Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen

1. Stap 1: Muis embryonale stamcellen (MES) Cultuur van de Cel (Timing: 3 dagen)

1. Plateren primaire embryonale muis fibroblasten (PMEF)

1. Coat vier 100-mm weefselkweek gerechten met gelatine voor PMEF hechting. Voeg 8 ml 0,1% gelatine-oplossing (StemCell Technologies) elke schaal en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
2. Verwijder het teveel aan gelatine uit gerechten. Niet uitspoelen van de gerechten.
3. Verdun een flacon van mitomycine C-geïnactiveerd PMEF (Millipore) dat ongeveer bevat. 5 x 10 ⁶ cellen in 40 ml van PMEF media (zie recept in tabel 1) en de plaat op vier 100-mm weefselkweek gerechten. De PMEF een feeder layer voor MES-cellen.
4. PMEF worden uitgeplaat ten minste een dag vóór het toevoegen MES celculturen. PMEF kan worden tot 1 week na platen.

2. Plating MES Cellen

Om de efficiëntie van MES celdifferentiatie controleren in motorneuronenGebruikten we HBG3, een ES-cellijn afgeleid van een transgene muis te drukken eGFP onder de controle van de motor neuron specifieke promoter Hb9.

1. Ontdooi 1 injectieflacon HBG3 MES-cellen (ca. 1 x 10 ^7, bijgedragen door dr. Douglas Kerr, Johns Hopkins University) in een 37 ° C waterbad. Voeg 5 ml ES media (zie recept in tabel 1) in een 15 ml buis en spin down cellen op 800 rpm gedurende 5 minuten.
2. Zuig supernatant en hersuspenderen MES cellen in 20 ml vers medium met ES toegevoegd Leukemia remmende factor (LIF) bij een eindconcentratie van 10 ng / ml. OPMERKING: LIF dient te worden toegevoegd op de dag van gebruik en is nodig om de MES-cellen in een ongedifferentieerde toestand te houden.
3. Verwijder 10 ml PMEF media uit de PMEF in elk gerecht en voeg 10 ml van de HBG3 ES celsuspensie bij elk gerecht.
4. 24 uur na plating, MES-cellen vormen kleine kolonies, vergelijkbaar in grootte met de kolonie aangegeven door de pijlpunt in figuur 1B. 72 uur na plating, Colonies groter worden veel zijnde ongeveer 100 micrometer in diameter (figuur 1B, aangegeven met pijlen). Deze cellen zijn klaar voor differentiatie. Media moet dagelijks worden vervangen om de proliferatie van cellen te behouden.

2. Stap 2: Neurale Inductie (Timing: 2 dagen)

Om differentiatie van MES-cellen te induceren in de motorische neuronen, MES-cellen moeten worden gescheiden van PMEF en gecultiveerd in een suspensie omgeving. Gelatine gecoate kolven worden gebruikt om PMEF scheiden van MES cellen.

1. Wanneer MES kolonies klaar voor neurale inductie (gedefinieerd als differentiatie dag 0), laag 2 T150 flessen met 0,1% gelatine (18 ml / kolf) gedurende 30 min bij kamertemperatuur en vervolgens overtollige gelatine en wassen met PBS driemaal 1x. OPMERKING: Elke 100-mm gerecht cultuur zal een T150-gelatine gecoate fles moet PMEF te scheiden.
2. Verwijder voorzichtig media door aspiratie, zodat zeker niet te los bijgevoegde kolonies los te maken. Voeg 10 ml PBS kortly en verwijder vervolgens door aspiratie te wassen stap te voltooien.
3. MES cellen te scheiden van PMEF toevoegen 0,25% trypsine / EDTA (3 ml / schaal, StemCell Technologies) en geïncubeerd gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C totdat de stamcellen en PMEF losmaken van de plaat. Voeg 15 ml vers ES media zonder LIF en pipet cellen op en neer om kolonies (ongeveer 15-20 keer) te breken. Vervolgens aan een 0,1% gelatine beklede T150 kolf geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 ° C. Na de incubatie moet PMEF hechten aan het verstijfselde oppervlak, terwijl ES-cellen moet worden zweven. Verzamelen van de drijvende MES cellen in een 50 ml buis.
4. Spin neer op 800 rpm en resuspendeer cellen in 10 ml Neurale Differentiatie Medium (zie recept in tabel 1).
5. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en dan plaat ongeveer 2 x 10 ⁶ MES cellen op een 100-mm bacteriële of opschorting cultuur schotel. Deze platen staan ​​de groei van de opschorting culturen en het bevorderen van de vorming van embryo organen (EBS).
6. Op differentiatieTIE dag 1, MES-cellen vormen kleine zwevende aggregaten (EBS), die zichtbaar onder een lichtmicroscoop. Elke overdracht PMEF hechten aan het gerecht. De suspensie cellen medium in een 15 ml buis en centrifugeer bij lage snelheid (500 rpm) gedurende 3 minuten. Zuig voorzichtig media, voeg 10 ml vers Neurale Differentiatie medium om de gepelleteerde EBS, en vervolgens plaat cellen in een nieuwe bacteriële schotel. Naast het bijvullen van de media, deze stap verwijdert PMEF die over te dragen van de voorgaande stap.
7. Op differentiatie dag 2, EBS zijn klaar om te worden opgewekt in de motorische neuronen.

3. Stap 3: Motor Neuron Specificatie (Timing: 5 dagen)

1. Op differentiatie dag 2, draai de cultuur schotel en overdracht van de media en EBS in een 15 ml buis. Laat Ebs regelen zwaartekracht (~ 10 min) of door centrifugatie bij lage snelheid (500 rpm) gedurende 3 minuten.
2. Zuig medium zorgvuldig en resuspendeer EBS in 10 ml Motor Neuron Differentiatie (MND) medium (zie recept in
3. 200 pm in diameter en moet zich grote GFP-signalen (figuur 1c) - Op differentiatie dag 7 moet EBS ongeveer 150 is. Deze EBS staan ​​klaar om los en verguld te zijn op poly-DL-ornithine/laminin gecoat gerechten of dekglaasjes.

4. Stap 4: Voorbereiding van Poly-DL-ornithine/laminin beklede dekglaasjes (Timing: 2 dagen)

Twee dagen voor dissociëren EBS (dat wil zeggen op differentiatie dag 5), voor te bereiden poly-DL-ornithine/laminin-coated dekglaasjes.

1. Plaats 12-mm ronde dekglaasjes (Warner Instruments) op de bodem van een 24-wells plaat. Los 25 mg poly-DL-ornithine (Sigma-Aldrich) in 25 ml steriel, tweemaal gedestilleerd water (d _{2 H2O)} een 10X voorraadoplossing (1 mg / ml) te verkrijgen. Als u klaar bent om te gebruiken, maak dan een 1/10 verdunning van poly-DL-ornithine met d ₂ H ₂ O te concent te verkrijgenverhouding van 100 pg / ml. Voeg 0,5 ml in elk putje van de 24-well plaat en incubeer bij 4 ° C voor de overnachting.
2. De volgende dag (differentiatie dag 6), aspiratie poly-DL-ornithine en laat de platen en dekglaasjes lucht laten drogen in een weefselkweek kap. Spoel de putjes met d ₂ H ₂ O drie keer. Laat drogen aan de lucht voor een uur.
3. Los 1 mg muis laminine (Millipore) in 5 ml ijs-koude PBS 1X 100x stock oplossing (200 ug / ml) maken. Als u klaar bent te gebruiken, maken 1/100 verdunning in ijs-koud 1X PBS (2 ug laminine / ml). 0,5 ml / putje in een 24-putjesplaat en incubeer in 4 ° C overnacht. Vóór het zaaien cellen, moet dan worden verwijderd en laminine putten gespoeld met PBS tweemaal 1X. Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in MND medium (0,5 ml / putje).

5. Stap 5: Axon Rek (Timing: 2 dagen)

1. Op differentiatie dag 7, het verzamelen van EBS in een 15 ml buis en laat EBS om zich te vestigen (ongeveer 3 min). Zuig het media-en re-suspend EBS in PBS. Laat EBS om vervolgens af te wikkelen en PBS te zuigen. Herhaal deze stap 3 keer. Voeg 1 ml Accumax (Millipore) de EBS meng en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Dan zuigen dan Accumax voor de EBS.
2. Om EBS dissociëren, voeg 3 ml van MND medium. Pipet op en neer 20 keer met een 1 ml Eppendorf micropipet (blauw tip) aan EBS te verstoren. Incubeer 2 min bij kamertemperatuur. Breng celsuspensie een 12x75 mm buis cel zeef dop (BD Falcon) een enkele celsuspensie te verkrijgen. Herhaal stap dissociatie met brokken en cellen bewaard door het filter om de opbrengst van afzonderlijke cellen te verrijken. De laatste single celsuspensie zal 6 ml zijn.
3. Voorzichtig mengen deze enkele celsuspensie en tellen cellen met behulp van een hemocytometer. Verdun cellen in MND medium (aangevuld met 10 ng / ml van elke BDNF, GDNF, CNTF en NT-3) met een dichtheid van 2x10 ⁵ cellen per ml. Voeg celsuspensie (0,5 ml / putje) en 24-well platen met poly-DL-ornithine/laminin beklede dekglaasjes (eerder bereid zoals hierboven beschreven). De gedifferentieerde cellen uit te breiden lange neurieten na 2 dagen in de cultuur (figuur 1D).

6. Representatieve resultaten

Figuur 1a toont een overzicht van het protocol. In stap 1 worden MES cellen gekweekt op PMEF en aangevuld met LIF om spontane differentiatie te voorkomen. In het algemeen, ongedifferentieerde MES kolonies zijn rond en compact, en hebben duidelijk gedefinieerde randen. De kolonies niet in contact met elkaar. Meestal moet MES cellen gesplitst in een verhouding van 1:4 elke 2 tot 3 dagen. Toch zal elke individuele cel lijn groeien met een ander tarief en de splitsingsverhouding dient empirisch te worden bepaald. Pijlen in figuur 1B geven de typische verschijning MES cellen na kweken op PMEF voedingsbodem gedurende 3 dagen. Deze kolonies zijn grote (50-100 micrometer in diameter), maar nog steeds te handhaven rond en gedefinieerd rands. In dit stadium van de kolonies klaar zijn voor differentiatie of subcultuur. Een pijl in Figuur 1B toont een kleine MES kolonie die u gewoonlijk 24 uur vinden na plating. Vier dagen na plating, MES cellen overwoekerd. Ze tonen een platte uiterlijk en het verlies van bepaalde grenzen aan te geven dat ze beginnen te differentiëren. Dergelijke cellen niet optimaal voor differentiatie in neuronale cellen.

Om MES-cellen differentiëren tot neuronen, MES-cellen moeten worden gekweekt in suspensie voorwaarden EB vorming mogelijk te maken. In stap 2 worden de ES-cellen overgebracht naar een cultuur oppervlak zonder een feeder-laag aan EB vorming te bevorderen. In deze stap worden ze geïncubeerd in Neural differentiatie medium aangevuld met Noggin, bFGF, en FGF-8 2 dagen direct cellen aan een neuraal lijn. Kleine Ebs worden onder de microscoop op dag 1 van differentiatie. Zij moeten drijvend in het medium. Overdracht PMEF is ook te vinden op dag 1differentiatie en worden verwijderd. Deze cellen zich te houden aan bacteriële gerechten worden dus geëlimineerd bij het EBS worden gepasseerd om een ​​nieuwe bacteriële schotel. Aldus op dag 2 differentiatie moet weinig of geen PMEF te zien in de kweekschaal. In stap 3, bleef de overdracht van EBS om nieuwe gerechten te verwijderen van de resterende PMEF te garanderen. EBS worden gekweekt in de Motor Neuron Differentiatie (MND) media aangevuld met RA en SAG gedurende 5 dagen om de cellen te differentiëren in motorische neuronen. Tijdens cultuur, EBS blijven groeien in omvang en kan worden gezien met het blote oog op differentiatie dag 3 ~ 4. Figuur 1C toont de microscopische verschijning van EBS op differentiatie dag 7. In tegenstelling tot de ongedifferentieerde cellen EBS tonen sterke fluorescentie gevolg van expressie van GFP. Deze EBS zijn optimaal onderscheiden en zijn klaar voor dissociatie. Flow cytometrie bleek dat 51% ± 0,8% van de cellen van de gescheiden ESS onderverdeeld in GFP tot expressie brengen ^5. In stap 5, de cultuur van these motorische neuronen in de aanwezigheid van GDNF, CNTF, BDNF, NT3 en resultaten in het verlengde van de lange axonale projecties. Figuur 1D toont het uiterlijk van gedifferentieerde cellen 2 dagen na de beplating van gescheiden EBS. Let op lange neurieten zich uitstrekt van de cellichamen van de vergulde cellen. Immunofluorescentie kleuring laat zien dat de GFP + de cellen van het pan-neuronale marker (neurofilament-middellange keten) en twee motor neuron specifieke markers, (Islet-1 en choline acetyltransferase, figuur 2) uit te drukken.

Figuur 1. Differentiatie van MES-cellen in motorische neuronen (foto heeft gewijzigd van Wu et al.. ^5). A) Regeling van de differentiatie protocol van MES cellen naar motorische neuronen. B) ongedifferentieerde cellen MES vormen door kolonies op de top van fibroblast voedingsbodem. Ze hebben zwakke GFP expressie. C) mes cellen werden gescheiden feeder lagen en culturood op low-attachment gerechten aan EBS te vormen. Tijdens de eerste twee dagen differentiatieproces werden de cellen blootgesteld aan 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF, en 20 ng / ml FGF-8. Vervolgens werden ze aangezet tot differentiëren met 1 uM retinezuur en 1 uM sonic hedgehog agonist SAG gedurende 5 dagen. Gedifferentieerde MES cellen uitgedrukt sterke GFP-fluorescentie. D) Na 7-daagse differentiatie, EBS waren los en uitgeplaat op poly-DL-ornithine/laminin gecoate platen. De gedifferentieerde cellen lange neurale processen verlengd na 2 dagen in de cultuur. Schaal bar = 200 micrometer. MN = motor neuron. B, C en D zijn helder veld beelden en B ', C' en D 'zijn overeenkomstige afbeeldingen fluorescentie.

Figuur 2. Karakterisering van MES cel afkomstige motor neuronen. Immunofluorescentiekleuring voor neurofilament middellange keten (NF-M, rood), Chat (rood), en Islet-1 (rood) was samenvalt met GFP (groen) expression. DAPI (blauw) werd gebruikt om de kernen vast te stellen. Schaal bar = 50 urn.

De kwaliteit van de MES-cellen is de meest kritische parameter voor een efficiënte productie van motorische neuronen. MES cellen moeten worden geteeld op PMEF om spontane differentiatie te voorkomen. Toevoeging van LIF helpt om de MES-cellen in een ongedifferentieerde toestand. Als MES cellen delen elke 12-15 uur, het kweekmedium wordt snel uitgeput en moet dagelijks worden vervangen.

Efficiënte activering van de Shh traject is een kritische parameter nodig motorneuron specificatie induceren. Shh eiwit (O & O-System), en Shh signalering agonisten zoals Hh-agonist HhAg1.3 (Curis, Inc), purmorphamine (Calbiochem), en SAG (EMD Chemicals) zijn allen toegepast om de vorming van motorische neuronen ^1-3 te bevorderen ^{, 10,11.} We vonden SAG tot een effectievere molecuul dan purmorphamine in het differentiëren van cellen naar een motor neuronale fenotype ^5. 1-2,5 uM purmorphamine met 1 uM RA nooit aan een differentiatie rendement van meer dan 20%. Echterin onze handen een combinatie van 1 pM van RA en 1 uM SAG gaf een differentiatie efficiëntie van ongeveer 25% procedures zonder neurale inductie stap.

Om verder te verbeteren differentiatie efficiency, voegen we een 2-daagse neurale inductie stap voorafgaand aan de motor neuron specificatie stap. Deze aanpak maakt gebruik van het feit dat zowel Noggin en FGF-signalering zijn cruciaal voor het vroege stadium van neurale inductie als embryonale cellen eerst in de neurale lijn ^6-9. Naast de neurale inductie, FGF signalering onderhoudt culturen als neurale voorloper cellen. Overexpressie van Fgf8 in de ontwikkelingslanden middenhersenen leidt tot een dramatische uitbreiding van de neurale voorloper bevolking in de ventriculaire zone ^12. Een combinatie van FGF-en Noggin werkt synergetisch in het induceren van zenuwweefsel vorming door het bevorderen van een posterior neurale identiteit ^9. Zo de twee dagen neurale inductie stap is om de cellen te richten MESde neurale lijn vóór de start van het proces van het motorneuron specificatie.

Het protocol beschreven is een modificatie en verbetering van de oorspronkelijke vaststaand protocol eerder beschreven ^1. Hoewel de tijdlijn van het genereren van motorische neuronen hetzelfde is, hebben we een aantal wijzigingen om de procedure te stroomlijnen en verbeteren van de opbrengst van motorische neuronen. Door het toevoegen van een neurale inductie stap om de differentiatie-protocol, zijn we in staat tot differentiatie efficiëntie te verhogen van 25% tot 50%. Ons protocol voorziet in een efficiënte aanpak van motorische neuronen afgeleid van MES-cellen te verrijken. Motorneuronen kan worden verkregen van patiënten en SMA een slechte gezondheid van primaire motorneuronen SMA muizen uitsluit isolatie van cellen van een voldoende hoeveelheid, kwaliteit en zuiverheid kwantitatieve analyses van eiwitten beïnvloed deze ziekte voeren. Met behulp van deze MES cel protocol, konden we een motor neuron cel populatie van voldoende Quan te verkrijgenheid en zuiverheid voor een proteomics studie moleculaire wegen beïnvloed in spinale musculaire atrofie ⁵ te identificeren.