Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

1. Étape 1: Souris souches embryonnaires de culture cellulaire (MES) (Durée: 3 jours)

1. Plaqué primaire fibroblastes embryonnaires de souris (PMEF)

1. Manteau quatre de 100 mm boîtes de culture tissulaire avec de la gélatine pour l'adhésion PMEF. Ajouter 8 ml de solution de gélatine à 0,1% (StemCell Technologies) à chaque plat et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante.
2. Retirer l'excès de gélatine à partir de plats. Ne pas rincer la vaisselle.
3. Diluer un flacon de la mitomycine C-inactivé PMEF (Millipore) qui contient environ. 5 x 10 ⁶ cellules dans 40 ml de PMEF médias (voir la recette dans le tableau 1) et la plaque sur quatre de 100 mm boîtes de culture tissulaire. Le PMEF fournir une couche nourricière de cellules MES.
4. PMEF devront être ensemencés au moins un jour avant d'ajouter les cultures de cellules MES. PMEF peut être utilisé jusqu'à 1 semaine après placage.

2. Placage cellules MES

Pour surveiller l'efficacité de la différenciation cellulaire MES dans les neurones moteurs, On utilise HBG3, une ligne de cellules ES proviennent d'une souris transgénique exprimant eGFP sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones moteurs HB9.

1. Dégivrage 1 flacon de cellules MES HBG3 (env. 1 x 10 ^7, ont contribué par le Dr Douglas Kerr, l'Université Johns Hopkins) dans un bain à 37 ° C l'eau. Ajouter 5 ml de ES médias (voir la recette dans le tableau 1) dans un tube de 15 ml et centrifuger les cellules à 800 rpm pendant 5 min.
2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules MES dans 20 ml de médias ES fraîchement ajouté le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) à une concentration finale de 10 ng / ml. REMARQUE: FRV doit être ajouté sur la journée d'utilisation et est nécessaire pour maintenir les cellules MES dans un état indifférencié.
3. Retirer 10 ml de milieu PMEF du PMEF dans chaque plat et ajouter 10 ml de la suspension de cellules ES HBG3 à chaque plat.
4. 24 h après le placage, les cellules forment de petites colonies MES, similaire en taille à la colonie indiqué par la flèche dans la figure 1B. 72 h après le placage, colonsaugmentation de la taille es, beaucoup étant d'environ 100 um de diamètre (figure 1B, indiqué par des flèches). Ces cellules sont prêtes pour la différenciation. Médias doit être remplacé par jour pour maintenir la prolifération des cellules.

2. Étape 2: l'induction neurale (Durée: 2 jours)

Pour induire la différenciation des cellules MES dans les neurones moteurs, cellules MES doivent être séparés de PMEF et cultivé dans un environnement de suspension. Gélatine flacons enduits sont utilisés pour séparer PMEF à partir de cellules MES.

1. Lorsque les colonies MES sont prêts pour l'induction neurale (définie comme 0 jours de différenciation), manteau de 2 flacons T150 avec 0,1% (18 ml / flacon) de gélatine pendant 30 min à température ambiante, puis retirer la gélatine et lavez avec du PBS 1X à trois reprises. REMARQUE: Chaque boîte de culture de 100 mm aurez besoin d'un T150-gélatine flacon revêtu de séparer PMEF.
2. Retirez délicatement les médias par aspiration, en veillant à ne pas déloger les colonies faiblement attachées. Ajouter 10 ml de PBS brèvement, puis retirez par aspiration pour effectuer l'étape de lavage.
3. Pour séparer les cellules du MES PMEF, ajouter 0,25% de trypsine / EDTA (3 ml / boîte, StemCell Technologies) et incuber pendant 3-5 min à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules souches et PMEF détacher de la plaque. Ajouter 15 ml de milieu ES frais sans LIF et les cellules de pipette et pour briser les colonies (environ 15-20 fois). Ensuite, ajoutez à un 0,1% de gélatine enduit T150 flacon et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Après incubation, PMEF devrait s'attacher à la surface tandis que les cellules ES gélatinisé devrait flotter. Recueillir les cellules flottantes MES dans un tube de 50 ml.
4. Centrifuger à 800 rpm et remettre les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation neurale (voir la recette dans le tableau 1).
5. Compter les cellules en utilisant une plaque, puis hémocytomètre environ 2 x 10 ⁶ cellules MES sur un plat de 100 mm culture bactérienne ou d'une suspension. Ces plaques permettent la croissance des cultures en suspension et de favoriser la formation de corps embryoïdes (EBS).
6. Sur différenciation1 jour tion, les cellules MES former de petits agrégats flottants (EBS) qui sont visibles au microscope optique. Toute PMEF report joindre à l'antenne. Transférer les cellules en suspension et les médias dans un tube de 15 ml et centrifuger à faible vitesse (500 rpm) pendant 3 min. Aspirer soigneusement les médias, ajouter 10 ml de milieu de différenciation neurale frais à l'granulés EBS, puis les cellules de la plaque dans un nouveau plat bactérienne. En plus de réapprovisionner les médias, cette étape supprime toute PMEF qui transportent plus de l'étape préalable.
7. Le 2 jours différenciation, EB sont prêts à être induite dans les neurones moteurs.

3. Étape 3: Spécification du motoneurone (Durée: 5 jours)

1. Sur deux jours de différenciation, tourbillon la boîte de culture et de transférer les médias et EBS dans un tube de 15 ml. Laissez-EB se déposent par gravité (~ 10 min) ou par centrifugation à basse vitesse (500 rpm) pendant 3 min.
2. Aspirer soigneusement moyennes et remettre en suspension EBS dans 10 ml de la différenciation des neurones moteur (DMN) à moyen (voir la recette dans
3. Sur 7 jours de différenciation, EBS doit être d'environ 150 à 200 um de diamètre et doit exprimer des signaux forts GFP (figure 1C). Ces EBS sont prêts à être dissociées et plaquée sur poly-DL-ornithine/laminin plats revêtus ou lamelles.

4. Étape 4: Préparation de Poly-DL-ornithine/laminin Lamelles enrobés (Durée: 2 jours)

Deux jours avant la dissociation EBS (c'est à dire sur 5 jours de différenciation), préparer des lamelles poly-DL-ornithine/laminin-coated.

1. Placer 12 mm lamelles rondes (Warner Instruments) sur le fond d'une plaque de 24 puits. Dissoudre 25 mg de poly-DL-ornithine (Sigma-Aldrich) dans 25 ml de l'eau stérile bidistillée (d ₂ H ₂ O) pour obtenir une solution stock 10X (1 mg / ml). Lorsque vous êtes prêt à utiliser, faire une dilution au 1/10 de la poly-DL-ornithine avec d ₂ H ₂ O pour obtenir concentration de 100 pg / ml. Ajouter 0,5 ml à chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber à 4 ° C pour la nuit.
2. Le lendemain (6 jours de différenciation), aspiration poly-DL-ornithine et de laisser les plaques de couverture et les feuillets de l'air sec dans une hotte de culture tissulaire. Rincer les puits de la plaque avec D ₂ H ₂ O trois fois. Laissez sécher à l'air pendant une heure.
3. Dissoudre 1 mg laminine de souris (Millipore) dans 5 ml de glace-froid du PBS 1X à préparer une solution mère 100x (200 pg / ml). Lorsque vous êtes prêt à utiliser, assurez-1/100 de dilution en glace-froid du PBS 1X (2 pg laminine / ml). Ajouter 0,5 ml / puits dans une plaque de 24 puits et incuber à 4 ° C pour la nuit. Avant que les cellules d'ensemencement, de la laminine excès doit être retiré et les puits rincés avec du PBS 1X à deux reprises. Lamelles peuvent être stockées dans la DMN moyenne (0,5 ml / puits).

5. Étape 5: Allongement Axon (Durée: 2 jours)

1. Sur 7 jours de différenciation, de recueillir EB dans un tube de 15 ml et laisser EB à régler (environ 3 min). Aspirer des médias et re-suspend EB dans du PBS. Permettez-EB à régler, puis aspirer PBS. Répétez cette étape 3 fois. Ajouter 1 ml de Accumax (Millipore) à l'EBS, mélanger délicatement et incuber pendant 5 min à température ambiante. Puis aspirer Accumax excès couvrant l'EBS.
2. Pour dissocier EBS, ajouter 3 ml de milieu de la DMN. Pipet haut et en bas 20 fois en utilisant une micropipette Eppendorf 1 ml (bleu pointe) de perturber EBS. Incuber pendant 2 min à température ambiante. Transférer la suspension de cellules à un tube mm 12x75 avec la cellule crépine capuchon (BD Falcon) pour obtenir une suspension cellulaire unique. Répétez cette étape de dissociation avec des touffes restantes et les cellules retenues par le filtre de manière à enrichir le rendement des cellules individuelles. La suspension cellulaire finale unique sera de 6 ml.
3. Mélanger délicatement cette suspension cellulaire unique et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Diluer cellules dans DMN support (supplémenté avec 10 ng / ml de chaque BDNF, GDNF, le CNTF, et NT-3) à une densité de 2x10 ⁵ cellules par ml. Ajouter suspension cellulaire (0,5 ml / puits) pour plaques à 24 puits contenant polamelles ly-DL-ornithine/laminin enrobés (préalablement préparé comme décrit ci-dessus). Les cellules différenciées étendre neurites longtemps après 2 jours de culture (figure 1D).

6. Les résultats représentatifs

La figure 1A montre un aperçu du protocole. Dans l'étape 1, les cellules sont cultivées sur MES PMEF et complété par FRV pour prévenir une différenciation spontanée. En général, indifférenciées colonies MES sont ronds et compacts, et ont clairement défini les bords. Les colonies sont pas en contact avec l'autre. En règle générale, les cellules de ce statut devait être divisé à un ratio de 1:4 tous les 3 2 ~ jours. Cependant, chaque lignée cellulaire individuelle va croître à un rythme différent et le rapport de division doit être déterminé de manière empirique. Les flèches dans la figure 1B indiquent l'aspect typique des cellules MES après culture sur une couche nourricière PMEF pendant 3 jours. Ces colonies sont de grande taille (50-100 m de diamètre), mais tout en conservant bord rond et définis. A ce stade, les colonies sont prêts pour la différenciation ou de sous-culture. Une pointe de flèche dans la figure 1B montre une petite colonie MES que vous trouverez généralement 24 heures après placage. Quatre jours après le placage, les cellules envahies par la végétation MES. Ils montrent un aspect aplati et la perte de limites définies, ce qui indique qu'ils commencent à se différencier. Ces cellules ne sont pas optimales pour la différenciation en cellules neuronales.

Pour différencier les cellules MES dans les neurones moteurs, cellules MES doivent être cultivés dans des conditions de suspension pour permettre la formation EB. Dans l'étape 2, les cellules ES sont transférées sur une surface de culture sans une couche d'alimentation pour favoriser la formation EB. Dans cette étape, ils sont incubés dans un milieu de différenciation neurale complétée par Noggin, bFGF, et FGF-8 pour 2 jours à cellules directs à un lignage neuronal. Petit EBS peut être observée sous le microscope au jour 1 de la différenciation. Ils devraient être flottant dans le milieu. Report PMEF peuvent également être trouvés au jour 1de la différenciation et doit être retiré. Ces cellules adhèrent aux plats bactériens sont éliminés du moment où EBS sont passées à un nouveau plat bactérienne. Ainsi, au jour 2 de la différenciation, PMEF peu ou pas devrait être vu dans la boîte de culture. À l'étape 3, a poursuivi le transfert de l'EBS à de nouveaux plats devraient veiller à l'enlèvement de tout PMEF restants. EB sont cultivées dans la différenciation des neurones moteurs (MND) des milieux supplémentés avec RA et SAG pendant 5 jours pour différencier les cellules dans les neurones moteurs. Pendant la culture, EBS continuer à croître en taille et peut être vu par l'œil nu à 3 jours de différenciation ~ 4. Figure 1C montre l'aspect microscopique de l'EBS sur les 7 jours de différenciation. Contrairement aux cellules indifférenciées, EBS montrent une forte fluorescence due à l'expression de la GFP. Ces EBS sont différenciés de façon optimale et sont prêts pour la dissociation. La cytométrie en flux a montré que 51% ± 0,8% des cellules provenant de la dissociation EB se sont différenciées en cellules exprimant la GFP ^5. Dans l'étape 5, la culture de la eese neurones moteurs de la présence de GDNF, le CNTF, le BDNF, NT3 et des résultats en extension de longues projections axonales. figure 1D montre l'apparition de cellules différenciées 2 jours après le placage de dissocier EBS. Notez neurites longs s'étendant à partir des corps cellulaires des cellules étalées. La coloration par immunofluorescence montre que les cellules GFP + exprimer le marqueur pan-neuronal (neurofilaments-à chaîne moyenne) et deux marqueurs de neurones moteurs spécifiques (Islet-1 et de la choline acétyltransférase, figure 2).

Figure 1. La différenciation des cellules MES dans les neurones moteurs (image modifiée de Wu et al. ^5). A) Schéma du protocole de la différentiation de cellules MES aux neurones moteurs. B) Cellules non différenciées MES former des colonies rondes sur le sommet d'une couche nourricière de fibroblastes. Ils ont expression de la GFP faibles. C) des cellules MES ont été séparés de couches nourricières et culturouge sur les bas-fixation plats pour former EBS. Au cours des deux premiers jours du processus de différenciation, les cellules ont été exposées à 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, et 20 ng / ml de FGF-8. Par la suite, ils ont été induites à se différencier avec 1 acide rétinoïque uM et 1 uM sonore SAG agoniste hérisson pendant 5 jours. Cellules différenciées MES exprimé une forte fluorescence de la GFP. D) Après 7 jours de différenciation, EBS ont été dissociées et plaquée sur poly-DL-ornithine/laminin plaques revêtues. Les cellules différenciées à très longue durée des processus neuronaux après 2 jours de culture. Échelle = 200 um. MN = neurone moteur. B, C et D sont des images de champ lumineux et B ', C' et D 'sont correspondants des images de fluorescence.

Figure 2. Caractérisation des neurones moteurs MES dérivés de cellules. Immunofluorescence à chaîne moyenne neurofilaments (NF-M, rouge), ChAT (rouge), et de l'Islet-1 (rouge) a coïncidé avec la GFP (green) expression. DAPI (bleu) a été utilisé pour identifier les noyaux. Échelle = 50 microns.

La qualité des cellules MES est le paramètre le plus critique pour la production efficace des neurones moteurs. MES cellules doivent être cultivées sur des PMEF pour prévenir une différenciation spontanée. Ajout d'un FRV permet de maintenir les cellules MES dans un état indifférencié. Comme les cellules se divisent toutes les MES h 12-15, le milieu de culture devient rapidement épuisées et doivent être remplacés tous les jours.

Activation efficace de la voie Shh est un paramètre critique nécessaire pour induire la spécification des neurones moteurs. Protéine Shh (R & D System), et Shh agonistes de signalisation tels que agoniste Hh HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem), et le SAG (EMD Chemicals) ont tous été utilisés pour promouvoir la formation de neurones moteurs ^{1-3 , 10,11.} Nous avons trouvé SAG être une molécule plus efficace que purmorphamine dans la différenciation des cellules vers un phénotype neuronal moteur ^5. 1 à 2,5 uM purmorphamine avec 1 uM RA n'a jamais donné un rendement de différenciation de plus de 20%. Cependantdans nos mains une combinaison de 1 uM de RA et 1 uM de SAG a donné un rendement de différenciation d'environ 25% dans les procédures sans étape de l'induction neurale.

Pour renforcer l'efficacité de différenciation, nous ajoutons une étape de 2 jours avant l'induction neurale à l'étape du moteur spécification des neurones. Cette approche tire profit du fait que les deux Noggin et de signalisation FGF sont cruciales pour le stade précoce de l'induction neurale lorsque les cellules embryonnaires d'abord entrer la lignée neuronale ^6-9. En plus de l'induction neurale, FGF signalisation maintient les cultures comme des cellules précurseurs neurales. La surexpression de Fgf8 dans le mésencéphale développement conduit à une expansion spectaculaire de la population précurseurs neurales dans la zone ¹² du ventricule. Une combinaison de FGF et Caboche agit en synergie pour induire la formation de tissu neural par la promotion d'une identité postérieure neurones ^9. Ainsi, l'étape de 2 jours l'induction neurale est conçu pour diriger les cellules vers MESla lignée neuronale avant l'initiation du processus de spécification de neurones moteurs.

Le protocole décrit ici est une modification et l'amélioration du protocole original créé décrit précédemment ^1. Bien que la chronologie de générer des neurones moteurs est la même, nous avons fait un certain nombre de modifications afin de rationaliser la procédure et d'améliorer le rendement des neurones moteurs. En ajoutant une étape d'induction neurale au protocole de différenciation, nous sommes en mesure d'accroître l'efficacité de différenciation de 25% à 50%. Notre protocole prévoit une approche efficace pour enrichir les neurones moteurs dérivés de cellules MES. Les neurones moteurs ne peuvent pas être obtenus chez des patients SMA et le mauvais état de santé des neurones moteurs primaires de souris SMA exclut l'isolement des cellules de la quantité, la qualité et une pureté suffisantes pour effectuer des analyses quantitatives de protéines affectées dans cette maladie. L'utilisation de ce protocole de cellule MES, nous avons pu obtenir une population cellulaire neurone moteur de la quan suffisanteidentité et la pureté d'une étude protéomique pour identifier les voies moléculaires affectés dans l'atrophie musculaire spinale ^5.