La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

1. Paso 1: madre embrionarias de ratón (ES) de cultivo celular (Tiempo: 3 días)

1. Revestimiento fibroblastos primarios de embriones de ratón (PMEF)

1. Cubra cuatro platos de 100 mm de cultivo de tejidos con la gelatina para la adhesión PMEF. Añadir 8 ml de solución al 0,1% de gelatina (StemCell Technologies) a cada placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
2. Eliminar el exceso de gelatina a partir de los platos. No enjuague los platos.
3. Diluir un vial de mitomicina C inactivado PMEF (Millipore) que contiene aprox. 5 x 10 ⁶ células en 40 ml de PMEF los medios de comunicación (ver la receta en la Tabla 1) y la placa en cuatro de 100 mm placas de cultivo de tejidos. El PMEF proporcionar una capa alimentadora de células TEr.
4. PMEF deben ser cultivadas por lo menos un día antes de la adición de cultivos celulares TEr. PMEF se puede utilizar hasta 1 semana después de placas.

2. Revestimiento TEr células

Para controlar la eficacia de la diferenciación celular en neuronas motoras MES, Hemos utilizado HBG3, una línea de células ES derivada de un ratón transgénico que expresa EGFP bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9.

1. Descongelar un vial de células HBG3 MES (aprox. 1 x 10 ^7, aportados por el doctor Douglas Kerr, la Universidad Johns Hopkins) en un baño de agua 37 ° C. Añadir 5 ml de los medios de comunicación ES (ver la receta en la Tabla 1) en un tubo de 15 ml y centrifugar las células a 800 rpm durante 5 min.
2. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células MES en 20 ml de medio ES con recién añadido factor inhibidor de leucemia (LIF) a una concentración final de 10 ng / ml. Nota: L hay que añadir el día de su uso y es necesario para mantener las células MES en un estado indiferenciado.
3. Retire los medios de comunicación de 10 ml de la PMEF PMEF en cada plato y añadir 10 ml de la suspensión de células ES HBG3 a cada plato.
4. 24 h después de la siembra, las células TEr formar pequeñas colonias, similar en tamaño a la colonia indicada por la flecha en la Figura 1B. 72 horas después de placas, colonizaciónaumento es de tamaño, muchos siendo aproximadamente 100 micras de diámetro (Figura 1B, indicado por las flechas). Estas células están listas para la diferenciación. Los medios han de ser reemplazado a diario para mantener la proliferación de las células.

2. Paso 2: Inducción neural (Tiempo: 2 días)

Para inducir la diferenciación de las células TEr en neuronas motoras, las células TEr necesita ser separado de PMEF y se cultivaron en un medio ambiente de la suspensión. Gelatina matraces revestidos se utiliza para separar PMEF a partir de células TEr.

1. Cuando las colonias TEr están listos para la inducción neural (definido como día diferenciación 0), la capa 2 T150 matraces con 0,1% de gelatina (18 ml / matraz) durante 30 min a temperatura ambiente y después eliminar el exceso de gelatina y se lava con PBS 1x tres veces. NOTA: Cada cultura plato de 100 mm se necesita un frasco de gelatina T150-revestido para separar PMEF.
2. Retire con cuidado los medios de comunicación por aspiración, teniendo cuidado de no desalojar a colonias poco adheridas. Añadir 10 ml de PBS brevemente y luego eliminar por aspiración de completar el paso de lavado.
3. Para separar las células MEs de PMEF, añadir 0,25% de tripsina / EDTA (3 ml / placa, StemCell Technologies) e incubar durante 3-5 min a 37 ° C hasta que las células madre y PMEF desprenderse de la placa. Añadir 15 ml de medio fresco sin ES LIF y las células de la pipeta hacia arriba y abajo para romper las colonias (alrededor de 15-20 veces). A continuación, añadir a un 0,1% de gelatina recubierto T150 matraz y se incuba durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, PMEF debe adjuntar a la superficie gelatinizada, mientras que las células madre embrionarias deben estar flotando. Recoger las células flotantes TEr en un tubo de 50 ml.
4. Girar hacia abajo a 800 rpm y Resuspender las células en 10 ml de medio de diferenciación neuronal (ver la receta en la Tabla 1).
5. Cuenta las células utilizando un hemocitómetro y luego placa aproximadamente 2 x 10 ⁶ células TEr en una placa de cultivo de 100-mm bacteriana o suspensión. Estas placas permiten el crecimiento de los cultivos en suspensión y promover la formación de cuerpos embrionarios (EBS).
6. En diferenciaciónción día 1, las células TEr formar pequeños agregados flotantes (EBS) que son visibles bajo un microscopio de luz. Cualquier prórroga PMEF conectar a la antena. Transferir las células y los medios de suspensión en un tubo de 15 ml y se centrifuga a baja velocidad (500 rpm) durante 3 min. Aspirar los medios de comunicación con cuidado, añadir 10 ml de medio fresco a la diferenciación neural pellets EBS, y luego las células de la placa bacteriana en un plato nuevo. Además de la reposición de los medios de comunicación, este paso se elimina la PMEF que llevan desde el paso anterior.
7. En el día diferenciación 2, EBS están listos para ser inducida en neuronas motoras.

3. Paso 3: Especificación de la Neurona Motora (Tiempo: 5 días)

1. En el día de la diferenciación 2, agitar la placa de cultivo y transferencia de los medios de comunicación y EBS en un tubo de 15 ml. Vamos EBs asentarse por gravedad (~ 10 minutos) o por centrifugación a baja velocidad (500 rpm) durante 3 min.
2. Aspirar el medio de cuidado y EBS volver a suspender en 10 ml de diferenciación de las neuronas del motor (MND) medio (ver receta en el
3. El día 7 de diferenciación, EBS debe ser aproximadamente de 150 a 200 micras de diámetro y debe expresar fuertes señales de buenas prácticas agrarias (Figura 1C). Estos EBS están listos para ser disociado y chapada en poly-DL-ornithine/laminin placas revestidas o cubreobjetos.

4. Paso 4: Preparación de Poly-DL-ornithine/laminin cubreobjetos recubiertos (Tiempo: 2 días)

Dos días antes de la disociación EBS (es decir, el día de la diferenciación de 5), preparar cubreobjetos poly-DL-ornithine/laminin-coated.

1. Colocar 12-mm redondas cubreobjetos (Warner Instruments) en la parte inferior de una placa de 24 pocillos. Disolver 25 mg de poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) en 25 ml de agua estéril, doble destilada (d ₂ H ₂ O) para obtener una solución madre de 10 veces (1 mg / ml). Cuando esté listo para usar, realizar una dilución a 1/10 de poli-DL-ornitina con d ₂ H ₂ O para obtener concentración de 100 g / ml. Añadir 0,5 ml a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incuba a 4 ° C durante la noche.
2. El día siguiente (día diferenciación 6), aspirado poli-DL-ornitina y dejar que las placas de cubierta y de aire seco se desliza en una campana de cultivo de tejidos. Lavar los pocillos de la placa con el d ₂ H ₂ O tres veces. Deje secar al aire durante una hora.
3. Disolver 1 mg laminina de ratón (Millipore) en 5 ml de helado-frío 1X PBS para hacer solución madre 100x (200 ug / ml). Cuando esté listo para utilizar, crear dilución 1/100 en el helado frío PBS 1X (2 mg de laminina / ml). Añadir 0,5 ml / pocillo en una placa de 24 pocillos y se incuban en 4 ° C durante la noche. Antes de las células de siembra, laminina exceso debe ser eliminado y pozos enjuagó con 1X PBS dos veces. Los cubreobjetos se pueden almacenar en DMN medio (0,5 ml / pocillo).

5. Paso 5: Alargamiento AXON (Tiempo: 2 días)

1. En el día 7 diferenciación, recoger EBs en un tubo de 15 ml y permitir EBS para asentarse (aproximadamente 3 minutos). Aspirar medios de comunicación y de re-suspender EBs en PBS. Permitir EBs se asiente y luego aspirar el PBS. Repita este paso 3 veces. Añadir 1 ml de Accumax (Millipore) para el EBS, mezclar suavemente y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, aspirar el exceso de Accumax que cubre el EBS.
2. Para disociar EBS, añadir 3 ml de medio de MND. Pipetas arriba y hacia abajo 20 veces usando una micropipeta Eppendorf de 1 ml (punta azul) para interrumpir EBS. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferir la suspensión celular a un tubo de 12x75 mm con células colador tapa (BD Falcon) para obtener una suspensión de células individuales. Repita este paso disociación con el resto de grupos y células retenidas por el filtro con el fin de enriquecer el rendimiento de las células individuales. La suspensión final de células solo será de 6 ml.
3. Mezclar suavemente esta suspensión de células individuales y contar las células utilizando un hemocitómetro. Diluir las células en medio DMN (suplementado con 10 ng / ml de cada BDNF, GDNF, CNTF, y NT-3) a una densidad de 2x10 ⁵ células por ml. Añadir suspensión celular (0,5 ml / pocillo) a placas de 24 pocillos que contienen POly-DL-ornithine/laminin recubiertos cubreobjetos (previamente preparado como se ha descrito anteriormente). Las células diferenciadas se extienden neuritas largas después de 2 días de cultivo (Figura 1D).

6. Los resultados representativos

La Figura 1A muestra un esquema del protocolo. En el paso 1, las células se cultivan en TEr PMEF y suplementado con LIF para impedir la diferenciación espontánea. En general, no diferenciadas colonias TEr son redondos y compactos, y han definido claramente los bordes. Las colonias no están en contacto uno con el otro. Típicamente, las células TEr debe ser dividido en una proporción de 1:4 cada 2 ~ 3 días. Sin embargo, cada línea celular individual crecerá a un ritmo diferente y la relación de separación debe ser determinado empíricamente. Las flechas en la Figura 1B indican el aspecto típico de las células TEr después de cultivar en una capa alimentadora PMEF durante 3 días. Estas colonias son grandes (50-100 micras de diámetro), pero todavía mantienen borde redondo y definidos. En esta etapa las colonias están listos para la diferenciación o subcultivo. Una punta de flecha en la Figura 1B muestra una pequeña colonia MES que se encuentran típicamente 24 h después de placas. Cuatro días después de placas, las células TEr sido cubierto. Ellos muestran una apariencia aplastada y la pérdida de límites definidos, lo que indica que están empezando a diferenciarse. Tales células no son óptimas para la diferenciación en las células neuronales.

Para diferenciar las células TEr en neuronas motoras, las células TEr necesitan ser cultivados en condiciones de suspensión para permitir la formación de EB. En el paso 2, las células ES se transfieren a una superficie de cultivo sin una capa alimentadora para promover la formación de EB. En este paso, se incuban en un medio suplementado con diferenciación neuronal Noggin, bFGF, y FGF 8-durante 2 días a las células directos a un linaje neural. Pequeñas EBs puede observarse bajo el microscopio en el día 1 de diferenciación. Deben estar flotando en el medio. Prórroga PMEF también se puede encontrar en el día 1de la diferenciación y debe ser eliminado. Estas células se adhieren a los platos de bacterias que se eliminan cuando se EBs se pasan a un plato bacteriana nuevo. Así, por día 2 de diferenciación, PMEF pocas o ninguna debe ser visto en la placa de cultivo. En el paso 3, continuación de la transferencia de EBS para nuevos platos debe asegurar la eliminación de cualquier PMEF restante. EBS se cultivan en las neuronas motoras (MND diferenciación) los medios suplementados con AR y SAG por 5 días para diferenciar las células en las neuronas motoras. Durante el cultivo, EBS continuará creciendo en tamaño y se puede ver a simple vista en el día de diferenciación 3 ~ 4. Figura 1C muestra el aspecto microscópico de EBS en día la diferenciación 7. A diferencia de las células no diferenciadas, EBS muestran una fuerte fluorescencia debido a la expresión de GFP. Estos EBs son óptimamente diferenciados y están listos para la disociación. La citometría de flujo mostró que el 51% ± 0,8% de las células de la disociada EBs se habían diferenciado en células que expresan GFP ^5. En el paso 5, la cultura de THESE neuronas motoras en la presencia de GDNF, CNTF, el BDNF y NT3 resultados en la extensión de las proyecciones a largo axonal. Figura 1D muestra la apariencia de las células diferenciadas 2 días después de placas de disociarse EBS. Tenga en cuenta neuritas largas que se extienden desde los cuerpos celulares de las células cultivadas en placas. Tinción inmunofluorescente demuestra que las células GFP + expresan el marcador pan-neuronal (neurofilamentos-cadena media) y dos marcadores de motor neurona específica, (Islet-1 y colina acetiltransferasa, Figura 2).

Figura 1. La diferenciación de las células TEr en las neuronas motoras (imagen modificada de Wu et al. ^5). A) Esquema del protocolo de diferenciación de las células TEr a las neuronas motoras. B) las células no diferenciadas TEr forman colonias redondas en la parte superior de una capa alimentadora de fibroblastos. Tienen la expresión de GFP débil. C) Las células TEr fueron separados de las capas de alimentación y de culde color rojo en los platos de sujeción de baja para formar EBS. Durante los dos primeros días del proceso de diferenciación, las células fueron expuestas a 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, y 20 ng / ml de FGF-8. Posteriormente, fueron inducidas a diferenciarse con 1 mM de ácido retinoico y 1 mM de Sonic hedgehog SAG agonista durante 5 días. Células diferenciadas TEr expresó fluorescencia de GFP fuerte. D) Después de la diferenciación de 7 días, EBS se disocian y se colocaron en placas recubiertas poly-DL-ornithine/laminin. Las células diferenciadas extiende largos procesos neuronales después de 2 días de cultivo. Barras de escala = 200 micras. MN = de la neurona motora. B, C y D son imágenes brillantes sobre el terreno y B ', C' y D 'son las imágenes de fluorescencia correspondientes.

Figura 2. Caracterización de las neuronas motoras TEr derivadas de células. La tinción de inmunofluorescencia para la cadena de neurofilamentos medio (NF-M, de color rojo), chat (rojo), y el Islote de 1 (rojo) fue coincidente con las buenas prácticas agrarias (verde) expresión. DAPI (azul) se utilizó para identificar los núcleos. Barras de escala = 50 micras.

La calidad de las células MES es el parámetro más crítico para la generación eficiente de las neuronas motoras. TEr células deben ser cultivadas en PMEF para impedir la diferenciación espontánea. Además de LIF ayuda a mantener las células MES en un estado indiferenciado. Mientras que las células se dividen cada TEr h 12-15, el medio de cultivo se agota rápidamente y debe ser reemplazado a diario.

Activación eficaz de la vía de Shh es un parámetro crítico necesario para inducir la especificación del motor neurona. La proteína Shh (I + D del sistema), y agonistas de la señalización de Shh como agonista Hh HhAg1.3 (Curis, Inc.), purmorphamine (Calbiochem), y el SAG (Merck Chemicals) se han utilizado para promover la formación de las neuronas motoras ^{1-3 , 10,11.} Hemos encontrado SAG a ser una molécula más eficaz que purmorphamine en diferenciación de las células hacia un fenotipo neuronal del motor ^5. 1 a 2,5 purmorphamine mM mM con AR 1 nunca dio una eficiencia diferenciación de más del 20%. Sin embargoen nuestras manos una combinación de 1 M de la AR y 1 M de SAG hizo una diferenciación de la eficiencia de aproximadamente el 25% de los procedimientos sin una etapa de inducción neural.

Para mejorar aún más la eficiencia de diferenciación, se añade un paso 2-días inducción neural antes de la etapa especificación de la neurona motora. Este enfoque se aprovecha del hecho de que tanto Noggin y señalización FGF son cruciales para la primera etapa de inducción neural cuando las células embrionarias primero entrar en el linaje neural ^6-9. Además de la inducción neural, FGF señalización mantiene las culturas como las células precursoras neurales. La sobreexpresión de Fgf8 en el cerebro medio en desarrollo conduce a una expansión espectacular de la población de precursores neuronales en la zona ventricular ^12. Una combinación de FGF y Noggin actúa de forma sinérgica en la inducción de la formación de tejido neuronal mediante la promoción de una identidad posterior neuronal ^9. Así, el paso 2-días inducción neural está diseñada para dirigir las células hacia TErel linaje neural antes de la iniciación del proceso de especificación del motor neurona.

El protocolo aquí descrito es una modificación y mejora del protocolo original establecido descrito anteriormente ^1. Aunque la línea de tiempo de generar neuronas motoras es el mismo, hemos hecho una serie de modificaciones para simplificar el procedimiento y mejorar el rendimiento de las neuronas motoras. Mediante la adición de un paso de inducción neural para el protocolo de diferenciación, que son capaces de aumentar la eficiencia diferenciación del 25% al ​​50%. El protocolo proporciona un método eficiente para enriquecer las neuronas motoras derivadas de células MES. Las neuronas motoras no se puede obtener a partir de pacientes con SMA y la mala salud de las neuronas motoras primarias de ratones SMA impide el aislamiento de células de cantidad suficiente calidad y pureza para realizar análisis cuantitativos de proteínas afectadas en esta enfermedad. El uso de este protocolo de células MES, hemos sido capaces de obtener una neurona motora población de células de Quan suficienteidentidad y pureza para un estudio de proteómica para identificar las vías moleculares afectados en la atrofia muscular espinal ^5.