JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1

1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.234.244.98, User IP: 54.234.244.98, User IP Hex: 921367650

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    بروتوكول يصف نظام فعال وقابلة للتكرار نموذج لدراسة فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) الكمون وتنشيط. الفحص توظف متجانسة الثقافات الخلايا العصبية متعاطف، ويسمح للتشريح الجزيئية للفيروس الخلايا العصبية التفاعلات باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات بما في ذلك تدخل الجيش الملكي النيبالي والتعبير من البروتينات المؤتلف.

    Date Published: 4/02/2012, Issue 62; doi: 10.3791/3823

    Cite this Article

    Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., et al. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

    Abstract

    فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) يضع العدوى الكامنة مدى الحياة في الخلايا العصبية الطرفية. هذا خزان كامن هو مصدر الأحداث المتكررة التي تكفل إعادة تنشيط النقل وتسهم في المرض السريري. الأدوية المضادة للفيروسات الحالية لا تؤثر على خزان كامنة وأنه لا توجد لقاحات. في حين أن تفاصيل الجزيئي للتكرار التحللي هي جيدة تتميز، وآليات السيطرة على كمون في الخلايا العصبية لا تزال بعيدة المنال. مشتق من فهمنا الحالي للكمون من الدراسات المجراة في استخدام النماذج الحيوانية الصغيرة، التي لا غنى عنها لتحديد الاحتياجات الجينات الفيروسية ودور الاستجابات المناعية. ومع ذلك، فإنه من المستحيل التمييز بين آثار محددة على علاقة الفيروسات الخلايا العصبية من عواقب وأعم من العدوى بوساطة خلايا المناعة أو الدعم غير العصبية في الحيوانات الحية. وبالإضافة إلى ذلك، التجارب على الحيوانات غير مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، ومحدودة من حيث الخيارات المتاحة لمعالجة مضيفالعمليات. للتغلب على هذه القيود، وهناك حاجة ماسة إلى نظام الخلايا العصبية فقط أن يستنسخ في خصائص الجسم الحي من الكمون وإعادة تنشيط لكنه لم يقدم فوائد زراعة الأنسجة من حيث التجانس وسهولة الوصول إليها.

    نحن هنا يقدم في المختبر باستخدام نموذج مثقف الخلايا العصبية متعاطف الأولية من العقد الفئران عنق الرحم متفوقة (SCG) (الشكل 1) لدراسة HSV-1 الكمون وتنشيط يلائم معظم إن لم يكن كل من المعايير المطلوبة. بعد القضاء على الخلايا غير العصبية، يصاب شبه متجانسة TrkA + الثقافات الخلايا العصبية مع HSV-1 في وجود الأسيكلوفير (ACV) لقمع تكرار التحللي. التالية ACV إزالة، غير منتجة HSV-1 الإصابات التي تعرض بأمانة وضعت بصمات بكفاءة مقبولة من الكمون. والجدير بالذكر أن mRNAs التحللي، والبروتينات، والفيروسات المعدية تصبح غير قابلة للكشف، حتى في حالة عدم وجود اختيار، ولكن استتار المصاحب لنص (LAT) صريحةايون استمرت في نوى الخلايا العصبية. تتم المحافظة على الجينوم الفيروسي في عدد نسخة من متوسط ​​25 في الخلايا العصبية، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتكرار منتجة عن طريق التداخل مع PI3-كيناز / AKT إشارات أو انسحاب بسيط من عامل نمو الأعصاب 1. والمؤتلف HSV-1 EGFP ترميز تنصهر في Us11 بروتين فيروسي التحللي يوفر وظيفية، في الوقت الحقيقي وعلامة للحصول على النسخ الناتجة عن إعادة تنشيط أن كميا بسهولة. بالإضافة إلى العلاج الكيميائي، ويمكن منهجيات الوراثية مثل تسليم الحمض النووي الريبي التدخل أو الجينات النواقل lentiviral تطبيقها بنجاح على نظام السماح للدراسات الآلية التي من الصعب جدا، إن لم يكن مستحيلا، في الحيوانات. وباختصار، فإن SCG المستندة إلى HSV-1 كمون / تنشيط نظام يوفر قوية، وأداة ضرورية لكشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في HSV1 الكمون وتنشيط الخلايا العصبية في، لغزا محيرا منذ وقت طويل في علم الفيروسات التي قد تقدم حلا رؤى جديدة لتطوير علاجات جديدة هدف تيكان كامنا خزان هربس.

    Protocol

    1. العزلة والثقافة من الخلايا العصبية SCG من أجنة الفئران

    لتوفير سياق مفيد لفهم هذا البروتوكول، ومناقشة شاملة للأدب في وقت سابق ان وضع أساليب للثقافة العصبية SCG، بما في ذلك أساسا لثقافة SCG في المختبر، ركائز لوحة طلاء، ومكونات مصل الدم خالية من وسائل الإعلام، فإن ويشار إلى القارئ إلى مراجع 2-4.

    1. وقد أجريت على استخدام الفئران كمصدر للخلايا العصبية SCG فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة في إطار بروتوكول النشطة التي وافق عليها رعاية الحيوانات المؤسسي واستخدام لجنة (IACUC).
    2. قبل الشروع في تشريح، وإعداد الكولاجين وlaminin مطلي 96 زراعة الأنسجة أطباق جيدا. باستخدام جهاز pipetting متعدد القنوات، وملء جميع الآبار 96 مع محلول يحتوي على 0.66 ملغ / مل الكولاجين ذيل جرذ. على الفور بإزالة الكولاجين، والتي يمكن استردادها واستخدامها لمدة تصل إلى 8 التشريح. بعد إزالة تيهو الكولاجين، من المهم جدا للسماح للالآبار الجافة تحت غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي. مقدار الوقت الذي يستغرقه لتجف يعتمد على عدد من الآبار في الصحن. على سبيل المثال، فإنه عادة ما يستغرق 5-10 دقيقة تقريبا. للآبار في صحن 96 جيد لتجف، ولكن يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 30-40 دقيقة إذا تم استخدام أكبر بتنسيق 24 طبق بشكل جيد. فشل لتجف بشكل صحيح نتائج الآبار في المرفق SCG الفقراء. ثم كرر هذا الإجراء باستخدام محلول من 2 ميكروغرام / مل laminin. احتضان الحل laminin من لا يقل عن 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 مرطب حتى كنت على استعداد لوحة الخلايا العصبية الخاصة بك (خطوة 1.14).
    3. يصرح باستخدامها في الحصول عليها تجاريا إناث الفئران الحوامل باستخدام CO 2. بعد رش جيفة مع الايثانول 70٪، يتم إجراء شق على شكل حرف U حول البطن. بعد تقشير البشرة مرة أخرى، يتم في الثانية على شكل حرف U شق من خلال جدار عضلات البطن. الرحم مرئيا على رفع تصل طبقة عضلات البطن. إزالة الرحم ويحدث في 15 الطول طبق. فتح الرحم بعناية باستخدام مقص حادة لتجنب إتلاف الجراء داخل. يجب الإفراج عن كل كيس من الجرو لها الجنينية، وقطعت الحبل السري، والجرو محو النظيفة مع الايثانول 70٪ وKimwipes.
    4. يعمل في غطاء محرك السيارة تشريح، تضحية الذين لم يولدوا بعد الفئران الوليدة E21 بواسطة قص الرأس عن الجذع. تهدف المقص عند قاعدة العنق، وذلك فوق الكتفين. للكشف عن العقد، دبوس في اسفل الرأس (الرقبة من جانب متابعة) باستخدام الإبر G 23 في ثلاثة مواقع: أ) النخاع الشوكي؛ الثاني) الجلد الأمامي مرفوعتين فوق الأنف ودبس، والثالث) يجب أن تكون معلقة المريء / القصبة الهوائية بعيدا من قاعدة العنق.
    5. بحث عن * SCG 2 وضعه على جانبي والتشعب الشريان السباتي (2 SCGs في جنين). يقع SCG فقط تحت الفرع. فصل SCG من الشرايين عن طريق سحب والتشعب بعيدا. وضع العقد في 12 مل من وسائل الاعلام-L15 (تستكمل مع 0.4٪ D (+)-الجلوكوز) في أنبوب 15 مل مخروطي الشكل على الجليد.

    ق ق = "jove_content"> * وSCG غير شفاف عديم اللون وبالمقارنة مع مبهمة، والأنسجة الدهنية التي تحيط مصفر والتشعب. في محاولة لإزالة أكبر قدر من الأوعية الدموية والأنسجة الدهنية المتبقية، قبل جمع العقد.

    1. كرر 1.4 و 1.5 حتى يتم حصاد كل SCGs من الأجنة.
    2. منبذة بلطف العقد لمدة 1 دقيقة بمعدل 600 دورة في الدقيقة، ونضح وسائل الإعلام الزائدة.
    3. Resuspend على العقد في 1 مل من L15 وسائل الإعلام التي تحتوي على التربسين (0.25٪، من دون EDTA) وكولاجيناز (1 ملغ / مل). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتستنهض الهمم كل 10 دقيقة.
    4. إضافة 10 مل من C-وسائل الاعلام (1X MEM، 0.4٪ D (+)-الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، FBS 10٪) لإبطال نشاط التربسين وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بمعدل 600 دورة في الدقيقة.
    5. إزالة أكبر قدر من وسائل الإعلام التربسين / كولاجيناز كما * ممكن، ويغسل العقد مع 10ML من C-وسائل الاعلام. الطرد المركزي ل1 دقيقة بمعدل 600 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.

    * سوف كولاجيناز المتبقية interfeاعادة مع الركيزة الكولاجين اللازمة لمرفق الخلية على لوحة الثقافة.

    1. إزالة وسائل الاعلام غسيل وإعادة تعليق العقد في 1 مل من C-وسائل الإعلام ويسحن باستخدام 21 إبرة G تعلق على حقنة 5 مل إلى فصل كتل كبيرة من الخلايا *. الانتهاء من triturating مع إبرة G 23 حتى كتل مرئية فصلها.

    * احرص على عدم متمزج المفرط، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الخلايا. إذا كان التربسين والعلاج كولاجيناز كانت ناجحة، بحد أقصى 15 صعودا وهبوطا مع دورات الإبرة G 21؛ وينبغي أن ثلاث دورات مع إبرة G 23 يكون كافيا.

    1. تصفية الخلايا العصبية من خلال فصل النايلون 70 ميكرون فلتر [دينار بحريني مصفاة خلية العلوم البيولوجية] إلى أنبوب مخروطي 50 مل لتجاهل أي كتل المتبقية.
    2. سحب قسامة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تمت تصفيتها وتخلط مع أزرق التريبان لتحديد عدد من الخلايا الحية. حساب عدد الخلايا التي يكسكل بنشاطأودي الصبغة باستخدام عدادة الكريات.
    3. إزالة حل laminin من الأطباق 96 جيد انتظار في الحاضنة 37 درجة مئوية (انظر الخطوة 1.2). لا تجف الطبق، ويمكن استخدامها على الفور الحصول على الخلايا تصفيح مرة تتم إزالة laminin. * الاستغناء 5،000-6،000 مجموع الخلايا الحية (50-100 ميكرولتر لكل بئر) في الكولاجين وlaminin قبل المغلفة 96 زراعة الأنسجة طبق بشكل جيد. وتشمل 50 نانوغرام / مل عامل نمو الأعصاب (NGF) في C-وسائل الاعلام.

    * ومن المهم للغاية لتوظيف جيد تقنية زراعة الأنسجة عقيمة لأن يتم حذف المضادات الحيوية من نمو وسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون هناك تنوع كبير بين الكولاجين مصدرها من مختلف الموردين. لقد كان لدينا نتائج متسقة عبر دفعات باستخدام الفئران الكولاجين ذيل من ميليبور.

    1. في DIV (يوم في المختبر) 1، يستعاض عن C-الوسائط المستخدمة في لوحة الخلايا مع 50 NBM ميكروليتر (0.4٪ D (+) - الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، B-27 الملحق يحتوي على 50 نانوغرام / مل نيسان الخليج، 5aphidicolin ميكرومتر ميكرومتر و 20 5 فلورويوراسيل [5-الفلورية 2'-deoxyuridine]. احتضان الثقافات لمدة 5 أيام *. عند هذه النقطة، يمكن trypsinizing والعد الخلايا المتبقية في العديد من الآبار تحديد عدد الخلايا العصبية على قيد الحياة لعلاج وكيل المضادة للالإنقسامية. عادة، ما يقرب من 1،000 الخلايا العصبية تظل لكل بئر في لوحة 96 أيضا.

    * مشاكل تلوث فطرية أو جرثومية وعادة ما تكون واضحة في أول 24 ساعة من ثقافة. فحص كل بئر بعناية لنمو الجراثيم قبل وسائل الإعلام إلى استبدال الطلاء. إذا تتأثر سوى عدد محدود من الآبار، ويمكن التعامل معها مع حل التبييض المخفف، تشطف وتجفف مع برنامج تلفزيوني من أجل المضي قدما في التجربة. نوصي تكرار أي تجربة فيها حتى لعدد محدود من الآبار وكان التلوث الميكروبي. إذا لوحظ واسعة التلوث الميكروبي في الصحن 96 جيد، لا بد من انتهاء التجربة.

    2. عدوى من SCG عبادةالقوام مع HSV-1-EGFP Us11 وإنشاء الإختفاء

    عن خلفية مفيدة حول التقنيات الفيروسية، بما في ذلك انتشار فيروس الأساسية، وتحديد عيار الفيروس، وتعدد العدوى (وزارة الداخلية)، وعلى القارئ الرجوع إلى مرجع 5. لمناقشة البيولوجيا هربس، وعلى القارئ الرجوع إلى مرجع 6. أخيرا، وعلى القارئ الرجوع إلى المراجع 7-10 للاطلاع على أمثلة سابقة، والبروتوكولات الأخرى، وخلفية إضافية بشأن ألفا عدوى هربس التحللي من الخلايا العصبية SCG وللمقارنة مع تعديلات بروتوكول لدينا لدراسة وإعادة تنشيط كمون.

    1. في DIV 6، إضافة الأسيكلوفير (ACV)، نهائي تركيز 100 ميكرون الى وسائل الاعلام الموجودة في كل * جيدا. على سبيل المثال، إذا كان يحتوي على كل من 50 ميكرولتر، إضافة 25 ميكرولتر من مخزون ميكرومتر ACV 300. عادة، يتم إضافة ACV الليلة قبل الإصابة، ولكن يمكن أيضا أن يضاف 6-8 ساعة قبل العدوى.

    * ومن السابقمهم للحد من التلاعب ceedingly الجسدية لا لزوم لها من الخلايا العصبية في جميع الأوقات. ويجب أن يتم إزالة ببساطة واستبدال وسائل الإعلام أو إصابة مع مخزونات فيروس بلطف جدا، وببطء. خلاف ذلك، يمكن للضغط الناجم الميكانيكية تؤثر سلبا على سلامة الخلايا العصبية.

    1. في DIV 7، تصيب الثقافات SCG مع HSV-1-EGFP Us11 (الموصوفة في المرجع 11) في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) في الفترة بين 1 -2 (انظر التعليق أدناه على تحديد مهمة وزارة الداخلية الأمثل) *. إضافة الفيروس المخفف مباشرة الى وسائل الاعلام الموجودة في البئر. وتشمل مراقبة وهمية المصابة، والسيطرة على العدوى التحللي ايجابية في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى ACV. السماح للعدوى والمضي قدما لمدة 2-3 ساعة عند 37 درجة مئوية.

    * يتم احتساب وزارة الداخلية باستخدام عيار فيروس تحدد عن طريق إجراء فحص لوحة في خلايا فيرو (12) وعدد من الخلايا، مطلي الحية المصنف لكل بئر في خطوة 1.14. هذا الحساب مفيد فقط بالمعنى التشغيلية،كما أن عدد الخلايا مجموع المصنف يحتوي على الخلايا العصبية مع الدبقية تلويث، والخلايا الليفية. كما يتم قتل هذه الخلايا تلويث الفاصل عن طريق العلاج بالأدوية المضادة للالإنقسامية وكلاء وزارة الداخلية لفعالية الخلايا العصبية على قيد الحياة هو في الواقع أكبر. من الكمية الأولية ابتداء من 5000 - 6000 الخلايا الحية، ما يقرب من 1،000 الخلايا العصبية تبقى بعد معالجة المضادة للالإنقسامية وكلاء (وفقا لتقييم العد الخلية trypsinizing ومباشرة). يمكن أن أمثل وزارة الداخلية لاستخدامها عند اصابة الخلايا العصبية الثقافات تختلف نوعا ما من أحد فيروس إعداد الأوراق المالية إلى أخرى. مع كل إعداد جديدة من الفيروس، ونحن ننصح باختبار مجموعة محدودة من وزارة الداخلية مختلفة من 1 إلى 2. الهدف هنا هو التعرف على واحد يحتوي على الأقل على بقاء الخلايا العصبية الآثار والنتائج في أكبر عدد من الفعاليات إحياء محرض (المحددة في الفقرة 3). الفيروس Us11-EGFP هي مفيدة بشكل خاص في تحسين الظروف بسرعة ولكن واحدة يمكن استخدامها أيضا قراءات أخرى مثل فحص لوحة أو quantitative PCR ومما قد يساعد على استخدام فيروس تنقيته من خلال وسادة السكروز لإزالة الشوائب التي تقلل من بقاء الخلية، رغم أن هذا ليس ضروريا وليس إجراء روتيني.

    1. بعناية تحل محل وسائل الإعلام مع عدوى NBM جديد يحتوي على 50 نانوغرام / مل و 100 NGF * ACV ميكرومتر.

    * ومن المهم جدا أن يكون لطيف للغاية عند تغيير وسائل الإعلام عدوى. تهدف غيض من ماصة في جدار البئر وليس في قاع البئر، والسماح لوسائل الإعلام إلى الشريحة بلطف إلى أسفل على الخلايا. ويمكن حتى طرد سريع من وسائل الاعلام من ماصة توليد قوة كافية لفصل محاور عصبية من الركيزة ويسبب الخلايا لتنصل من عادة باعتباره ورقة من الخلايا. إلا إذا كان عدد محدود من الخلايا العصبية فصل (20-30٪)، فإن العواقب تكون أدنى شريطة أن تظهر الخلايا السليمة. الخلايا العصبية المنفصلة من المرجح أن أعد أكثر من مرة، ومع ذلك، لم يعد من محاور عصبية تمدد لطيف 1وسوف د محاور عصبية جديدة تنمو. في حين ليس الأمثل، ويمكن للتجربة والمضي قدما إذا تتأثر سوى عدد محدود من الآبار. إذا كان هناك انفصال واسعة من الخلايا العصبية (70-80٪)، نحن لا نوصي بما في ذلك البئر المتضررة (ق) في التجربة. إذا كان معظم الآبار تحتوي على الخلايا العصبية المنفصلة 70-80٪، ونحن نوصي إنهاء التجربة. في حين أن الخلايا العصبية قد أعد لا يزال، فإنها عادة ما سوف تشكل كتل كبيرة. يعقد هذا التقييم السليم للفرد الخلايا العصبية تنشيط. نوصي تكرار أي تجربة حيث لوحظت الآبار مع الخلايا العصبية منفصلة لضمان عدم تأثر معدلات تنشيط التزام من قبل فرق من الخلايا العصبية للآبار.

    وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جدا للتعامل مع الثقافات كما دائما بلطف وربما. إجهاد من الحركات، لا لزوم لها مفاجئ (بما في ذلك فتح وإغلاق متكررة من باب غرفة الحاضنة) أو بالقوة وسائل الاعلام ج تطبيقحل وسط ولد في قدرة الثقافات لدعم HSV-1 كمون، وربما أدى إلى ارتفاع معدلات غير مقبولة من تنشيط عفوية في تجربة معينة.

    1. المحافظة على الثقافات لمدة 6 أيام وخلال هذه الفترة الفيروس ستنشئ كمون. خلال هذه الفترة، واستخدام المجهر الفلورسنت لرصد الخلايا العصبية الصحة والتعبير Us11-EGFP كمؤشر على تكرار التحللي. يجب أن يتم الكشف Us11-EGFP فقط في مراقبة الآبار التي تفتقر ACV العلاج، مشيرا إلى العدوى الأولية الناجحة وتكرارها التحللي الإنتاجية. قد تظهر آثار الاعتلال الخلوي الخلايا العصبية حتى في غياب النمو الفيروسي الإنتاجية. وينبغي للثقافات المصابين عن كثب وبالمقارنة مع وهمية المصابة الخلايا العصبية.

    3. تنشيط والتقييم

    1. في DIV 14، استبدال بعناية وسائل الإعلام التي تحتوي على ACV مع وسائل الإعلام الجديدة التي تفتقر إلى ACV. إذا كان ذلك مناسبا، وتشمل الدوائية (أو البيولوجية) المتغيرات في هذا الوقت. أن تكون الصورةلدى عودتهم إلى اتباع الاحتياطات المنصوص عليها في 2.3.
    2. على مدى فترة يوم 5-6، ورصد الثقافات الحية باستخدام مجهر نيون للكشف عن الخلايا العصبية التي تمر تنشيط. وبدلا من جمع عينات لأنواع أخرى من التحليلات (البروتين، والأحماض النووية، لوحة فحص الخ).
    3. حساب تواتر تنشيط عن طريق حساب عدد من الآبار التي تحتوي على EGFP إيجابية الخلايا العصبية والتعبير عن هذا كنسبة من إجمالي عدد الآبار عينة. لاحظ أن التعبير EGFP في الفرد كذلك لا يميز بين هذا الحدث تنشيط الابتدائية وعدوى لاحقة نظرا لانتشار الفيروس. منذ يرد انتشار العدوى إلى ثقافة واحدة أيضا، ويعرف من الناحية التشغيلية واحد أو أكثر EGFP إيجابية في الخلايا العصبية وكذلك حالة تنشيط واحدة تحت هذه الظروف.

    * يمكن تنشيط أحداث متعددة تحدث في الثقافة، كما هو موضح في 1. لتمييز حدث تنشيط الأولية من انتشار فيروس الناتجة عن راكوشبالوتاي tivation، يمكن إضافة المانع encapsidation اتجاه و150138. من خلال منع encapsidation، لا تنتج فيروس المعدية وانتشار الناتجة عن تنشيط أمر غير ممكن. وهكذا، فإن إشارة EGFP الكشف في ظل وجود 150138-WAY يعكس عدد من الفعاليات إحياء مستقل ضمن ثقافة أحرق 1،13-15 جيدا. نلاحظ أن اتجاه و150138 فعالة فقط ضد السلالة HSV-1 باتون وغير متوفرة تجاريا. كبديل ل150138 الاتجاه، النظر في استخدام أي من الأمور التالية: أ) ويمكن استخدام فيروس متحولة ضعف في قدرتها على الانتشار إلى الخلايا المجاورة؛ الثاني) فيروس مراسل حيث يتم التعبير عن EGFP من المروج آي إي في وجود مستمر من ACV؛ الثالث) العلاج مع PAA ACV أو لمنع التعبير الجيني في وقت متأخر (والمعدية إنتاج فيروس)، يليه المناعي الأجسام المضادة الموجهة ضد استخدام منتج الجين IE.

    4. وسائل بديلة لتقييم إعادة تنشيط باستخدام الفحص

    وينبغي الحصول على ontent "> النتائج من تجربة، فرد واحد من إعداد واحدة من SCG. لا يمكن أن يؤديها التجارب النسخ المتماثل مع الاستعدادات SCG مستقل طالما جرى تكرار استخدام كل دفعة SCG واحدة.

    1. تقييم النصوص HSV-1 التحللي. جمع الجيش الملكي النيبالي في الأوقات المطلوبة بعد إزالة ACV في وجود أو عدم وجود محرضات التجريبية المختلفة لتنشيط. عند استخدام 96 لوحات ثقافة جيدة، ونحن نوصي تجميع ما لا يقل عن 20 بئرا معا من أجل كل عينة (حوالي 10 5 خلايا لكل عينة الحمض النووي الريبي). بدلا من ذلك، يمكن مطلي SCGs في جو من الآبار (مثلا لوحة 24 جيد، واستخدام 4-5 X10 4 خلايا / جيد). في حين أنه من المؤكد أن من الممكن الكشف عن الحمض النووي الريبي من أقل من 20 بئرا، وكميات صغيرة نتيجة المشاركة في تقلب عينة إلى عينة لا مبرر له.
    2. الكشف عن البروتينات HSV-1 التحللي. جمع lysates في الوقت المطلوب بعد تحريض تنشيط. إضافة 7،5 ميكرولتر من العازلة تحلل على كل من 10 ثells في لوحة 96 جيدا وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting. بدلا من ذلك، يمكن الكشف عن البروتينات الفيروسية بواسطة الفحص المجهري التألق المناعي غير المباشر. ويجب أن يتم طلي الأولية على ركيزة ركوب للتصوير مثل ساترة زجاجية معقمة التي كانت قبل المغلفة مع البولي-D-يسين (0.2 ملغ / مل، سيجما) قبل تقديم الطلب من الكولاجين وlaminin (انظر 1.10) .
    3. الكشف عن جزيئات معدية. جمع طاف على تنشيط الثقافة. إجراء فحص لوحة على monolayers من خلايا فيرو باستخدام التخفيفات التسلسلي للطاف. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء فحوصات لوحة باستخدام lysates الثقافات التجميد لتشمل إذابة الخلايا المرتبطة بها الجسيمات لتحديد عيار.

    5. ممثل النتائج

    ويوضح الشكل 2A على سبيل المثال حيث 1 trichostatin ميكرومتر A (TSA)، محفز معروف من تنشيط 16-18، يتم تطبيقها على SCG الثقافات إصابة خفية مع H من النوع البريSV1 سلالة مراسل EGFP-Us11. مع إدارة أمن النقل، إعادة تنشيط تصل إلى 50٪ من الحد الأقصى في غضون أيام 2، وبنسبة 5 أيام الهضاب تنشيط حوالي 60٪ من الآبار. خط الأساس ('عفوية') تنشيط ما يقرب من 10٪ في هذه التجربة، ويتراوح عادة من 10-20٪ باستخدام هذا النظام في المختبر. مستويات تنشيط أقصى تختلف تبعا الذي يستخدم محفز تنشيط. ويمكن تطبيق العديد من المحرضات تنشيط لمدة التجربة لأنها لا تتداخل مع تكاثر الفيروس الإنتاجية، ولكن هذا يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. قد محرضات أخرى، بما في ذلك أي كاشف يؤثر على بقاء الخلايا العصبية أو يعوق اكتمال دورة الحياة الإنتاجية الفيروسية، ويتطلب تطبيق نبض عابر لاستفزاز تنشيط.

    في حين تراكم EGFP-Us11 في كل بئر من هذه التجربة في تصور الشكل 2A يدل على تنشيط من الكمون، وأنه لا يميز ما إذا كانمشتق Us11-EGFP إشارة في الخلايا العصبية الفردية من حدث تنشيط مستقل، أو انتشار فيروس من خلال تنشيط الثقافة. لتقييم عدد من الخلايا العصبية التي تمر أحداث تنشيط مستقل في كل بئر، والثقافات معالجة مسبقة مع 150138 الاتجاه، وهو مركب يمنع انتشار الفيروس على وجه التحديد من خلال منع encapsidation من الحمض النووي الفيروسي الجينوم 13-15. تم علاج المصابين الثقافات الخلايا العصبية متعاطف مع 150138 الطريق وتنشيط يسببها مع إدارة أمن النقل. فقط تم الكشف عن أعداد كبيرة من الخلايا العصبية EGFP إيجابية في الآبار TSA المعاملة، مقارنة مع الثقافات سيطرة DMSO المعالجة، مما يدل على أن عددا من الفعاليات إحياء المستقلة تحدث في ثقافة الفرد (الشكل 2B).

    في مقايسة لدينا، وأعرب عن الصحفي Us11-EGFP من المروج Us11 الذاتية 11. منذ Us11 هو "صحيح في وقت متأخر" أو γ 2 التحللي الجين الفيروسي، ومطلوب الفيروسية تكرار الحمض النووي لexpressi قويفي. ويتضح هذا في الشكل (3)، كما هو اعاقة EGFP-Us11 تراكم من بوليميريز الحمض النووي الفيروسي حامض phosphonoacetic المانع (PAA) في الثقافات التي يسببها لإعادة تنشيط مع LY294002 المانع PI3-كيناز.

    الشكل 1
    الشكل 1. تخطيطي يوضح بروتوكول نموذجي تجريبي باستخدام الخلايا العصبية مثقف في المختبر لدراسة نظام HSV-1 الكمون وتنشيط. 1) بعد تشريح العقد عنق الرحم متفوقة (SCG) من E21 الفئران، ومطلي الخلايا العصبية فصلها في 96 أطباق جيدا، وتعامل مع الإنقسامية المضادة لل وكلاء لإزالة الخلايا غير العصبية. 2) بعد 6 أيام في المختبر (DIV) مصابون الثقافات مع المؤتلف HSV-1 الذي يحتوي على EGFP تنصهر لهذا الجين Us11 الفيروسات المشفرة في وقت متأخر (EGFP-HSV-1) في حضور الأسيكلوفير (ACV) المخدرات 1، المضادة للفيروسات التي كتل تكرار التحللي. 3) بحلول يوم 14 (DIV 14)، تتم إزالة الأسيكلوفير وEGFP التعبير عنلم يتم الكشف عن. ويمكن الحفاظ على الثقافات ثابت على هذا النحو لمدة 1 شهر أو أكثر، أو يمكن إضافة متغير اختبار لتقييم قدرتها على تنشيط استفزاز من الكمون. يمكن أن يكون المتغير في شكل جزيئات كيميائية صغيرة المانع، وهو جسم مضاد ضد neurotrophin قابل للذوبان أو خلية بروتين السطح، أو التعبير عن الفيروسة البطيئة 1 إما shRNA جينة معينة أو بروتين أعرب ectopically. ويتم رصد ثم تنشيط بتسجيله EGFP إيجابية الآبار في الوقت الحقيقي.

    الشكل 2
    الشكل 2. TSA ينشط HSV-1 في الثقافات SCG. أصيبوا خفية الثقافات SCG كما هو موضح في الشكل رقم 1. في DIV 14، تمت إزالة ACV واستبدالها مع وسائل الإعلام التي تحتوي على 1 ميكرومتر trichostatin A. (TSA) (أ) تم تصور والثقافات وسجل باستخدام المجهر مضان كل يوم بعد العلاج من تعاطي المخدرات لمدة 5 أيام. النسبة المئوية من الآبار التي تمر reactivatويظهر أيون على مدار التجربة مقارنة مع الثقافات مراقبة المعالجة DMSO. تم احتساب النسبة المئوية للتنشيط من قبل عدد من EGFP إيجابية آبار من أصل 20 بئرا من 96 لوحة الثقافة أيضا. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للمتوسط. (ب) تم علاج المصابين الثقافات خفية مع إدارة أمن النقل ومثبط لencapsidation الحمض النووي الفيروسي، وسيلة، 150138 (20 ميكروغرام / مل). وبالمقارنة مع عدد الخلايا العصبية EGFP + 48 ساعة بعد العلاج بالأدوية لسيطرة تعامل مع DMSO وطريقة 150138. كل نقطة بيانات يمثل نسبة الخلايا العصبية + EGFP من أصل 1000 الخلايا العصبية في ثقافة أيضا. شريط يظهر متوسط ​​النسبة المئوية للEGFP + الخلايا العصبية في بئر.

    الشكل (3)
    الشكل 3. EGFP detecion يعتمد على تكرار الحمض النووي الفيروسي. الثقافات SCG أصيبوا خفية ثم تعامل مع 10 ميكرون من LY29004، محفز معروف من تنشيط 1. تنشيط الناجمة عن LY (الأزرق) واق مقارنة بتلك تعامل مع الحمض النووي الفيروسي المانع التوليف، حامض phophonoacetic، PAA (300μg/ml، أحمر) والمركبين معا (الخضراء).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    هذه الثقافة الخلايا العصبية الأولية ونظام عدوى يوفر طريقة بسيطة وفعالة لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء HSV-1 الكمون وتنشيط. نظام يلخص بأمانة بصمات المقبولة من الكمون المحددة في كل من الإصابات البشرية والحيوانات الحية من النماذج. عندما يكون الفيروس كامنا في الثقافات SCG، لا يمكن أن الجسيمات الفيروسية المعدية ومنتجات يتم الكشف عن الجينات التحللي. فقط منتج الجين الفيروسي الكشف عنها في الخلايا العصبية خفية المصابة هي نسخة LAT غير الترميز، الذي يتراكم داخل النواة. تنشيط يتزامن مع التعبير عن الجينات الفيروسية التحللي ويتوج في إنتاج جزيئات معدية. وعلاوة على ذلك، هذه الخلية العصبية الأولية نموذج ثقافة تستجيب لمحرضات تنشيط قبول مثل إدارة أمن النقل، والتي يدفع بفعالية تكاثر الفيروس التحللي.

    محرضات كيميائية مختلفة حفز تنشيط بدرجات متفاوتة ومع حركية مميزة. على سبيل المثال، TSA يدفع بتكاثر تنشيط في 60-70٪ من الثقافات على مدى فترة 5 ملاحظة د. تم الإبلاغ عن مستويات مماثلة من TSA بفعل تنشيط باستخدام خفية المصابة، ورم القواتم الفئران متباينة PC12 الخلايا 17 أو الفئران الثقافات الخلايا العصبية مثلث التوائم 18. حركية تنشيط نلاحظ وعدم قدرة إدارة أمن النقل لإعادة تنشيط 100٪ من الثقافات يمكن أن تعكس عدم التجانس في قدرة الجينوم الكامنة إلى أن مزال الكظم. واتساقا مع هذا الاقتراح، وفعالية ادارة امن النقل الناجمة عن إعادة تنشيط يقلل ورد بوصفها وظيفة من الوقت في الثقافة 18. وعلى النقيض من إدارة أمن النقل، LY29004 يدفع تنشيط في 80-90٪ من الثقافات في غضون 2-3 د. الاختلافات في وضع كمون أو وزارة الداخلية من غير المحتمل أن تشكل الاختلافات في تنشيط محرض بين إدارة أمن النقل وLY29004، وشروطنا لإقامة الكمون يؤدي بتكاثر في حوالي 20٪ من الخلايا العصبية التي تعبر عن الحمار كمون الفيروس المشفرةociated نسخة LAT 1. ومع ذلك، فإننا قد لا تقاس إلا أن نسبة ضئيلة من الخلايا الجينوم الفيروسي إيجابي، مما يزيد من احتمال أن يؤدي الى تنشيط LY29004 في عدد أكبر من الخلايا العصبية من TSA. في حين أن الأسباب الكامنة وراء القدرة التفاضلية للTSA وLY20004 للحث على تنشيط يزال يتعين تحديد، فمن الواضح عوامل مختلفة يمكن أن يحفز تعزيز كفاءات مميزة مع تنشيط وحركية.

    وهناك جانب قوي من هذا النظام هو القدرة على استخدام البرية نوع الفيروس أو مراسل السلالات التي تتصرف indistinguishably من فيروس من النوع البري. خلافا لنظم في وقت سابق زراعة الخلايا لدراسة HSV-1 كمون، التي كانت تعتمد على متغيرات HSV المسخ التي كانت غير قادرة على التكاثر منتجة 16،18،19، واستعرض في 20، لدينا نظام نموذجي يشتمل على سلالة EGFP-المراسل الذي لا يمكن تمييزه من نوع البرية فيروس من حيث الكفاءة تكرار التحللي في الخلايا المستزرعة 11. استخدام وسيلة الخامس مراسل EGFPirus يسمح للتقييم بصرية حساسة ومباشرة من الكمون وتنشيط. في المقابل للصحفيين أخرى مثل غالاكتوزيداز β-، الأمر الذي يتطلب تثبيت وتحلل الخلايا لتحليلها، EGFP يسمح الباحث لرصد حالة الفيروسية في جميع أنحاء كامل من التجربة، وتوفير وسيلة سهلة، في الوقت الحقيقي وتقييم عفوية والمستحث تنشيط. أساليب أخرى، مثل PCR الكمي، ويمكن أيضا أن تستخدم للنظر في أنماط التعبير الجيني الفيروسية التي تسبق EGFP-التعبير، ومنذ وأعرب عن EGFP باسم الجينات "صحيح، في وقت متأخر"، أو لسلالات الفيروس التي تفتقر إلى الجين المراسل. بدلا من ذلك، يمكن تطوير فيروسات مراسل الأخرى حيث تنصهر EGFP إلى الجينات (E) على الفور، في وقت مبكر (IE) أو في وقت مبكر. ميزة من استخدام "صحيح، في وقت متأخر"، EGFP مراسل صفها هو أن التعبير عن EGFP تعتمد بشكل صارم على توليف الحمض النووي الفيروسي، مشيرا الى ان دورة حياة الفيروس قد انتقل إلى المرحلة النهائية التعبير الجيني المرتبطة بالنمو التحللي. دائرة الهجرة والجنسيةالعيدين، "صحيح، في وقت متأخر" التعبير EGFP إلى المستويات التي يمكن اكتشافها عن طريق التفتيش البصري يرتبط بشكل جيد مع إنتاج فيروس معد، وهو مؤشر البيولوجية التي تنشيط الإنتاجية حدث. ومع ذلك، فإنه يبقى أن نرى إذا كان كل عصبون أن تبدأ إعادة تنشيط، مقاسا دورة الإنتاجية (التحللي) التعبير الجيني، هي قادرة على التقدم من خلال برنامج التحللي كاملة لانتاج الفيروسات المعدية. ربما الفيروسات لديها فرصة كبيرة لإحباط برنامج التحللي واعادة الكمون. وبالتالي، قد أعرب عن الفيروسات مراسل EGFP تنصهر لشركة آي إي E أو البروتينات يؤدي إلى تنشيط قراءات أقل موثوقية. من هذا المنظور، وقارنت بين كفاءة تنشيط تقاس باستخدام EGFP، للصحفيين أعرب من آي إي، E، أو المروجين في وقت متأخر، أو حتى لمراسل معا مع مختلف البروتينات الفلورية مراسل تنصهر فيها إلى منتج الجين من كل فئة حركية (أي مقابل E مقابل ان) في وقت متأخر أن تكون مفيدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا لدينا ثقافة الخلية العصبية نظام يمكن استخدامه مع ش HSV-1 مختلفالأمطار، بغض النظر عن قدراتهم neuroinvasive أو القدرة على تنظيم الاستجابة المناعية للمضيف 21-24. أخيرا، يمكن تطبيق هذا النظام في ثقافة المختبر الموصوفة هنا إلى غيرها من أنواع الخلايا العصبية وخارج الجسم الحي العقد الثقافات الهامشية التي تم الحصول عليها من مستويات عليا من الأنواع، بما في ذلك البشر 25-27.

    باستخدام مجموعة من السكان نقية من الخلايا العصبية، والدراسات التفصيلية للتفاعلات بين HSV1 ومضيفه العصبية على المستوى الجزيئي هي الآن ممكن. بشكل ملحوظ، وهذا النظام نموذج يتجنب الكثير من القضايا المعقدة المرتبطة كمون دراسة وتنشيط المناعة في الحيوانات، حيث يتم الطبقات مستويات إضافية من السيطرة على قمة التفاعل الفيروسات الخلايا العصبية الأساسية. وعلاوة على ذلك، والعمل في هذا النظام يدل بوضوح على أن هناك بالفعل علاقة مستقرة بين الفيروس والخلايا العصبية المضيفة التي يمكن أن تنشأ والحفاظ عليها من دون مساعدة من استجابة المناعة المكتسب. في حين الفطرية وadaptivحصانة ه تلعب بوضوح دورا هاما في علم الأحياء من العدوى هامبورغ كامن، الفيروس لديه القدرة الذاتية ط) لإنشاء عدوى غير منتجة تشبه الكمون في الخلايا العصبية، والثاني) للتبديل إلى التحللي، برنامج النسخ المنتجة ردا على البيئة وتطبق الاشارات العصبية إلى الخلايا العصبية وحدها. الأهم، يمكن الآن الأساس الجزيئي لهذه العلاقة الفريدة بين هامبورغ والخلايا العصبية في أن تشريح باستخدام خلية، الدوائية البيولوجية إسكات الجينات، وأدوات توصيل الجينات 1. دراسات من هذا النوع التي تركز على الخلايا العصبية وفيروس في عزلة ليست ممكنة في النماذج الحيوانية حيث أنواع الخلايا عدة تشغل مقصورة عقدي. نأمل أن باستخدام هذا النظام النموذجي، فهم شامل للدوائر الجزيئية المعقدة التي تنظم HSV-1 كمون في الخلايا العصبية يمكن أن يتحقق في نهاية المطاف. كلما كان ذلك ممكنا، ويمكن بعد ذلك مبادئ استقاها من هذا النظام الخلايا العصبية مثقف يتم اختبارها في الجسم الحي باستخدام أنشئت حيوان مودلس، مما يدل على الطابع التكاملي بين هذين النهجين في الدراسة الشاملة للكمون HSV-1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    نشكر المقيمين على اقتراحاتهم مدروس التي ساعدت على تحسين هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المنح لMVC (NS21072، HD23315)، ACW (GM61139، S10RR017970) والدردشة (AI073898، GM056927) من المعاهد الوطنية للصحة. وأيد عضو الكنيست في جزء من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (5T32 AI007180).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
    1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
    1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
    5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
    96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
    Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
    Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
    B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
    Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
    D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
    Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
    Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
    Neurobasal medium Invitrogen 12348
    Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
    Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
    Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
    Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
    Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

    References

    1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J.Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A.C., Mohr, I., & Chao, M.V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8 (4), 320-30 (2010).
    2. Johnson, M.I. "Primary cultures of sympathetic ganglia." In: Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed., Fedoroff, S. & Richardson, A., eds., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 71-94 (2001).
    3. Letourneau, P.C., "Preparation of substrata for in vitro culture of neurons." In: Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed., Fedoroff, S. & Richardson, A., eds., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 245-254 (2001).
    4. Price, J.P. & Brewer, G.J. "Serum-free media for neural cell cultures." In: Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed., Fedoroff, S. & Richardson, A., eds., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 255-264 (2001).
    5. Flint, S.J., Enquist, L.W., Racaniello, V.R., & Skalka. A.M. Principles of virology. ASM Press, 3rd Ed., (2008).
    6. Roizman, B. & Pellett, P.E. "The family Herpesviridae: A brief introduction." In: Fields Virology, 4th, Ed., Knipe, D.M. & Howley, P.M., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2, 2381-2397 (2001).
    7. Price, R.W., Rubenstein, R., & Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71 (2), 127-140 (1982).
    8. Tomishima, M.J. & Enquist, L.W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154 (4), 741-752 (2001).
    9. Ch'ng, T.H., Flood, E.A., & Enquist, L.W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
    10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H.M., Bennett, J., Enquist, L.W, & Friedman, H.M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79 (21), 13362-13372 (2005).
    11. Benboudjema, L, Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S.W., & Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77 (17), 9192-9203, (2003).
    12. Blaho, J., Morton, E.R., & Yedowitz, J.C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1, (2005).
    13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T.R., Vernon, S.K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B.L., O'Hara, B.L., Bloom, J.D., & Johann, S.V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74 (19), 9054-9061 (2000).
    14. Newcomb, W.W. & Brown, J.C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76 (19), 10084-88 (2002).
    15. Pesola, J.M., Zhu, J., Knipe, D.M., & Coen, D.M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79 (23), 4516-14525 (2005).
    16. Arthur, J.L., Scarpini, C.G., Connor, V., Lachmann, R.H., Tolkovsky, A.M., & Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75 (8), 3885-3895 (2001).
    17. Danaher, R.J., Jacob, R.J., Steiner, M.R., Allen, W.R., Hill, J.M., & Miller, C.S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11 (3), 306-17 (2005).
    18. Terry-Allison, T., Smith, C.A., & DeLuca, N.A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71 (22), 12394-12405 (2007).
    19. Harris, R.A. & Preston, C.M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol 72 (4), 907-913 (1991).
    20. Wagner, E.K. & Bloom, D.C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
    21. Strelow, L.I., Laycock, K.A., Jun, P.Y., Rader, K.A., Brady, R.H., Miller J.K., Pepose, J.S., & Leib D.A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75 (9), 2475-2480, (1994).
    22. Stroop, W.G., & Banks, M.C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87 (1), 14-22 (1994).
    23. Sawtell, N.M., Poon D.K., Tansky, C.S., & Thompson, R.L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
    24. Thompson, R.L., Cook, M.L., Devi-Rao, G., Wagner, E.K., & Stevens, J.G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58 (1), 203-211 (1986).
    25. Wilcox, C.L., Smith, R.L., Freed, C.R., & Johnson, E.M., Jr. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10 (4), 1268-1275 (1990).
    26. Roehm, P.C., Camarena, V., Gardner, J.B., Wilson, A.C., Mohr, I., & Chao, M.V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121 (10), 2268-2275 (2011).
    27. Kuhn, M.A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M.V., & Roehm, P.C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology., In press, (2012).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter