Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner

1. Steg 1: Mouse embryonala stamceller (MES) Cell Culture (Timing: 3 dagar)

1. Plätering primära embryonala fibroblaster från mus (PMEF)

1. Coat fyra 100-mm vävnadsodlingsskålar rätter med gelatin för PMEF vidhäftning. Tillsätt 8 ml 0,1% gelatinlösning (StemCell Technologies) till varje skål och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
2. Ta bort överflödigt gelatin från rätter. Skölj inte disken.
3. Späd en flaska Mitomycin C-inaktiverat PMEF (Millipore) som innehåller ca. 5 x 10 ^6-celler till 40 ml av PMEF medium (se receptet i Tabell 1) och plattan på fyra 100-mm vävnadsodlingsplattor. Den PMEF ger en matare lager för MES celler.
4. PMEF bör beläggas minst en dag innan du lägger MES cellkulturer. PMEF kan användas upp till 1 vecka efter plätering.

2. Plätering MES Celler

Att övervaka effektiviteten av MES-cellsdifferentiering till motoriska neuroner, Använde vi HBG3, en ES-cellinje härledd från en transgen mus som uttrycker EGFP under kontroll av den motoriska neuron promotor HB9.

1. Avfrostning 1 injektionsflaska HBG3 MES celler (ca 1 x 10 ⁷ bidrog av Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins University) i ett 37 ° C vattenbad. Tillsätt 5 ml ES-medium (se recept i tabell 1) i en 15 ml-rör och centrifugera ned cellerna vid 800 rpm under 5 minuter.
2. Aspirat supernatanten och återsuspendera MES-celler i 20 ml ES media med färskt tillsatt leukemi inhiberande faktor (LIF) vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml. OBS: LIF bör läggas på dagen för användning och krävs för att bibehålla MES cellerna i en odifferentierad tillstånd.
3. Avlägsna 10 ml PMEF media från PMEF i varje skål och tillsätt 10 ml av HBG3 ES cell-suspension till varje skål.
4. 24 h efter plätering, MES-celler bildar små kolonier, ungefär samma storlek som den koloni som anges av pilen i figur 1B. 72 h efter plätering, Colonies ökning i storlek, varav många är ungefär 100 pm i diameter (figur 1B, som visas med pilar). Dessa celler är redo för differentiering. Media bör bytas dagligen för att bibehålla proliferation av celler.

2. Steg 2: neural induktion (Timing: 2 dagar)

För att inducera differentiering av MES-celler in motomeuroner, MES-celler måste separeras från PMEF och odlas i en suspension miljö. Gelatinbelagda kolvar används för att separera PMEF från MES-celler.

1. När MES kolonier är redo för neural induktion (definierad som differentiering dag 0), kappa 2 T150-kolvar med 0,1% gelatin (18 ml / kolv) under 30 min vid rumstemperatur och sedan avlägsna överskottet av gelatin och tvätta med 1 x PBS tre gånger. OBS: Varje 100-mm skål kulturen behöver en T150-gelatin belagd kolv att separera PMEF.
2. Ta försiktigt bort media genom aspiration, att se till att inte rubba löst bifogade kolonier. Tillsätt 10 ml PBS korthetly och ta sedan bort genom aspiration för att slutföra tvättsteg.
3. Att separera MES celler från PMEF, tillsätt 0,25% trypsin / EDTA (3 ml / skål, StemCell Technologies) och inkubera under 3-5 min vid 37 ° C tills de stamceller och PMEF lossna från plattan. Tillsätt 15 ml nytt medium ES utan LIF och celler Pipettera upp och ned för att bryta kolonier (ca 15-20 gånger). Sedan lägga till en 0,1% gelatin-belagd T150 kolv och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Efter inkubation bör PMEF fästa till den gelatinerade yta medan ES-celler bör vara flytande. Samla upp flytande MES celler till en 50 ml-rör.
4. Centrifugera ner vid 800 rpm och återsuspendera celler i 10 ml Neural differentieringsmedium (se receptet i Tabell 1).
5. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer och därefter platta ca 2 x 10 ⁶ MES celler på en 100-mm bakteriell eller suspension odlingsskål. Dessa plattor medger tillväxt av suspensionsodlingar och främja bildandet av embryoidkroppar (EBS).
6. På differentieringtion dag 1, MES cellerna bildar små flytande aggregat (EBS) som är synliga under ett ljusmikroskop. Eventuell överföring PMEF fästa till skålen. Överföra suspensionsceller och media i en 15 ml-rör och centrifugera vid låg hastighet (500 rpm) under 3 minuter. Aspirera media försiktigt, tillsätt 10 ml färsk Neural Differentiering Medium till pelleterat EBS, och sedan platta celler i en ny bakteriell maträtt. Förutom fylla medierna, avlägsnar detta steg något PMEF som bär över från föregående steg.
7. På differentiering dag 2, EBS är klara att induceras i motoriska neuroner.

3. Steg 3: Motor Neuron Specifikation (Timing: 5 dagar)

1. På differentiering dag 2, snurra kulturen skålen och överför media och EBS i en 15 ml tub. Låt EB sedimentera genom gravitation (~ 10 min) eller genom centrifugering vid låg hastighet (500 rpm) under 3 minuter.
2. Aspirera medelstora noggrant och återsuspendera EB i 10 ml Motor Neuron Differentiation (MND) medium (se recept i
3. På differentiering dag 7, bör EB vara cirka 150 - 200 nm i diameter och bör uttrycka starka GFP signaler (Figur 1C). Dessa EB är redo att skiljas och ströks ut på poly-DL-ornithine/laminin belagda rätter eller täckglas.

4. Steg 4: Framställning av Poly-DL-ornithine/laminin belagda täckglas (Timing: 2 dagar)

Två dagar före dissociation EBS (dvs. differentiering dag 5), förbereda poly-DL-ornithine/laminin-coated täckglas.

1. Ställe 12-mm runda täckglas (Warner Instruments) på undersidan av en 24-brunnsplatta. Lös 25 mg poly-DL-ornitin (Sigma-Aldrich) i 25 ml sterilt, dubbel-destillerat vatten (d. ₂ H ₂ O) för att erhålla en 10X stamlösning (1 mg / ml). När den är klar att använda, göra en 1/10 utspädning av poly-DL-ornitin med d ₂ H ₂ O för erhållande av concentranson av 100 | ig / ml. Tillsätt 0,5 ml till varje brunn i 24-brunnars platta och inkubera vid 4 ° C över natten.
2. Följande dag (differentiering dag 6), aspirera poly-DL-ornitin och låt plattorna och täckglas luft torka i en vävnadsodling huva. Skölj brunnarna med d _{2 H2O} tre gånger. Låt lufttorka under en timme.
3. Upplös 1 mg muslaminin (Millipore) i 5 ml iskylt kall 1 x PBS för att göra 100x stamlösning (200 pg / ml). När du är redo att använda, att 1/100 utspädning i iced-kallt 1X PBS (2 ug laminin / ml). Tillsätt 0,5 ml / brunn i en 24-brunnars platta och inkubera i 4 ° C över natten. Innan sådden celler bör överskottet laminin tas bort och brunnar sköljs med 1 x PBS två gånger. Täckglasen kan lagras i MND-medium (0,5 ml / brunn).

5. Steg 5: Axon Förlängning (Timing: 2 dagar)

1. På differentiering dag 7, samla EB i en 15 ml rör och tillåta EB separera (omkring 3 minuter). Sug media och re-suspend EB i PBS. Låt EB att bosätta sig och sedan aspirera PBS. Upprepa detta steg 3 gånger. Tillsätt 1 ml Accumax (Millipore) till EBS, blanda försiktigt och inkuberas under 5 min vid rumstemperatur. Då aspirera utöver Accumax täcker EBS.
2. Att dissociera EBS, tillsätt 3 ml MND medium. Pipettera upp och ned 20 gånger med användning av en 1 ml Eppendorf-mikropipett (blå spets) för att störa EBS. Inkubera under 2 min vid rumstemperatur. Överföra cellsuspension till en 12x75 mm rör med cellfilter lock (BD Falcon) för att erhålla en enkelcellsuspension. Upprepa detta dissociationssteget med återstående klumpar och celler som kvarhålles av filtret så att berika ett utbyte av enskilda celler. Den slutliga enkelcellssuspension blir 6 ml.
3. Blanda försiktigt denna enda cellsuspension och räkna celler med användning av en hemocytometer. Späd celler i MND-medium (kompletterat med 10 ng / ml av vardera BDNF, GDNF, CNTF, och NT-3) till en täthet av 2x10 ⁵ celler per ml. Tillsätt cellsuspension (0,5 ml / brunn) till 24-brunnsplattor innehållande poly-DL-ornithine/laminin belagda täckglas (tidigare framställd såsom beskrivits ovan). De differentierade cellerna sträcker långa neuriter efter 2 dagar i odling (Fig. 1D).

6. Representativa resultat

Figur 1A visar en översikt av protokollet. I steg 1, är MES celler odlas på PMEF och kompletterat med LIF för att förhindra spontan differentiering. I allmänhet odifferentierade kolonier MES är runda och kompakt, och har klart definierade kanter. Kolonierna är inte i kontakt med varandra. Normalt bör MES celler delas med ett 1:4 förhållande var 2 ~ 3 dagar. Emellertid kommer varje individuell cell-linje växa i en annan hastighet och delningsfaktorn måste bestämmas empiriskt. Pilarna i figur 1B visar det typiska utseendet av MES-celler efter odling på en PMEF matarskikt under 3 dagar. Dessa kolonier är stora (50-100 ^ m i diameter), men fortfarande bibehålla runda och definierad kants. I detta skede kolonierna är redo för differentiering eller subkultur. En pilspets i figur 1B visar en liten MES koloni som du vanligtvis hittar 24 timmar efter plätering. Fyra dagar efter plätering, MES celler blir igen. De visar en tillplattad utseende och förlust av definierade gränser, vilket indikerar att de börjar differentiera. Sådana celler är inte optimala för differentiering till neuronala celler.

Att differentiera MES celler i motoriska nervceller, MES celler måste odlas i suspension förhållanden för att möjliggöra EB bildas. I steg 2, är ES-celler överfördes till en kultur yta utan ett matarskikt för att främja bildningen EB. I detta steg är de inkuberas i Neural Differentiering medium kompletterat med noggin, bFGF, och FGF-8 i 2 dagar för att rikta celler till en neuralt härstamning. Små EB kan observeras under mikroskop vid dag 1 av differentiering. De bör vara flytande i mediet. Överföring PMEF kan också hittas på dag 1av differentiering och måste avlägsnas. Dessa celler följa bakteriella rätter är så elimineras när EB passeras till en ny bakteriell maträtt. Sålunda, vid dag 2 av differentiering, bör få eller inga PMEF ses i odlingsskålen. I steg 3, fortsatt överföring av EBS nya rätter bör säkerställa att avlägsna eventuell kvarvarande PMEF. EB odlas i Motor Neuron differentiering (MND)-medium kompletterat med RA och SAG under 5 dagar för att differentiera cellerna i motoriska neuroner. Under kultur, EBS fortsätter att växa i storlek och kan ses med blotta ögat vid differentiering dag 3 ~ 4. Figur 1C visar mikroskopiska utseende EBS på differentiering dag 7. Till skillnad från de odifferentierade cellerna, EBS visar stark fluorescens på grund av uttryck av GFP. Dessa EB är optimalt differentierade och är redo för dissociation. Flödescytometri visade att 51% ± 0,8% av cellerna från den dissocierade EB hade differentieras till GFP-uttryckande celler ^5. I 5 steg kultur these motoriska neuroner i närvaro av GDNF, CNTF, BDNF och NT3 resulterar i förlängning av långa axonala projektioner. Figur 1D visar utseendet av differentierade celler 2 dagar efter utstrykning av dissocierad EBS. Notera långa neuriter som sträcker sig från cell kroppar pläterade cellerna. Immunfluorescensfärgning visar att GFP + celler uttrycker pan-neuronala markör (neurofilament-medellång kedja) och två motoriska neuron specifika markörer (Islet-1 och kolinacetyltransferas, figur 2).

Figur 1. Differentiering av MES-celler i motoriska neuroner (bild modifierad från Wu et al. ^5). A) Schema om differentiering protokollet från MES celler till motoriska nervceller. B) Odifferentierade celler MES bilda runda kolonier på toppen av en fibroblast-matarskikt. De har svag GFP-uttryck. C) MES celler separerades från matarskikt och Culturött på låg fastsättning rätter att bilda EBS. Under de första två dagarna av differentieringsprocessen, exponerades celler för 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF och 20 ng / ml FGF-8. Därefter sattes de inducerades att differentiera med 1 | iM retinsyra och 1 | iM sonic hedgehog-agonist SAG under 5 dagar. Differentierade MES celler uttryckte starkt GFP fluorescens. D) Efter 7-dagars differentiering var EB dissocierades och utströks på poly-DL-ornithine/laminin belagda plattor. De differentierade cellerna förlängd långa neurala processer efter 2 dagar i odling. Skalstreck = 200 nm. MN = motor neuron. B, C och D är ljusa fält bilder och B ', C och D' är motsvarande fluorescensbilder.

Figur 2. Karakterisering av MES-cellerna motomeuroner. Immunofluorescens-färgning för neurofilament medellång kedja (NF-M, röd), ChAT (röd) och Islet-1 (röd) sammanföll med GFP (grön) uttryckession. DAPI (blå) användes för att identifiera kärnor. Skalstreck = 50 pm.

Kvaliteten av MES-celler är den mest kritiska parametern för effektiv generering av motomeuroner. MES celler måste odlas på PMEF att förhindra spontan differentiering. Tillsats av LIF hjälper till att upprätthålla de MES-celler i ett odifferentierat tillstånd. Som MES celler delar varje 12-15 h, odlingsmediet blir slut snabbt och måste bytas dagligen.

Effektiv aktivering av Shh reaktionsvägen är en kritisk parameter som krävs för att inducera motorneuron-specifikationen. Shh protein (R & D System) och Shh signalering agonister såsom Hh agonist HhAg1.3 (Curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem) och SAG (EMD Chemicals) har alla använts för att främja bildandet av motoriska neuroner ^{1-3 , 10,11.} Vi fann SAG vara ett mer effektivt molekyl än purmorphamine att skilja cellerna mot en motor neuronala fenotyp ^5. 1 till 2,5 M purmorphamine med 1 M RA gav aldrig en differentiering verkningsgrad på mer än 20%. Emellertidi våra händer en kombination av 1 | iM av RA och 1 pM av SAG gav en differentiering effektivitet av ca 25% i försök utan en neural induktion steg.

För att ytterligare förbättra differentiering effektivitet lägger vi en 2-dagars neural induktion steg innan motorn neuron specifikationen steg. Denna strategi tar fördel av det faktum att både Noggin och signalering FGF är avgörande för tidigt skede av neural induktion då embryonala cellerna först in i neurala linjen ^6-9. Förutom neural induktion, hävdar FGF signalering kulturer som neurala prekursorceller. Överexpression av FGF8 i u mitthjärnan leder till en dramatisk ökning av den neurala prekursor befolkningen i den ventrikulära zonen ^12. En kombination av FGF och Noggin fungerar synergistiskt för att inducera nervvävnad bildas genom att främja en bakre neural identitet ^9. Sålunda 2-dagars neural induktion steg är utformat för att rikta MES celler motneural linjen före initiering av processen för motorneuron specifikation.

Protokollet som beskrivs här är en modifiering och förstärkning av den etablerade ursprungliga protokollet som tidigare beskrivits ^1. Även tidslinjen att generera motoriska nervceller är samma, har vi gjort ett antal ändringar för att effektivisera förfarandet och förbättra utbytet av motoriska nervceller. Genom att lägga till en neural induktion steg till differentiering protokollet kan vi öka differentiering effektivitet från 25% till 50%. Vår protokollet utgör ett effektivt tillvägagångssätt för att berika motoriska nervceller som härrör från MES celler. Motoriska nervceller inte kan erhållas från SMA patienter och dålig hälsa av primära motoriska nervceller från SMA möss utesluter isolering av celler i tillräcklig mängd, kvalitet och renhet för att utföra kvantitativa analyser av proteiner påverkas i denna sjukdom. Genom att använda denna MES cell protokoll kunde vi få en motor population neuroncellen tillräckligt Quanidentitet och renhet för en proteomic undersökning för att identifiera molekylära vägar påverkas i spinal muskelatrofi ^5.