolve-se 25 mg de poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) em 25 ml estéril, água bidestilada (d _{2 H2O)} para se obter uma solução-mãe 10X (1 mg / ml). Quando pronto para usar, fazer uma diluição 1/10 de poli-DL-ornitina com d _{2 H2O} para se obter concentração de 100 ug / ml. Adicionar 0,5 ml a cada poço da placa de 24 poços e incubar a 4 ° C durante a noite.
2. No dia seguinte (dia diferenciação 6), aspirado poli-DL-ornitina e deixar as placas e de ar de tampa desliza seco em uma capa de cultura de tecidos. Lavar os poços da placa com d _{2 H2O} três vezes. Deixar o ar seco durante mais uma hora.
3. Dissolve-se 1 mg rato laminina (Millipore) em 5 ml de gelado a frio 1X PBS para fazer a solução de estoque de 100x (200 ug / ml). Quando pronto para usar, fazer 1/100 de diluição em gelada-fria PBS 1X (2 ug laminina / ml). Adicionar 0,5 ml / poço numa placa de 24 poços e incubar em 4 ° C durante a noite. Antes de células de semeadura, laminina excesso deve ser removido e os poços lavados com PBS 1X duas vezes. Lamelas podem ser armazenados em MND médio (0,5 ml / poço).

5. Passo 5: Alongamento Axon (Timing: 2 dias)

1. No dia 7 diferenciação, recolher EBs para um tubo de 15 ml e permitir EBS para resolver (aproximadamente 3 min). Aspirado meios de comunicação e re-suspend EBs em PBS. Permitir EBs para resolver e, em seguida, aspirar PBS. Repetir este passo 3 vezes. Adicionar 1 ml de Accumax (Millipore) para o EBS, suavemente misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, aspirar Accumax excesso cobrindo o EBS.
2. Para dissociar EBs, adicionar 3 ml de meio de MND. Pipeta cima e para baixo 20 vezes usando uma micropipeta Eppendorf 1 ml (azul ponta) para romper EBs. Incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente. Transferir suspensão de células para um tubo de milímetro 12x75 com célula de coador tampa (BD Falcon) para se obter uma suspensão de células individuais. Repetir este passo de dissociação com tufos restantes e células retidas pelo filtro, de modo a enriquecer o rendimento de células individuais. A suspensão celular final única será 6 ml.
3. Misturar cuidadosamente esta suspensão de células individuais e contar as células utilizando um hemocitómetro. Diluir as células em meio de MND (suplementado com 10 ng / ml de cada BDNF, GDNF, CNTF, e NT-3) a uma densidade de 2x10 células por ⁵ ml. Adicionar a suspensão de células (0,5 ml / poço) para placas de 24 poços contendo polamelas ly-DL-ornithine/laminin revestidos (previamente preparado como descrito acima). As células diferenciadas estender neurites longas após 2 dias em cultura (Figura 1D).

6. Os resultados representativos

A Figura 1A mostra um esboço do protocolo. No passo 1, as células são cultivadas em MES PMEF e suplementado com LIF para impedir a diferenciação espontânea. Em geral, as colônias indiferenciadas MES são redondos e compactos, e definiram claramente bordas. As colónias não estão em contacto um com o outro. Tipicamente, as células de MES deve ser dividida em uma razão de 1:4 a cada 2 ~ 3 dias. No entanto, cada linha de células indivíduo vai crescer a uma taxa diferente e da razão de separação devem ser determinadas empiricamente. As setas na Figura 1B indicar a aparência típica de células MES após a cultura em uma camada de alimentador PMEF durante 3 dias. Estas colônias são grandes (50-100 m de diâmetro), mas ainda manter a ponta redonda e definidoss. Nesta fase as colónias estão prontos para a diferenciação ou subcultura. Uma ponta da flecha na Figura 1B mostra uma colônia MES pequena que você costuma encontrar 24 h após o plaqueamento. Quatro dias após o plaqueamento, as células tornam-se MES overgrown. Eles mostram uma aparência achatada e perda dos limites definidos, indicando que eles estão começando a diferenciar. Essas células não são ideais para diferenciação em células neuronais.

Para diferenciar células MES em neurónios motores, as células de MES precisam ser cultivados em condições de suspensão para permitir a formação EB. No passo 2, as células ES são transferidos para uma superfície de cultura sem uma camada alimentadora para promover a formação de EB. Neste passo, são incubadas em meio suplementado com Diferenciação Neural Noggin, bFGF, e FGF-8 durante 2 dias para as células directos para uma linhagem neuronal. Pequeno EBS pode ser observado ao microscópio no dia 1 de diferenciação. Eles devem estar flutuando no meio. Esta transição PMEF também pode ser encontrada em dia 1de diferenciação e deve ser removido. Estas células aderir aos pratos bacterianas modo são eliminados quando EBS são passadas para um prato de novo bacteriana. Assim, por dia 2 de diferenciação, PMEF poucos ou não deve ser vista no prato de cultura. No passo 3, continuou transferência de EBS para novos pratos deve assegurar a remoção de qualquer PMEF restante. EBS são cultivadas em Motor Neuron de Diferenciação (MND) meios suplementados com AR e SAG durante 5 dias para diferenciar as células em neurónios motores. Durante a cultura, as EBs continuar a crescer em tamanho e pode ser visto a olho nu no dia diferenciação 3 ~ 4. Figura 1C mostra a aparência microscópica de EBS em dia diferenciação 7. Ao contrário das células indiferenciadas, EBs mostram forte fluorescência devido à expressão da GFP. Estes EBs são perfeitamente diferenciados e estão prontos para a dissociação. A citometria de fluxo demonstrou que 51% ± 0,8% das células a partir da EBs dissociado tinha diferenciadas em células que expressam GFP ^5. No passo 5, a cultura de thneurónios ese motor na presença de GDNF, CNTF, BDNF, NT3 e resulta em extensão de longos projecções axonal. A Figura 1D mostra o aparecimento de células diferenciadas 2 dias após o plaqueamento da EBS dissociados. Observação neurites longas que se estendem a partir dos corpos celulares das células chapeados. Coloração imunofluorescente mostra que a GFP + de células expressam o marcador pan-neuronal (neurofilamento de cadeia média), e dois marcadores neuronais específicas a motor, (Islet-1 e de colina-acetiltransferase, a Figura 2).

Figura 1. Diferenciação das células MES em neurónios motores (figura modificado a partir do Wu et al. ^5). A) Esquema do protocolo de diferenciação das células MES para os neurônios motores. B) As células indiferenciadas MES formar colónias redondas sobre o topo de uma camada alimentadora de fibroblastos. Eles têm fraca expressão da GFP. C) As células foram separadas do MES camadas alimentadoras e blovermelha em baixo de fixação pratos para formar EBs. Durante os primeiros dois dias do processo de diferenciação, as células foram expostas a 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, e 20 ng / ml FGF-8. Posteriormente, foram induzidas a diferenciar com um ácido retinóico iM e 1 uM sónica SAG agonista hedgehog durante 5 dias. As células diferenciadas MES expressa de fluorescência da GFP forte. D) Depois de 7 dias de diferenciação, as EBs foram dissociados e plaqueados em placas revestidas poly-DL-ornithine/laminin. As células diferenciadas alargado longos processos neuronais após 2 dias em cultura. Barra de escala = 200 mM. MN = neurônio motor. B, C e D são imagens de campo claro e B ', C' e D 'são correspondentes imagens de fluorescência.

Figura 2. Caracterização de neurónios MES células derivadas do motor. Técnica de imunofluorescência para a cadeia de neurofilamentos médio (NF-M, vermelho), Chat (vermelho), e Ilhota-1 (vermelho) foi coincidente com GFP (verde) expression. DAPI (azul) foi usado para identificar os núcleos. Barra de escala = 50 mM.

A qualidade de células MES é o parâmetro mais crítico para a geração eficiente de neurónios motores. células de MES deve ser cultivado em PMEF para impedir a diferenciação espontânea. A adição de LIF ajuda a manter as células MES em um estado indiferenciado. Como as células de MES dividir cada h 12-15, o meio de cultura se torna empobrecido rapidamente e deve ser substituído por dia.

Activação eficiente da via Shh é um parâmetro crítico necessário para induzir a motor especificação neurónio. Proteína Shh (R & D System), e Shh agonistas de sinalização Hh como agonista HhAg1.3 (Curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem), e SAG (Merck Química) têm sido utilizados para promover a formação de neurônios motores ^{1-3 , 10,11.} Encontrámos SAG de ser uma molécula mais eficaz do que purmorphamine na diferenciação de células para um fenótipo neuronal motora ^5. 1 - purmorphamine iM 2,5 com 1 uM RA nunca deu uma eficiência de diferenciação de mais de 20%. Contudonas nossas mãos uma combinação de 1 mM de RA e 1 mM de SAG deu uma eficiência de diferenciação de cerca de 25% em procedimentos sem um passo de indução neural.

Para melhorar ainda mais a eficiência de diferenciação, podemos adicionar um 2-dia passo de indução neural antes do passo de especificação neurónio motor. Esta abordagem tira proveito do fato de que tanto Noggin e sinalização FGF são cruciais para a fase inicial de indução neural quando as células embrionárias entra pela primeira vez a linhagem neural ^6-9. Em adição à indução neural, FGF sinalização mantém as culturas como células precursoras neuronais. A sobreexpressão de Fgf8 no mesencéfalo desenvolvimento leva a uma dramática expansão da população precursor neural na zona ventricular ^12. Uma combinação de FGFs e Noggin actua sinergicamente para induzir a formação de tecido neural, promovendo uma identidade neural posterior ^9. Assim, o 2-dia passo de indução neural é concebido para dirigir as células MES paraa linhagem neuronal antes do início do processo de especificação do motor neurónio.

O protocolo descrito aqui é uma modificação e aprimoramento do protocolo original estabelecida descrito anteriormente ^1. Embora o cronograma de gerar neurônios motores é o mesmo, fizemos uma série de modificações para agilizar o processo e melhorar o rendimento dos neurônios motores. Ao adicionar um passo de indução neural para o protocolo de diferenciação, somos capazes de aumentar a eficiência de diferenciação de 25% a 50%. Nosso protocolo constitui uma estratégia eficiente para enriquecer os neurônios motores derivados das células de MES. Neurónios motores não pode ser obtido a partir de pacientes com AME e para a saúde pobre de neurónios motores primários de ratinhos SMA opõe isolamento de células de suficiente qualidade, quantidade e pureza para realizar análises quantitativas de proteínas afectadas nesta doença. Usando este protocolo célula MES, fomos capazes de obter um motor população celular dos neurônios de quantidades suficientesidentidade e pureza de um estudo de proteômica para identificar vias moleculares afetadas na atrofia muscular espinhal ^5.