Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

1. Schritt 1: embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Cell Culture (Timing: 3 Tage)

1. Ausplattieren primäre embryonale Maus-Fibroblasten (PMEF)

1. Coat vier 100-mm Zellkulturschalen mit Gelatine für PMEF Haftung. 8 ml von 0,1% Gelatine-Lösung (StemCell Technologies) zu jeder Schale und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie das überschüssige Gelatine von Gerichten. Nicht spülen das Geschirr.
3. Verdünnen Sie ein Fläschchen mit Mitomycin C-inaktivierten PMEF (Millipore), die ca. enthält. 5 x 10 ⁶ Zellen in 40 ml PMEF Medien (siehe Rezept in Tabelle 1) und Platte auf vier 100-mm Zellkulturschalen. Die PMEF eine Feeder-Schicht für MES-Zellen.
4. PMEF sollte mindestens einen Tag vor der Zugabe mES Zellkulturen plattiert werden. PMEF kann bis zu 1 Woche nach der Beschichtung verwendet werden.

2. Plating mES Cells

Um die Effizienz von MES-Zell-Differenzierung in Motoneuronen zu überwachen, Verwendeten wir HBG3 kann eine ES-Zelllinie, die von einer transgenen Maus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des Promotors Motoneuronen Hb9 abgeleitet.

1. Defrost 1 Fläschchen HBG3 mES Zellen (ca. 1 x 10 ^7, beigetragen von Dr. Douglas Kerr, Johns Hopkins University) in einem 37 ° C warmes Wasserbad. 5 ml ES Medien (siehe Rezept in Tabelle 1) in einem 15 ml-Tube und Spin-down-Zellen bei 800 rpm für 5 min.
2. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren mES Zellen in 20 ml ES Medien mit frisch zugegebenem Leukämiehemmfaktor (LIF) bei einer Endkonzentration von 10 ng / ml. HINWEIS: LIF sollte am Tag der Verwendung hinzugefügt werden und wird benötigt, um die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten.
3. Nehmen Sie 10 ml PMEF Medien aus dem PMEF in jeder Schale und mit 10 ml des HBG3 ES Zell-Suspension zu jedem Gericht.
4. 24 h nach der Beschichtung, bilden mES Zellen kleine Kolonien, ähnlich groß wie der Kolonie durch die Pfeilspitze in 1b dargestellt. 72 h nach dem Ausplattieren, coloniES Zunahme der Größe, da viele etwa 100 um im Durchmesser (Abbildung 1B, durch Pfeile angedeutet). Diese Zellen sind bereit für Differenzierung. Die Medien sollten täglich ausgetauscht werden, um die Proliferation von Zellen aufrecht zu erhalten.

2. Schritt 2: neurale Induktion (Timing: 2 Tage)

Zur Differenzierung von MES-Zellen in motorischen Neuronen zu induzieren, müssen mES Zellen aus PMEF getrennt werden und kultiviert in einer Suspension Umwelt. Gelatine beschichtete Kolben werden verwendet, um PMEF von MES-Zellen zu trennen.

1. Wenn mES Kolonien bereit sind für neurale Induktion (definiert als Differenzierung Tag 0), Mantel 2 T150 Flaschen mit 0,1% Gelatine (18 ml / Kolben) für 30 min bei Raumtemperatur und anschließend zu entfernen überschüssige Gelatine und waschen mit 1x PBS dreimal. HINWEIS: Jeder 100-mm-Schale Kultur wird ein T150-Gelatine beschichtete Kolben müssen PMEF trennen.
2. Entfernen Sie vorsichtig Medien durch Aspiration darauf achten, nicht zu lose befestigten Kolonien zu vertreiben. 10 ml PBS kurzly und entfernen Sie dann durch Absaugen zu Waschschritt abzuschließen.
3. MES-Zellen aus PMEF trennen, fügen 0,25% Trypsin / EDTA (3 ml / Schale, StemCell Technologies) und Inkubation für 3-5 min bei 37 ° C, bis die Stammzellen und PMEF von der Platte zu lösen. 15 ml frisches ES-Medien ohne LIF und Pipette Zellen nach oben und unten, um Kolonien (ca. 15-20 mal) zu brechen. Dann wurde zu einem 0,1% Gelatine beschichtete T150 Destillierkolben und Inkubation für 30 min bei 37 ° C Nach der Inkubation sollten PMEF auf die Oberfläche legen, während gelatinierte ES-Zellen zu schweben sollte. Sammeln Sie die schwimmenden mES Zellen in eine 50 ml Tube.
4. Spin-Down bei 800 UpM und Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Medium neurale Differenzierung (siehe Rezept in Tabelle 1).
5. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und dann Platte ungefähr 2 x 10 ⁶ Zellen mES auf einer 100 mm bakteriellen oder Suspension Kulturschale. Diese Platten erlauben Wachstum von Suspensionskulturen und fördern Bildung von Embryoidkörpern (EBS).
6. Auf differentiation Tag 1, bilden mES Zellen kleine schwimmende Aggregate (EVG), die sichtbar unter einem Lichtmikroskop sind. Jede Verschleppung PMEF in die Schale legen. Übertragen Sie die Suspensionszellen und Medien in ein 15 ml Tube und zentrifugieren bei niedriger Drehzahl (500 rpm) für 3 min. Medien sorgfältig absaugen, 10 ml frisches Medium neurale Differenzierung der EBs pelletiert und anschließend Platte Zellen in einem neuen bakteriellen Gericht. Zusätzlich zur Aufstockung der Medien, entfernt dieser Schritt keine PMEF tragen, die über aus dem Stand Schritt.
7. Auf Differenzierung Tag 2 sind EBs bereit, in Motoneuronen induziert werden.

3. Schritt 3: Motor Neuron-Spezifikation (Timing: 5 Tage)

1. Am Tag 2 Differenzierung, wirbeln die Kulturschale und überweisen Sie den Medien-und EBS in einem 15 ml-Tube. Lassen EBs durch die Schwerkraft (~ 10 min) oder durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (500 rpm) für 3 min zu begleichen.
2. Aspirieren Medium vorsichtig resuspendieren und EBs in 10 ml Motor Neuron Differenzierung (MND) Medium (siehe Rezept in
3. 200 um im Durchmesser und sollte stark GFP-Signale (Abbildung 1C) zum Ausdruck bringen - Am Tag 7 Differenzierung sollte EBs etwa 150 sein. Diese EBs sind bereit, voneinander zu trennen und plattiert auf poly-DL-ornithine/laminin beschichteten Schalen oder Deckgläser.

4. Schritt 4: Herstellung von Poly-DL-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (Timing: 2 Tage)

Zwei Tage vor distanziert EBs (dh auf die Differenzierung Tag 5), bereiten poly-DL-ornithine/laminin-coated Deckgläser.

1. Platz 12-mm-Deckgläschen jähriger (Warner Instruments) an der Unterseite eines 24-Well-Platte. 25 mg Poly-DL-Ornithin (Sigma-Aldrich) in 25 ml sterilem, doppelt destilliertem Wasser (d ₂ H ₂ O), um ein 10X-Stammlösung (1 mg / ml) zu erhalten. Wenn Sie bereit sind zu verwenden, machen Sie eine 1/10 Verdünnung von Poly-DL-Ornithin mit D ₂ H ₂ O zu erhalten concentRation von 100 g / ml. 0,5 ml zu jeder Vertiefung der Platte mit 24 Vertiefungen, Inkubation bei 4 ° C über Nacht.
2. Am folgenden Tag (Differenzierung Tag 6), absaugen Poly-DL-Ornithin und lassen die Teller und Deckgläser an der Luft trocknen in einer Gewebekultur Kapuze. Spülen Sie die Platte Brunnen mit D ₂ H ₂ O dreimal. Der Luft trocknen lassen für eine weitere Stunde.
3. 1 mg Mauslaminin (Millipore) in 5 ml kaltem Eis-1X PBS 100x Stocklösung (200 pg / ml) zu machen. Wenn Sie bereit sind zu verwenden, stellen Sie 1/100 Verdünnung in vereisten kalten 1X PBS (2 ug Laminin / ml). 0,5 ml / Well in einer 24-Well-Platte und Inkubation 4 ° C über Nacht. Vor der Aussaat Zellen, sollten überschüssige Laminin entnommen und Vertiefungen mit 1X PBS zweimal gespült. Deckgläser in MND-Medium (0,5 ml / Vertiefung) gespeichert werden.

5. Schritt 5: Axon Dehnung (Timing: 2 Tage)

1. Am Tag 7 Differenzierung, sammeln EBs in ein 15 ml Tube und lassen sich absetzen EBs (ca. 3 min). Aspirieren Medien und Re-Suspend EBs in PBS. Erlauben Sie EBs, sich niederzulassen und dann absaugen PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. 1 ml der Accumax (Millipore) der EBS, vorsichtig mischen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. Dann saugen überschüssiges Accumax für den EBs.
2. Um EBs distanzieren, 3 ml Medium MND. Pipettieren nach oben und unten 20 Mal unter Verwendung einer 1 ml-Eppendorf-Mikropipette (blaue Spitze), um EBs stören. Inkubieren für 2 min bei Raumtemperatur. Übertragen Zellsuspension auf eine 12x75 mm-Rohr mit Zellsieb Kappe (BD Falcon), um eine Einzelzellen-Suspension zu erhalten. Wiederholen diese Trennung Schritt mit den restlichen Klumpen und Zellen durch den Filter, so dass die Ausbeute von einzelnen Zellen anzureichern erhalten. Die endgültige Einzelzellsuspension werden 6 ml sein.
3. Vorsichtig mischen diese einzelne Zellsuspension und Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Verdünnte Zellen in MND Medium (ergänzt mit 10 ng / ml von jeder BDNF, GDNF, CNTF und NT-3) auf eine Dichte von 2x10 ⁵ Zellen pro ml. Zellsuspension (0,5 ml / Vertiefung) auf 24-Well-Platten, die poly-DL-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (zuvor hergestellt wie oben beschrieben). Die differenzierten Zellen verlängern lange Neuriten nach 2 Tagen in Kultur (1D).

6. Repräsentative Ergebnisse

1A zeigt einen Umriss des Protokolls. In Schritt 1 sind MES-Zellen auf PMEF kultiviert und ergänzt mit LIF eine spontane Differenzierung zu verhindern. Im Allgemeinen sind undifferenzierte Kolonien mES rund und kompakt und haben klar definierte Ränder auf. Die Kolonien sind nicht in Kontakt miteinander. In der Regel sollte mES Zellen bei einer 1:4-Verhältnis aufgeteilt werden alle 2 bis 3 Tagen. Jedoch wird jede einzelne Zelle Linie mit einer anderen Rate wachsen und das Split-Verhältnis muß empirisch ermittelt werden. Pfeile in Abbildung 1B zeigt das typische Erscheinungsbild von MES-Zellen nach Kultivierung auf einem PMEF Feeder-Schicht für 3 Tage. Diese Kolonien sind groß (50-100 um Durchmesser), aber immer noch rund und halten definierte Kantes. In diesem Stadium die Kolonien sind bereit für Differenzierung oder Subkultur. Eine Pfeilspitze in Abbildung 1B zeigt eine kleine Kolonie mES, dass Sie in der Regel finden 24 h nach der Beschichtung. Vier Tage nach dem Ausplattieren, werden mES Zellen überwachsen. Sie zeigen eine abgeflachte Aussehen und den Verlust der definierten Grenzen, was darauf hinweist, dass sie beginnen sich zu differenzieren. Solche Zellen sind nicht optimal für die Differenzierung in neuronale Zellen.

MES-Zellen in Motoneuronen zu differenzieren, müssen mES Zellen in Suspension kultiviert werden, um EB Bildung zu ermöglichen. In Schritt 2 werden ES-Zellen auf einer Kulturoberfläche ohne Feeder-Schicht in EB Bildung zu fördern übertragen. In diesem Schritt werden sie in neuronalen Differenzierung Medium mit Noggin, bFGF und FGF-8 für 2 Tage in direkter Zellen eines neuronalen Linie ergänzt inkubiert. Kleine EBs können unter dem Mikroskop an Tag 1 der Differenzierung beobachtet werden. Sie sollten in dem Medium zu schweben. Verschleppung PMEF kann auch am Tag 1 gefunden werdender Differenzierung und müssen entfernt werden. Diese Zellen, um bakterielle Gerichte so beseitigt werden, wenn EBs auf eine neue bakterielle Gericht sind passagiert haften. So, am Tag 2 der Differenzierung, sollte wenige oder keine PMEF in der Kulturschale zu sehen. In Schritt 3 fort Übertragung von EBs zu neuen Gerichten sollte Entfernung jeglichen verbleibenden PMEF zu gewährleisten. EBs sind im Motor Neuron Differenzierung (MND) Medien mit RA ergänzt SAG kultiviert und für 5 Tage, um die Zellen in motorischen Neuronen zu differenzieren. Während der Kultur, weiterhin EBs in der Größe wachsen und kann mit dem bloßen Auge eine Differenzierung Tag 3 ersichtlich ~ 4. 1C zeigt das mikroskopische Bild von EBs auf die Differenzierung Tag 7. Im Gegensatz zu den undifferenzierten Zellen, für EBs starke Fluoreszenz aufgrund der Expression von GFP. Diese EBS sind optimal differenziert und sind bereit für die Dissoziation. Durchflusszytometrie zeigte, dass 51% ± 0,8% der Zellen von der dissoziierten EBs hatte in GFP exprimierenden Zellen differenziert ^5. In Schritt 5 Kultur these Motoneuronen in Gegenwart von GDNF, CNTF, BDNF, NT3 und Ergebnisse in Verlängerung der langen Vorsprünge axonalen. 1D zeigt das Aussehen des differenzierten Zellen 2 Tage nach dem Ausplattieren von dissoziierten EBs. Beachten Sie lange Neuriten sich von den Zellkörper der plattierten Zellen. Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die GFP +-Zellen die pan-neuronalen Marker (Neurofilament-mittlerer Kettenlänge) und zwei Motoneuronen spezifische Marker, (Islet-1 und Cholinacetyltransferase, 2) zu exprimieren.

Abbildung 1. Differenzierung von MES-Zellen in Motoneuronen (Bild von Wu et al modifiziert. ^5). A) Schema der Differenzierung Protokoll von MES-Zellen zu Motoneuronen. B) Undifferenzierte Zellen bilden mES runde Kolonien auf der Oberseite eines Fibroblasten-Feeder-Schicht. Sie haben schwache GFP-Expression. C) MES-Zellen wurden von Feeder-Schichten getrennt und KulturvereineRot auf Low-Befestigung Gerichte zu EBs zu bilden. In den ersten beiden Tagen nach der Differenzierung wurden die Zellen auf 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF und 20 ng / ml FGF-8 ausgesetzt. Anschließend wurden sie bewogen, mit 1 uM Retinsäure und 1 uM Sonic-Hedgehog-Agonist SAG für 5 Tage zu unterscheiden. Differenzierte Zellen exprimiert mES starke GFP-Fluoreszenz. A) Nach dem 7-tägigen Differenzierung wurden EBs dissoziiert und vergoldet auf poly-DL-ornithine/laminin beschichteten Platten. Die differenzierten Zellen verlängert langen neuronalen Prozesse nach 2 Tagen in Kultur. Maßstab = 200 um. MN = motorischen Neurons. B, C und D sind Hellfeld-Bilder und B ', C' und D 'sind entsprechende Fluoreszenz-Bildern.

Abbildung 2. Charakterisierung von MES-cell-derived Motoneuronen. Immunfluoreszenzfärbung für Neurofilament mittlerer Kettenlänge (NF-M, rot), ChAT (rot) und Islet-1 (rot) fiel mit GFP (grün) SuchbegriffMultisession. DAPI (blau) wurde verwendet, um die Kerne zu identifizieren. Balken = 50 um.

Die Qualität der mES Zellen ist die kritischen Parameter zur effizienten Erzeugung von Motoneuronen. mES Zellen müssen auf PMEF kultiviert werden, um spontane Differenzierung zu verhindern. Die Zugabe von LIF hilft bei der Erhaltung der die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand. Als MES-Zellen teilen sich alle 12 bis 15 h wurde das Kulturmedium verarmt rasch und muss täglich ersetzt werden.

Effiziente Aktivierung des Shh-Weg ist ein kritischer Parameter benötigt, um Motoneuronen Spezifikation zu induzieren. Shh-Protein (R & D-System) und Shh-Agonisten wie Hh-Agonist HhAg1.3 (Curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem) und SAG (EMD Chemicals) wurden alle benutzt, um die Bildung von Motoneuronen ^03.01 fördern ^{, 10,11.} Wir fanden die SAG um eine effektivere Molekül als purmorphamine in differenzierenden Zellen in Richtung einer motorischen neuronalen Phänotyp ⁵ sein. 1 bis 2,5 uM purmorphamine mit 1 uM RA gab nie eine Differenzierung Wirkungsgrad von mehr als 20%. Jedochin unseren Händen eine Kombination von 1 uM von RA und 1 uM der SAG gab eine Differenzierung Wirkungsgrad von ca. 25% in Verfahren ohne neurale Induktion Schritt.

Zur weiteren Verbesserung der Effizienz Differenzierung, fügen wir einen 2-Tages Neuralinduktion Schritt vor der Motoneuronen Spezifikation Schritt. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, dass sowohl Noggin und FGF entscheidend für die frühen Neuralinduktion sind beim Einsatz von embryonalen Zellen zunächst das neuronale Linie ^6-9 in Kraft. Neben der neuralen Induktion, unterhält FGF Kulturen als neuralen Vorläuferzellen. Eine Überexpression von Fgf8 in der sich entwickelnden Mittelhirn führt zu einer drastischen Ausweitung der neuralen Vorläuferzellen Bevölkerung in der ventrikulären Zone ^12. Eine Kombination von FGFs und Noggin wirkt synergistisch bei der Induktion von Nervengewebe Bildung durch die Förderung einer hinteren neuronalen Identität ^9. So ist die 2-Tages-Neuralinduktion Schritt wurde entwickelt, um die MES-Zellen in Richtung zu lenkendas neuronale Linie vor der Einleitung des Verfahrens von Motoneuronen-Spezifikation.

Das hier beschriebene Protokoll ist eine Modifikation und Erweiterung der ursprünglichen festgelegten Protokoll zuvor beschrieben ^ein. Obwohl der Timeline erzeugen Motoneuronen ist das gleiche, haben wir eine Reihe von Änderungen, um das Verfahren zu straffen und verbessern die Ausbeute von Motoneuronen gemacht. Durch das Hinzufügen eines neuralen Induktion Schritt zur Differenzierung Protokoll, sind wir in der Lage, die Differenzierung Wirkungsgrad von 25% auf 50% zu erhöhen. Unser Protokoll bietet einen effizienten Ansatz zur motorischen Neuronen von MES-Zellen abgeleitet bereichern. Motoneuronen können nicht von SMA-Patienten gewonnen werden und die schlechte Gesundheit der primären Motoneuronen von SMA-Mäusen verhindert Isolierung von Zellen in ausreichender Menge, Qualität und Reinheit zu quantitativen Analysen von Proteinen in dieser Krankheit betroffen durchzuführen. Mit dieser Meldung Zelle Protokoll, konnten wir einen Motor Neuron Zellpopulation ausreichender Mengen zu erhaltenIdentität und Reinheit für eine Proteom-Studie zu molekularer Mechanismen bei spinaler Muskelatrophie ⁵ betroffen zu identifizieren.