JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

En primær Neuron Kultur System for Studiet af Herpes Simplex Virus Latency og genaktivering

1, 1, 2, 3, 2,4,5,6,7, 1, 1

1Department of Microbiology, New York University School of Medicine, 2Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute for Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, 3Department of Otolaryngology, New York University School of Medicine, 4Department of Cell Biology, New York University School of Medicine, 5Department of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine, 6Department of Psychiatry, New York University School of Medicine, 7Center for Neural Science, New York University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.196.69.189, User IP: 54.196.69.189, User IP Hex: 918832573

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Protokollen beskriver en effektiv og reproducerbar model til undersøgelse herpes simplex-virus type 1 (HSV-1) latens og reaktivering. Assayet anvender homogene sympatiske neuron kulturer og tillader den molekylære dissektion af virus-neuron interaktioner med en række værktøjer, herunder RNA-interferens og ekspression af rekombinante proteiner.

    Date Published: 4/02/2012, Issue 62; doi: 10.3791/3823

    Cite this Article

    Kobayashi, M., Kim, J. Y., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., et al. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

    Abstract

    Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) indfører en livslang latent infektion i perifere neuroner. Denne latente reservoir er kilden til tilbagevendende genaktiveringssignaler begivenheder at sikre transmission og bidrage til klinisk sygdom. Aktuelle antivirale ikke påvirke latente reservoiret og der er ingen vacciner. Medens de molekylære detaljer lytisk replikation er velkarakteriserede, mekanismer, der styrer latens i neuroner forbliver vanskeligt. Vores nuværende forståelse af latens er afledt fra in vivo-undersøgelser med små dyremodeller, der er nødvendige for at definere virusgenprodukter krav og den rolle i immunresponser. Men det er umuligt at skelne specifikke virkninger på virus-neuron forhold fra mere generelle virkninger af infektion medieret af immune eller ikke-neuronal bæreceller i levende dyr. Hertil kommer, er dyreforsøg dyrt, tidskrævende, og begrænset i form af tilgængelige muligheder for at manipulere værtprocesser. For at overvinde disse begrænsninger er en neuron-blot-systemet desperat behov, der gengiver in vivo egenskaber latens og reaktivering men giver fordelene ved vævsdyrkning med hensyn til ensartethed og tilgængelighed.

    Her præsentere et in vitro-model under anvendelse af dyrkede primære sympatiske neuroner fra rotte superior cervikal ganglie (SCG) (figur 1) for at studere HSV-1 latens og reaktivering, der passer bedst, hvis ikke alle de ønskede kriterier. Efter at eliminere ikke-neuronale celler, er nær-homogene TrkA + Neuron kulturer inficeret med HSV-1 i nærvær af acyclovir (ACV) for at undertrykke lytisk replikation. Efter ACV fjernelse af ikke-produktive HSV-1-infektioner, som trofast udviser accepterede kendetegnende for ventetid er effektivt etableret. Især lytiske mRNA'er, proteiner og infektiøs virus bliver påvises, selv i fravær af selektion, men latens-associeret transkript (LAT) udtrykkerion fortsætter i neuronal kerner. Virusgenomer holdes ved et gennemsnitligt antal kopier af 25 per neuron og kan induceres til produktivt replikere ved at interferere med PI3-kinase / Akt signalering eller simple tilbagetrækning af nervevækstfaktor 1. Et rekombinant HSV-1 koder for EGFP fusioneret til det virale lytiske proteinet Us11 tilvejebringer et funktionelt realtid markør for replikation skyldes reaktivering, der let kvantificeres. Ud over kemiske behandlinger kan genetiske metoder, såsom RNA-interferens eller genlevering via lentivirale vektorer anvendt med succes til systemet tillader mekanistiske undersøgelser, der er meget vanskelige, om ikke umuligt, i dyr. Sammenfattende giver SCG-baserede HSV-1 latency / reaktivering systemet en kraftfuld, nødvendigt redskab til at opklare de molekylære mekanismer, der styrer HSV1 ventetid og reaktivering i neuroner, et langvarigt puslespil i virologi hvis løsning kan tilbyde friske indsigt i udvikling af nye behandlingsformer, der Målet tHan latent herpesvirus reservoir.

    Protocol

    1. Isolering og dyrkning af SCG-neuroner fra rotte fostre

    At give en nyttig baggrund for at forstå denne protokol, og for en omfattende diskussion af tidligere litteratur, etablerede metoder til SCG neuron kultur, herunder grundlaget for SCG in vitro-kultur, plade-belægningssubstrater, og de ​​komponenter i serum-frie medier, læseren henvises til referencer 2-4.

    1. Brugen af rotter som en kilde til SCG-neuroner blev gennemført i overensstemmelse med NIH retningslinjer i henhold til en aktiv protokol, der er godkendt af Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC).
    2. Før påbegyndelse af dissektion fremstille collagen og laminin coatede 96-brønds vævskulturskåle. Ved anvendelse af en multi-kanal pipettering indretning, fylde alle 96 brønde med en opløsning indeholdende 0,66 mg / ml rotte hale collagen. Fjern straks kollagen, der kan genvindes og anvendes til op til 8 dissektioner. Efter fjernelse tHan collagen, er det meget vigtigt at lade brøndene tørre under en laminar strømningshætte. Den tid, det tager at tørre afhænger af antallet af brønde i skålen. For eksempel tager det typisk omkring 5-10 min. for brønde i en 96-brønds skål til at tørre, men kan tage op til 30 - 40 minutter, hvis en større format 24 brønde anvendes. Manglende korrekt tørre brønde resulterer i dårlig SCG fastgørelse. Derefter gentages proceduren under anvendelse af en opløsning af 2 ug / ml laminin. Inkubér laminin opløsning af mindst 2 timer ved 37 ° C i en befugtet CO2-inkubator indtil man er klar til pladen Deres neuroner (trin 1.14).
    3. Kommercielt fremstillet drægtige rotter aflivet med CO2. Efter påsprøjtning af kadaver med 70% ethanol, er en U-formet indsnit omkring maven. Efter skrælning tilbage på huden, er en anden U-formet indsnit gennem den abdominale muskulatur væg. Livmoderen er synlig ved at løfte op i mavemuskel lag. Fjerne livmoderen og anbringes i en 15cm parabol. Åbn forsigtigt livmoderen ved hjælp af en stump saks for at undgå at beskadige hvalpene inden. Hver hvalp skal frigøres fra sin embryonale SAC, navlestrengen skåret, og hvalpen aftørres med 70% ethanol og Kimwipes.
    4. Arbejde på en dissektion hætte, ufødte E21 rotteunger ofre ved at klippe hovedet fra kroppen. Sigte saksen i bunden af ​​halsen, lige over skuldrene. For at udsætte ganglier, pin ned hoved (halsen opad) bruger 23 G kanyler i tre steder: i) rygmarven ii) forreste huden trukket op over næsen og bandt og iii) spiserør / luftrør skal pinned væk fra bunden af ​​halsen.
    5. Se for de to SCG * placeret på hver side af halspulsåren bifurkaturen (to SCGs pr embryo). Den SCG ligger lige under grenen. Adskille SCG fra arterierne ved at trække i forgreningen hinanden. Placere ganglier i 12 ml af L15-medium (suppleret med 0,4% D (+)-glucose) i 15 ml konisk rør på is.

    * Den SCG er gennemskinnelig og farveløs forhold til den uigennemsigtige gullige adipøst væv, der omgiver bifurkaturen. Forsøger at fjerne så meget af de resterende fedtvæv og blodkar, før opsamling af ganglier.

    1. Gentage 1,4 og 1,5, indtil alle SCGs høstes fra embryoer.
    2. Forsigtigt centrifugeres ganglier i 1 minut ved 600 rpm og indsuges overskydende medie.
    3. Resuspender ganglier i 1 ml L15-medium indeholdende trypsin (0,25%, uden EDTA) og collagenase (1 mg / ml). Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C, omrøre hver 10 min.
    4. Tilsæt 10 ml C-medier (1x MEM, 0,4% D (+)-glucose, 2 mM L-glutamin, 10% FBS) til inaktivering af trypsin og centrifugeres i 1 minut ved 600 rpm.
    5. Fjerne så meget af trypsin / collagenase medier som muligt * og vaskes ganglier med 10 ml af C-medier. Centrifugeres i 1 minut ved 600 rpm. Gentag dette trin én gang.

    * Resterende kollagenase vil påvre med collagen substratet kræves til cellebinding til dyrkningspladen.

    1. Fjerne vaskemedier og re-suspendere ganglier i 1 ml C-medier og tritureres med 21 G nål fastgjort til en 5 ml sprøjte til at dissociere store klumper af celler *. Slut triturering med 23 G nål, indtil synlige klumper er dissocieret.

    * Vær forsigtig med ikke at over-satte man da dette vil ødelægge cellerne. Hvis trypsin og collagenasen behandling var en succes, et maksimum på femten op og ned cykler med 21 G kanyle, og tre cykler med 23 G nål skal være tilstrækkeligt.

    1. Filtrere de dissocierede neuroner via en 70 um nylonfilter [BD Biosciences cellefilter] i et 50 ml konisk rør til at skille de resterende klumper.
    2. Trække en 10 ul aliquot af det filtrerede cellesuspension blandes med trypanblåt at bestemme antallet af levende celler. Tæl antallet af celler, der aktivt eksklUde farvestoffet ved hjælp af et hæmocytometer.
    3. Fjerne laminin opløsning fra 96-brønds skåle venter i 37 ° C inkubator (se trin 1.2). Tør ikke skålen, kan det anvendes umiddelbart efter udpladning af celler, når laminin er fjernet. Dispensere * 5.000-6.000 totale levende celler (50 - 100 pi per brønd) i collagen og laminin præ-overtrukket med 96 brønde vævsdyrkningsskål. Omfatte 50 ng / ml nervevækstfaktor (NGF) i C-medier.

    * Det er kritisk at anvende en god steril vævskultur teknik, fordi antibiotika er udeladt fra vækstmedierne. Desuden kan der være betydelig variation blandt collagen stammer fra forskellige leverandører. Vi har haft ensartede resultater over hele batches ved hjælp af rotte hale kollagen fra Millipore.

    1. Ved DIV (dage in vitro) 1 erstatte C-medier, der anvendes til pladen cellerne med 50 ul NBM (0,4% D (+) - glucose, 2 mM L-glutamin, B-27 supplement indeholdende 50 ng / ml NGF, 5uM aphidicolin og 20 uM 5-fluoruracil [5-fluor-2'-deoxyuridin]. Inkubér kulturer i 5 dage *. På dette tidspunkt kan trypsinizing og tælle cellerne forbliver i adskillige brønde bestemme antallet af neuroner overlever antimitotisk middel behandling. Typisk cirka 1.000 neuroner forbliver per brønd i en plade med 96 brønde.

    * Problemer med svamp eller bakteriel forurening er som regel tydeligt inden for de første 24 timer af kultur. Undersøg hver brønd omhyggeligt for mikrobiel vækst før at erstatte udpladningsmedier. Hvis der kun et begrænset antal brønde påvirkes, kan de behandles med en fortyndet blegemiddelopløsning, skyllet med PBS og tørret for at fortsætte med eksperimentet. Vi anbefaler at gentage forsøgene, hvor selv et begrænset antal brønde havde mikrobiel kontaminering. Hvis omfattende mikrobiel kontaminering er observeret i 96 brønde, skal forsøget afsluttes.

    2. Infektion af SCG Cultninger med HSV-1 Us11-EGFP og etablering af Latency

    For nyttig baggrund for virologiske teknikker, herunder basal virusformering, bestemmelse virustiter og multiplicitet af infektion (MOI), henvises læseren til at henvise 5. For en diskussion af herpesvirus biologi, henvises læseren til at henvise 6. Endelig henvises læseren til referencer 7-10 til tidligere eksempler, andre protokoller og yderligere baggrund for alfa-herpesvirus lytisk infektion af SCG-neuroner og til sammenligning med vores protokollens tilpasninger til at studere ventetid og reaktivering.

    1. Ved DIV 6, tilsættes acyclovir (ACV), slutkoncentration 100 uM til de eksisterende mediet i hver brønd *. For eksempel, hvis hver brønd indeholder 50 pi tilsættes 25 gl af en 300 uM ACV lager. Typisk er ACV tilsættes natten før infektionen, men kan også tilsættes 6-8 timer før infektion.

    * Det er exceedingly vigtigt at minimere unødvendige fysisk manipulering af neuron på alle tidspunkter. Du skal blot fjerne og udskifte medier eller smitte med virus bestande skal ske meget forsigtigt og langsomt. Ellers kan den resulterende mekaniske belastning indvirker negativt på neuron levedygtighed.

    1. Ved DIV 7, er SCG kulturerne med HSV-1 Us11-EGFP (beskrevet i ref 11) inficere ved en multiplicitet af infektion (MOI) mellem en -2 (se vigtigt kommentar nedenfor på den optimale MOI) *. Tilsættes den fortyndede virus direkte til de eksisterende mediet i brønden. Medtag en mock-inficeret kontrol og en lytisk infektion positiv kontrol i medierne mangler ACV. Tillade infektionen forløbe i 2-3 timer ved 37 ° C.

    * MOI beregnes virustiter bestemmes ved at udføre en plaqueanalyse i Vero-celler 12, og antallet af belagte, levende celler podet brønd i trin 1,14. Denne beregning er kun nyttig i en operationel måde,det samlede celleantal podet indeholder neuroner med kontaminerende glia og fibroblaster. Da disse kontaminerende delende celler dræbes ved behandling med anti-mitotiske midler effektivt MOI for de overlevende neuroner er faktisk større. Fra den oprindelige start mængde 5000 - 6000 levende celler, forbliver omtrent 1000 neuroner efter behandling med anti-mitotiske midler (som vurderet ved trypsinizing og direkte celletælling). Den optimale MOI at bruge, når inficere neuronale kulturer kan variere noget fra en virus lager forberedelse til den næste. Med hver ny udarbejdelse af virus, anbefaler vi at teste et begrænset udvalg af forskellige Mois 1 til 2. Målet her er at identificere den, der har de mindst virkninger på neuron levedygtighed og resulterer i det største antal inducerbare genaktiveringssignaler hændelser (defineret i afsnit 3). Den Us11-EGFP-virus er særlig nyttige i hurtigt at optimere de betingelser, men man kan også anvende andre udlæsninger såsom plak-assay eller kvantitivt PCR Det kan hjælpe at bruge virus renset gennem en saccharosepude at fjerne urenheder, der reducerer cellelevedygtigheden, selv om dette ikke er afgørende, og ikke rutinemæssigt udført.

    1. Omhyggeligt erstatte infektion mediet med frisk NBM indeholdende 50 ng / ml NGF og 100 uM ACV *.

    * Det er afgørende vigtigt at være yderst forsigtig, når du ændrer infektion medier. Formål spidsen af pipetten ved væggen af borehullet i stedet på bunden af brønden, og at medierne til forsigtigt glide ned på cellerne. Selv hurtig afstødning af medier fra pipetten kan frembringe tilstrækkelig kraft til at fjerne de axoner fra substratet og bevirke, at cellerne ham ud typisk som et ark af celler. Hvis der kun et begrænset antal neuroner aftagelige (20-30%), er konsekvensen minimale forudsat at cellerne synes sunde. De løsrevne neuroner sandsynligvis vedhæfte tiden, men vil axonerne ikke længere godt forlænges end nye axoner vil regrow. Selvom det ikke optimal, kan forsøget fortsætte hvis kun et begrænset antal brønde påvirkes. Hvis der er omfattende afkobling af neuroner (70-80%), anbefaler vi ikke, herunder de berørte godt (r) i eksperimentet. Hvis størstedelen af brøndene indeholder 70-80% udsendte neuroner, anbefales afslutning af forsøget. Medens neuroner stadig kan vedhæfte de typisk vil danne store klumper. Dette komplicerer ordentlig vurdering af de enkelte reaktiveret neuroner. Vi anbefaler at gentage enhver eksperiment, hvor brøndene med fritliggende neuroner blev observeret at sikre, at reaktivering satser ikke var påvirket af forskellen overholdelse af neuroner til brøndene.

    Desuden er det vigtigt altid at håndtere de kulturer som skånsomt som muligt. Mekanisk stress fra unødvendige, pludselige bevægelser (herunder gentagne åbning og lukning af en inkubator kammer døren) eller insisterende medier ansøgning cOuld kompromis kulturer evnen til at understøtte HSV-1 latenstid, hvilket kan resultere i uacceptabelt høje spontan reaktivering i et givet eksperiment.

    1. Opretholde kulturer i 6 dage, i hvilket tidsrum viruset vil etablere latens. I denne periode, anvendes et fluorescerende mikroskop for at overvåge neuron sundhed og Us11-EGFP ekspression som en indikator for lytisk replikation. Us11-EGFP skal kun påvises i kontrolbrøndene mangler ACV behandling, hvilket indikerer vellykket primær infektion og produktive lytiske replikation. Neuroner kan viser cytopatiske virkninger, selv i fravær af produktiv viral vækst. De inficerede kulturer bør følges nøje, og sammenlignet med mock-inficerede neuroner.

    3. Reaktivering og vurdering

    1. På DIV 14, erstatte omhyggeligt ACV-holdige medier med friske medier mangler ACV. Hvis det er relevant, omfatter farmakologiske (eller biologisk) variabler på dette tidspunkt. Være sure at følge forholdsreglerne anført i 2,3.
    2. Over en 5-6 dages periode, overvåger de levende kulturer med et fluorescensmikroskop for at detektere neuroner under reaktivering. Alternativt indsamle prøver for andre typer af analyser (protein, nukleinsyre, plakassay osv.).
    3. Beregne reaktivering frekvens ved at tælle antallet af brønde indeholdende EGFP-positive neuroner, og udtrykke det som en del af det samlede antal prøvebrønde. Bemærk, at EGFP udtryk i en individuel brønd skelner ikke mellem en primær reaktivering begivenhed og efterfølgende infektion på grund af viral spredning. Idet infektiøs spredning er indeholdt i en enkelt kultur godt, er en eller flere EGFP-positive neuroner i en brønd operationelt defineret som én reaktivering tilfælde under disse betingelser.

    * Flere reaktivering hændelser kan forekomme i en kultur, som beskrevet i 1. For at skelne mellem en primær reaktivering begivenhed fra viral spredning som følge af reaktion motivation kan indkapsling inhibitoren WAY-150.138 tilsættes. Ved at blokere indkapsling er infektiøs virus ikke fremstilles og spredes som følge af reaktivering er ikke mulig. Således EGFP signal detekteres i tilstedeværelse af WAY-150138 afspejler antallet af uafhængige genaktiveringssignaler begivenheder inden for en singe kultur godt 1,13-15. Bemærk, at WAY-150.138 er kun effektiv mod HSV-1 Patton stamme og ikke kommercielt tilgængelige. Som et alternativ til WAY-150.138, at overveje anvendelse af enhver af følgende: i) en mutant virus svækket i deres evne til at sprede sig til naboceller kan anvendes ii) en reporterviruset, hvor EGFP udtrykkes fra en IE-promotor i den kontinuerte tilstedeværelse af ACV iii) behandling med PAA eller ACV at forhindre sen genekspression (og infektiøs virus produktion) efterfulgt af immunofluorescens under anvendelse af antistoffer rettet mod en IE genprodukt.

    4. Alternative metoder til at vurdere Reaktivering bruge Assay

    ontent "> Resultater fra et individ, enkelt eksperiment skal opnås fra et enkelt præparat af SCG. Gentagne eksperimenter kan udføres med uafhængige SCG præparater, så længe hvert replikat blev udført under anvendelse af en enkelt SCG batch.

    1. Vurderingen af ​​HSV-1 lytiske transkripter. Collect RNA ved ønskede tidspunkter efter ACV fjernelse i nærvær eller fravær af forskellige eksperimentelle induktorer af reaktivering. Ved brug af 96 brønde, anbefaler vi at samle mindst 20 brønde sammen for hver prøve (ca 10 5 celler pr RNA prøve). Alternativt kan SCGs udplades i større brønde (fx en 24-brønds plade, 4-5 x10 4 celler anvende / brønd). Selv om det er bestemt muligt at detektere RNA fra mindre end 20 brønde, de små mængder involveret resulterer i uberettigede prøve-til-prøve variation.
    2. Detektion af HSV-1 lytiske proteiner. Collect lysater på et ønsket tidspunkt efter induktion af reaktivering. Tilsættes 7,5 ul lysepuffer til hver af 10 walen i en 96 brønds plade og analysere ved SDS-PAGE og immunoblotting Alternativt kan virale proteiner påvises ved indirekte immunofluorescens-mikroskopi. Den indledende udpladning skal foretages på et monterbar substrat for billeddannelse, såsom en steril dækglas, der er blevet præ-coatet med poly-D-lysin (0,2 mg / ml, Sigma) før påføring af collagen og laminin (se 1.10) .
    3. Påvisning af infektiøse partikler. Indsamle kultursupernatanten ved reaktivering. Udføre en plaqueanalyse på monolag af Vero-celler under anvendelse af serielle fortyndinger af supernatanten. Derudover kan plaque-assays udføres under anvendelse af lysater af fryse-optøet kulturer omfatter celleassocierede partikler for at bestemme titer.

    5. Repræsentative resultater

    Figur 2A illustrerer et eksempel, hvor en uM Trichostatin A (TSA), en kendt inducer af reaktivering 16-18, anvendes til SCG kulturer latent inficeret med vildtype-HSV1 EGFP-Us11 reporter stammen. Med TSA, når reaktivering 50% af den maksimale inden for 2 dage, og efter 5 dage aktiveringsluftstrømmen plateauer på omkring 60% af brøndene. Basislinie (spontane) reaktivering er cirka 10% i dette eksperiment, og typisk i området fra 10-20% med denne in vitro-system. Maksimale reaktivering varierer afhængig af hvilken reaktivering inducer anvendes. Mange reaktivering inducere kan anvendes under hele forsøget, da de ikke interfererer med produktiv viral replikation, men dette skal bestemmes empirisk. Andre induktorer, herunder ethvert reagens, som påvirker levedygtigheden af ​​neuroner eller hindrer afslutningen af ​​den virale produktiv livscyklus, kan kræve en transient impuls anvendelse til at fremkalde reaktivering.

    Medens akkumulering af EGFP-Us11 i hver brønd af forsøget er vist i figur 2A er indikativ for reaktivering fra latens, betyder det ikke skelne, hvorvidtUs11-EGFP-signal i individuelle neuroner er afledt fra en uafhængig reaktivering begivenhed eller spredning af en reaktiveret virus gennem kulturen. At evaluere antallet af neuroner, der gennemgår uafhængige reaktivering begivenheder i hver brønd, blev kulturer forbehandlet med WAY-150.138, en forbindelse, som specifikt blokerer viral spredning ved at forhindre indkapsling af det virale DNA genom 13-15. Inficerede sympatiske neuron kulturer blev behandlet med WAY-150.138 og reaktivering induceret med TSA. Betydeligt antal EGFP-positive neuroner, blev kun detekteret i TSA-behandlede brønde, sammenlignet med DMSO-behandlede kontrolkulturer, hvilket viser, at en række uafhængige genaktiveringssignaler hændelser forekommer for hvert kultur (figur 2B).

    I vort assay er Us11-EGFP reporter udtrykkes fra den endogene Us11 promotoren 11. Idet Us11 er en "sand-sen" eller γ 2 viral lytisk genet, viral DNA-replikation der kræves til robust expressiden. Dette er illustreret i figur 3, som EGFP-Us11 akkumulering hæmmes af viral DNA-polymerase-inhibitor phosphonoeddikesyre (PAA) i kulturer induceret til at reaktivere med PI3-kinase-inhibitoren LY294002.

    Figur 1
    Figur 1. Skematisk illustrerer en typisk eksperimentel protokol under anvendelse af dyrkede neuroner in vitro-system til undersøgelse HSV-1 latens og reaktivering. 1) Efter dissekering superior cervikal ganglie (SCG) fra E21 rotter, der dissocieres neuroner udplades i 96-brønds skåle og behandlet med anti-mitotiske midler til fjernelse af ikke-neuronale celler. 2) Efter 6 dage in vitro (DIV) kulturerne inficeres med rekombinant HSV-1, der indeholder EGFP fusioneret til virus-kodede Us11 sene gen (EGFP-HSV-1) i nærvær acyclovir (ACV), et antiviralt lægemiddel, blokke lytiske replikation. 3) Ved dag 14 (DIV 14) er acyclovir fjernet og EGFP-ekspressioner ikke fundet. Kulturer kan opretholdes stabilt på denne måde i 1 måned eller mere, eller en testvariabel kan tilsættes for at vurdere dens evne til at fremprovokere reaktivering fra latens. Den variable kan være i form af et lille molekyle kemiske inhibitor, et antistof mod et opløseligt neurotrophin eller celleoverfladeprotein eller en lentivirus, der udtrykker enten en genspecifikke shRNA eller en ektopisk udtrykte protein. Reaktivering derefter overvåges ved at score EGFP-positive brønde i real-tid.

    Figur 2
    Figur 2. TSA genaktiverer HSV-1 i SCG kulturer. SCG kulturer blev latent inficeret som beskrevet i figur 1. Ved DIV 14 blev ACV fjernet og erstattet med medium indeholdende 1 uM Trichostatin A (TSA). (A) Kulturerne blev visualiseret og scoret med fluorescensmikroskopi hver dag efter behandling for en periode på 5 dage. Procentdelen af ​​brønde, der gennemgår reactivation i løbet af forsøget er vist i forhold til DMSO-kontrol-behandlede kulturer. Procentdelen af ​​reaktivering blev beregnet med antallet af EGFP-positive brønde af 20 brønde i en 96-brønds dyrkningsplade. Fejlsøjler angiver standardfejlen på middelværdien. (B) latent inficerede kulturer blev behandlet med TSA og en inhibitor af viralt DNA indkapsling, WAY-150.138 (20 ug / ml). Antallet af EGFP +-neuroner, blev sammenlignet 48 timer efter behandling med lægemidler til kontrol behandlet med DMSO og WAY-150.138. Hvert datapunkt repræsenterer forholdet eGFP +-neuroner ud af 1.000 neuroner i en kultur brønd. Bar viser den gennemsnitlige procentdel af EGFP + neuroner i en brønd.

    Figur 3
    Figur 3. EGFP detecion afhænger viral DNA-replikation. SCG kulturer blev latent inficeret derefter behandlet med 10 pM af LY29004, en kendt inducer af reaktivering 1. Reaktivering fremkaldt af LY (blå) was sammenlignet med dem behandlet med viral DNA-syntese inhibitor, phophonoacetic syre, PAA (300μg/ml, rød) og de to forbindelser sammen (grøn).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Denne primære neuron kultur og infektion system giver en enkel og effektiv metode til at udforske de molekylære mekanismer, der ligger til grund for HSV-1 ventetid og reaktivering. Systemet trofast rekapitulerer de accepterede kendetegnende for ventetid er defineret i både infektioner hos mennesker og i live-dyremodeller. Når viruset er latent i SCG kulturer, kan infektiøse partikler og virale lytiske genprodukter ikke blive detekteret. Den eneste virale gen-produkt fundet i latent inficerede neuroner er den ikke-kodende LAT transkript, som akkumulerer i kernerne. Reaktivering sammenfaldende med ekspression af virale lytiske gener og kulminerer i produktionen af ​​infektiøse partikler. Desuden denne primære neuron cellekulturmodel reagerer med accepterede reaktivering inducere, såsom TSA, som effektivt inducerer lytisk viral replikation.

    Forskellige kemiske induktorer stimulere reaktivering i varierende omfang og med karakteristiske kinetik. For eksempel reproducerbart TSA inducerer reaktivering i 60-70% af kulturerne i en 5 d observationsperiode. Lignende niveauer af TSA-induceret reaktivering er blevet rapporteret ved hjælp af latent-smittede, differentieret rotte fæokromocytom PC12 celler 17 eller murine trigeminale neuron kulturer 18. Kinetik reaktivering vi observerer og manglende evne til TSA at genaktivere 100% af de kulturer, kunne afspejle heterogenitet i kapaciteten af ​​de latente genomer skal derepresseret. I overensstemmelse med dette forslag er effekten af TSA-induceret reaktivering angiveligt falder som en funktion af tid i kultur 18. I modsætning til TSA, inducerer LY29004 reaktivering i 80-90% af kulturerne i løbet af 2-3 D. Forskelle i oprettelse af ventetid eller MOI vil sandsynligvis ikke højde for forskelle i inducerbare reaktivering mellem TSA og LY29004, som vores betingelser for oprettelse af ventetid reproducerbart resultere i omkring 20% ​​af neuroner, der udtrykker viruskodet latenstid røvociated transkript LAT 1. Vi har imidlertid ikke målt fraktionen af ​​virale genom-positive celler, hvilket øger muligheden for, at LY29004 inducerer reaktivering i et større antal neuroner end TSA. Mens årsagerne til forskellen kapacitet TSA og LY20004 at fremkalde reaktivering endnu ikke er bestemt, er det klart forskellige inducerende midler kan fremme reaktivering med karakteristiske effektivitet og kinetik.

    En kraftig aspekt af systemet er evnen til at anvende vildtypevirus eller reporter-stammer, der opfører sig uden separat fra et vildtype-virus. I modsætning til tidligere cellekultursystemer til at studere HSV-1 latenstid, som påberåbt mutante HSV-varianter, der var ude af stand til at replikere produktivt 16,18,19, revideret i 20 indeholder vores model system en EGFP-reporter stammen, som ikke kan skelnes fra vild-type virus i form af lytisk replikation effektivitet i dyrkede celler 11. Anvendelsen af ​​en EGFP reporter modIrus muliggør en følsom og enkel visuel vurdering af latens og reaktivering. I modsætning til andre reportere såsom β-galactosidase, som kræver fiksering og lysis af celler til analyse tillader EGFP forskeren at overvåge det virale tilstand gennem hele forløbet af et eksperiment, der giver en nem, real-time vurdering af spontan og induceret reaktivering. Andre fremgangsmåder, såsom kvantitativ PCR, kan også anvendes til at se på virusgenekspression mønstre, der går forud EGFP-ekspression, idet EGFP udtrykkes som en "sand-sen" gen eller virus-stammer, der mangler et reportergen. Alternativt kan andre reportermolekyler vira, hvor EGFP er fusioneret til øjeblikkelig-tidlige (IE) eller tidlig (E) gener blive udviklet. En fordel ved at anvende den "sande-sen" beskrevne EGFP-reporter, at EGFP-ekspression er stramt afhængig viral DNA-syntese, hvilket viser, at virussen livscyklus er gået ind i den endelige genekspression fase associeret med lytisk vækst. IndEid, "ægte-sen" EGFP udtryk for følsomhedsgrænsen ved visuel inspektion korrelerer godt med smitsom virus produktion, en biologisk indikator for, at produktiv reaktivering har fundet sted. Det er dog stadig uvist, om hver enkelt neuron, der starter reaktivering, som målt ved produktive cyklus (lytiske) genekspression, er i stand til forløber gennem hele lytiske programmet til at producere infektiøse virus. Måske virus har rig mulighed for at afbryde lytiske programmet og genetablere ventetid. Således kan reporter vira, der udtrykker EGFP fusioneret til IE eller E-proteiner resulterer i mindre pålidelige reaktivering aflæsning. Fra dette perspektiv målt sammenligne effektiviteten af ​​reaktiveringen anvendelse EGFP-reportere udtrykt fra IE, E eller sene promotorer eller endog en kombination reporter med forskellige fluorescerende reporter-proteiner fusioneret til et genprodukt fra hver kinetisk klasse (IE vs E vs sen) ville være nyttig. Desuden kan vor neuronal cellekultursystem også anvendes med forskellige HSV-1 mregner, uanset deres neuroinvasive potentiale eller evne til at regulere værtens immunrespons 21-24. Endelig kan in vitro-dyrkning her beskrevne system kan anvendes til andre neuronale celletyper og ex vivo perifere ganglier kulturer opnået fra højere orden arter, herunder mennesker 25-27.

    Ved at bruge en ren population af neuroner, er detaljerede undersøgelser af samspillet mellem HSV1 og neuronal vært på det molekylære niveau nu muligt. Væsentligt, dette modelsystem undgår de mange komplekse spørgsmål i forbindelse med at studere ventetid og reaktivering hos immunkompetente dyr, hvor yderligere niveauer for kontrol er i lag oven på grundlæggende virus-neuron interaktioner. Endvidere arbejdes i dette system viser klart, at der faktisk er en stabil sammenhæng mellem virus og vært neuron, der kan etableres og vedligeholdes uden bistand fra et erhvervet immunrespons. Mens medfødte og ADAPTIVe immunitet klart spille en vigtig rolle i biologi latent HSV-infektioner, virus har iboende kapacitet i) at etablere en ikke-produktiv infektion ligner ventetid i neuroner, og ii) at skifte til en lytisk, produktiv replikation program som reaktion på miljøområdet og neuronale signaler anvendes til neuroner alene. Vigtigere er det, den molekylære basis for dette unikke forhold mellem HSV og neuron nu dissekeres under anvendelse af celle biologiske, farmakologiske, gendæmpning, og gen-leveringsvehiklerne værktøjer 1. Undersøgelser af denne art, der er fokuseret på neuron og virus i isolation er ikke mulig i dyremodeller, hvor flere celletyper bor på ganglial rum. Vi håber, at ved at bruge denne model system, en omfattende forståelse af indviklede molekylære kredsløb regulering af HSV-1-latens i neuroner endelig kan opnås. Når det er muligt, kan principperne udledes fra dyrkede neuron systemet derefter testes in vivo ved hjælp af etableret dyr moDels, hvilket illustrerer den supplerende karakter af disse to tilgange til samlet undersøgelse af HSV-1 latenstid.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklæret.

    Acknowledgements

    Vi takker de anmeldere for deres gennemtænkte forslag, som har bidraget til at forbedre dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud til MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) og IM (AI073898, GM056927) fra NIH. MK blev delvist understøttet af en NIH uddannelse tilskud (5T32 AI007180).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350
    1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
    1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080
    5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
    96-well flat well bottom TC plates Corning 3599
    Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
    Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
    B-27 Supplement Invitrogen 17504-44
    Collagenase Sigma-Aldrich C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
    D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
    L-Glutamine Invitrogen 25030-081
    Laminin Sigma-Aldrich L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
    Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415
    Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
    Neurobasal medium Invitrogen 12348
    Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma-Aldrich P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
    Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
    Rat-tail collagen EMD Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
    Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
    Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04

    References

    1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J.Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A.C., Mohr, I., & Chao, M.V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8 (4), 320-30 (2010).
    2. Johnson, M.I. "Primary cultures of sympathetic ganglia." In: Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed., Fedoroff, S. & Richardson, A., eds., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 71-94 (2001).
    3. Letourneau, P.C., "Preparation of substrata for in vitro culture of neurons." In: Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed., Fedoroff, S. & Richardson, A., eds., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 245-254 (2001).
    4. Price, J.P. & Brewer, G.J. "Serum-free media for neural cell cultures." In: Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed., Fedoroff, S. & Richardson, A., eds., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 255-264 (2001).
    5. Flint, S.J., Enquist, L.W., Racaniello, V.R., & Skalka. A.M. Principles of virology. ASM Press, 3rd Ed., (2008).
    6. Roizman, B. & Pellett, P.E. "The family Herpesviridae: A brief introduction." In: Fields Virology, 4th, Ed., Knipe, D.M. & Howley, P.M., eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2, 2381-2397 (2001).
    7. Price, R.W., Rubenstein, R., & Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71 (2), 127-140 (1982).
    8. Tomishima, M.J. & Enquist, L.W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154 (4), 741-752 (2001).
    9. Ch'ng, T.H., Flood, E.A., & Enquist, L.W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
    10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H.M., Bennett, J., Enquist, L.W, & Friedman, H.M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79 (21), 13362-13372 (2005).
    11. Benboudjema, L, Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S.W., & Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77 (17), 9192-9203, (2003).
    12. Blaho, J., Morton, E.R., & Yedowitz, J.C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1, (2005).
    13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T.R., Vernon, S.K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B.L., O'Hara, B.L., Bloom, J.D., & Johann, S.V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74 (19), 9054-9061 (2000).
    14. Newcomb, W.W. & Brown, J.C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76 (19), 10084-88 (2002).
    15. Pesola, J.M., Zhu, J., Knipe, D.M., & Coen, D.M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79 (23), 4516-14525 (2005).
    16. Arthur, J.L., Scarpini, C.G., Connor, V., Lachmann, R.H., Tolkovsky, A.M., & Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75 (8), 3885-3895 (2001).
    17. Danaher, R.J., Jacob, R.J., Steiner, M.R., Allen, W.R., Hill, J.M., & Miller, C.S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11 (3), 306-17 (2005).
    18. Terry-Allison, T., Smith, C.A., & DeLuca, N.A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71 (22), 12394-12405 (2007).
    19. Harris, R.A. & Preston, C.M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol 72 (4), 907-913 (1991).
    20. Wagner, E.K. & Bloom, D.C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
    21. Strelow, L.I., Laycock, K.A., Jun, P.Y., Rader, K.A., Brady, R.H., Miller J.K., Pepose, J.S., & Leib D.A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75 (9), 2475-2480, (1994).
    22. Stroop, W.G., & Banks, M.C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87 (1), 14-22 (1994).
    23. Sawtell, N.M., Poon D.K., Tansky, C.S., & Thompson, R.L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
    24. Thompson, R.L., Cook, M.L., Devi-Rao, G., Wagner, E.K., & Stevens, J.G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58 (1), 203-211 (1986).
    25. Wilcox, C.L., Smith, R.L., Freed, C.R., & Johnson, E.M., Jr. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10 (4), 1268-1275 (1990).
    26. Roehm, P.C., Camarena, V., Gardner, J.B., Wilson, A.C., Mohr, I., & Chao, M.V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121 (10), 2268-2275 (2011).
    27. Kuhn, M.A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M.V., & Roehm, P.C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology., In press, (2012).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter