De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

1. A dissociação de células

1. Um fluxograma descrevendo o protocolo é mostrado é a Figura 1. Para obter os números de catálogo dos reagentes específicos utilizados ao longo deste protocolo, consulte a Tabela 1. Dissecar a retina num banho de PBS. Durante a dissecção, é melhor para remover o vítreo e da lente desde mantendo-os com a retina pode impedir a dissociação. Nem sempre é criticamente importante para remover todo o epitélio pigmentado da retina (RPE) e, em alguns casos, pode ser impossível de removê-la completamente. No entanto, para as experiências de células únicas de perfis de fotorreceptores, o RPE deve ser removido. A falha para remover o RPE pode levar à contaminação dos perfis da haste de células com RPE genes expressos. Isto é provavelmente devido à ligação entre os fotorreceptores e do RPE.
   Para a dissociação, inteiros adultos retinas de murino são incubadas a 37 ° C durante 10 min em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 20uL activado papaína, 20 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e 360 ​​uL da solução de Hank (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES. Dicas filtro de ponta de pipeta são usadas para todas as etapas de todo o protocolo para minimizar a contaminação potencial. A concentração de papaína e do tempo de incubação pode variar de acordo com a idade e da natureza do tecido. Por exemplo, para dissociar o desenvolvimento de retinas isoladas no dia pós-natal 0 (P0), incubar a retina em 10 uL activado papaína, 10 Cisteína mM uL 25 em 5 mM de EDTA, e 380 uL de Hank Solução Salina Equilibrada (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES durante 10 min a 37 ° C. Retinas de diferentes espécies também exigir condições ligeiramente diferentes. Retinas de galinha são mais finas do que a maioria das retinas de ratos em estágios de desenvolvimento. Usando 10 uL activado papaína, 10 mM de cisteína uL 25 em 5 mM de EDTA, e solução de Hank 380 uL de (HBSS) suplementado com HEPES 10 mM durante 5 min a 37 ° C é suficiente para dissociar tstas retinas.
2. Bata levemente o tubo para retirar as células se estabeleceram, em seguida, triturar suavemente 10-20 vezes com uma pipeta p1000. Incubar durante um adicional de 10 min a 37 ° C, se grandes aglomerações de tecido persistir e depois re-triturar 10-20 vezes.
3. Adicionar 5 ul de DNase I (10 U / ul) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Triturar suavemente com uma pipeta p1000. O número exacto de vezes terá de ser determinada empiricamente, mas geralmente situa-se entre 10-20.
4. Centrifugar numa centrífuga de bancada a 3000 rpm durante 3 min Remover o sobrenadante, deixando 100-200 uL de líquido na parte inferior, e toque no tubo para desalojar o sedimento. Adicionar 1 ml de HBSS e ressuspender o sedimento com trituração suave. Tocando o tubo é crítica aqui simplesmente como ressuspender o pellet com lisar muitas das células da retina. Isto é especialmente verdade com adultos retinas de ratinho.
5. Centrifugar a 3000 rpm durante 3 min Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 450 ul de PBS contering BSA a 0,1%. É importante remover o máximo de sobrenadante quanto possível para minimizar a presença de ARNm a partir de células lisadas e quaisquer produtos da dissociação que poderiam inibir reacções futuras.

2. Coleta de células individuais

1. Preparar dois pratos 6 cm contendo 5 ml de PBS suplementado com BSA a 0,1%. Placa as células dissociadas em um único prato e permitem que as células que se contentar com pelo menos 5 min. A densidade de células utilizado depende em grande medida da natureza das células individuais a ser perfilados. Por exemplo, para as células muito raros marcadas com um marcador fluorescente, tais GFP um, inteiros retinas dissociadas são plaqueadas em um único prato 6 cm. Para as células que são um pouco mais abundante, menos células são inicialmente semeadas a tornar mais fácil para colher um (ou muito perto de um) da célula com o primeiro micropipeta.
2. Colocar a placa de células dissociadas sobre um microscópio invertido. Usamos o modelo IMT-2 do Olimpo. Usando micropipetas que foram tiradas de uma fine ponta (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro exterior 1,04 milímetros) (Figura 2) e, juntamente com um tubo de aspiração, colher uma única célula. As células facilmente entram na micropipeta quando é colocado perto deles no prato. É crítico que o tubo de aspiração é nem muito longo nem demasiado curto para a distância para a fase associado com o microscópio invertido (Os tubos aspirador que usamos com o nosso microscópio invertido são 38,1 cm de comprimento). Se o tubo for demasiado longo, as células não podem ser expulsos eficientemente a partir da micropipeta para dentro do tubo de recolha. A principal razão, usamos o velho microscópio IMT-2 modelo invertido é que encontramos tem a distância ideal para o estágio para nossos tubos de aspirador de montagem. Depois de entrar na micropipeta, a célula (ou células) é expelido para uma segunda placa (placa de lavagem) para garantir que uma e apenas uma célula é colhido para o perfil de expressão do gene. Na segunda placa é muitas vezes necessário para remover as células estranhas ou com uma micropipeta novoou mover a célula de interesse para uma localização diferente para assegurar que apenas uma única célula entra na micropipeta.
3. Quando uma célula individual está completamente isolado a partir de células vizinhas, usar uma micropipeta nova para aspirar a célula de interesse, como na seção 2.2 e, em seguida, expulsá-lo diretamente em um tubo de 0,2 ml PCR contendo 4,5 ul de tampão de lise celular. A célula é expelido para o lado do tubo, tendo cuidado para não romper a ponta da micropipeta para dentro do tubo. As amostras podem ser fiado rapidamente numa microcentrífuga de bancada para imergir a célula em tampão de lise. Esta rotação é geralmente feito depois de cada célula 5 e, em seguida, novamente no final do collection.Tubes contendo células individuais em tampão de lise deve ser mantido em gelo durante a duração do isolamento única célula. Para melhores resultados, as células individuais são coletados dentro de uma janela de duas horas pós-dissociação. Após este tempo, é melhor para passar para a etapa de transcrição reversa desde o tempo adicional foi observed para aumentar as chances de degradação do RNA.

3. Transcrição reversa

1. Resumidamente girar as amostras em um minicentrifuge de bancada para assegurar que todas as células individuais são imersos no tampão de lise celular. Para promover a lise das células, incubar a amostra a 70 ° C durante 90 seg. num termociclador. Imediatamente colocar os tubos de volta em gelo.
2. Deixar os tubos em gelo durante 2 min. Para todas as adições de reagentes, usar pontas de filtro-ponteira para evitar contaminação. Para realizar a transcrição reversa, adicionar 0,33 uL Superscript III (200 U / ul), 0,05 ul de ARNase Inibidor (40 U / ul), e 0,07 ul de T4 gene 32 de proteína. Incubar a mistura de reacção durante 50 min a 50 ° C num termociclador. Inactivar a enzima a 70 ° C durante 15 min e colocar no gelo.
3. Para remover o iniciador livre, adicionar 0,1 Tampão Exonuclease ul (10X), 0,8 ul dH ₂ 0 (grau de biologia molecular), e 0,1 ul Exonuclease I (20 U / ul). Incubar a 37 ° C durante 30 min emum termociclador. Inactivar a enzima por incubação da reacção a 80 ° C durante 25 min e, em seguida, colocando os tubos em gelo.

4. Rejeitos e Single-Cell PCR

1. Adicionar 6 uL da mistura de reacção tailing e usar um termociclador a incubar a amostra a 37 ° C durante 20 min, 70 ° C durante 10 min, e mantenha a 4 ° C
2. Adicionar 10 ul da amostra de cauda para a mistura de reacção de PCR e realizar a síntese da segunda cadeia e amplificação por PCR usando as seguintes condições:
   1. 95 ° C durante 2 min
   2. 37 ° C durante 5 min
   3. 72 ° C durante 16 min
   4. 93 ° C durante 40 seg
   5. 67 ° C durante 1 min
   6. 72 ° C durante 6 min, a adição de 6 segundos por ciclo
   7. Vá para a etapa 4 34 vezes
   8. 72 ° C durante 10 min
   9. Mantenha a 4 ° C

5. Rotulagem de chips Affymetrix

1. Ug rótulo 10-20 de ADNc (a concentração do resultado de ADNc amplificadoing a partir de uma única célula é usualmente ~ 1 ug / uL) para se obter um sólido de hibridação em microarrays Affymetrix. Primeiro, o fragmento de ADNc por adição de 10-20 ul do ADNc de uma única célula de 8 uL 1X One-Phor-All tampão e 1 uL de diluídos (1:10 em 1X One-Phor-All tampão) DNaseI em um 80 uL reacção. Incubar em um termociclador de 13 min a 37 ° C. Inactivar a ADNase I durante 15 min a 100 ° C e colocar em gelo.
2. Adicionar 20 ul de tampão TdT 5X, 2,5 Biotina uL N6-ddATP (Enzo Biosciences), e 1 uL TdT (diluído 1:08 em tampão de TdT).
3. Incubar durante 90 min a 37 ° C, em seguida, 5 min a 65 ° C. Armazenar a -20 ° C ou hibridizar imediatamente a um microarray Affymetrix. A hibridação é realizada utilizando protocolos padrão Affymetrix.

6. Os resultados representativos

Para avaliar a qualidade do ul, ADNc 10 da amostra de cDNA foi carregado num gel de agarose a 1%. O cDNA é principalmente julgado por o intervalo de tamanho (500-2000 pb)e da intensidade da mancha de ADNc (Figura 1 e Figura 3a). No gel representado na Figura 1, cada outra pista mostra uma mancha de cDNA a partir de células da retina isolado E16.5. As pistas entre mostram os esfregaços resultantes quando os meios apenas é aspirado para dentro da agulha e depositado dentro do tubo de PCR. Estas faixas nunca são completamente desprovidos de um esfregaço de fraco, mas eles não mostram quaisquer resultados quando iniciadores gene-PCR específicos são utilizados para amplificar os genes a partir deles. Além disso, a intensidade da mancha de cDNA pode variar um pouco (comparar com a figura 1 e figura 3a). Nas pistas Figura 3A a, f, g, eh conter robustos esfregaços de cDNA enquanto as pistas b, c, d, ee são consideravelmente menos robusto.

Gene-PCR específica é usado como um ecrã secundário da qualidade do cDNA a partir de uma única célula. Os cDNAs na Figura 3 foram isolados a partir fluorescentes células ganglionares da retina e eram Tested utilizando iniciadores de PCR para a células ganglionares da retina marcadores Brn3b e Pax6. Para este ensaio, 1 uL do cDNA foi submetido a PCR para 30 ciclos. Em tempo real PCR quantitativo seria um ensaio preferível, mas pode ser proibitivamente caro e não é necessário para meramente avaliar a qualidade de cDNA. Todos os 8 das células individuais testou positivo para Brn3b e 6 8 para fora Pax6 (Figura 3b). Mesmo as manchas de cDNA que eram menos robustos bandas produzidas para Brn3b e Pax6. Apesar destes resultados da PCR, é nossa experiência que esfregaços de cDNA, tais como aqueles em pistas b, c, d, ee não produzem hibridações robustos em matrizes Affymetrix e são geralmente evitados. Gene PCR específica para o marcador de fotorreceptores Crx foi utilizado para determinar o nível de contaminação nos cDNAs única célula (Figura 3b). Um marcador de fotorreceptores foi escolhido porque estas células formam a maioria da retina (~ 70%) e, portanto, qualquer lise celular que ocorreu seria mais provável envolver haste photoreceptors. Houve apenas uma quantidade fraco do presente Crx nestas preparações de ADNc, mesmo após 30 ciclos de PCR. Finalmente, esta tela baseado em PCR pode ser utilizado para começar a determinar quais os subconjuntos de um tipo particular de célula dos cDNAs foram derivadas de antes sujeitando-os a um perfil de microarray completa. Isto pode ajudar a dar prioridade as células que são perfiladas, como este é o passo mais caro do processo. Por exemplo, foram identificados os subconjuntos de células ganglionares da retina por rastreio-los para a presença do gene Tachykinin1 (Figura 3b).

A partir do ecrã baseado em PCR pequeno, particular as células individuais são escolhidos e as suas cDNAs hibridado com uma microarray Affymetrix. Os dados de microarrays é comparado e padrões podem ser descobertos, utilizando algoritmos de agrupamento padrão. Heatmaps, tais como na Figura 4, são geradas para representar graficamente os dados. Existem duas principais conclusões sobre os dados de célula única de perfil na Figura4. Primeiro, os genes expressos em tipos celulares específicos são encontrados quase exclusivamente nos tipos de células após o protocolo única célula é executada. Na maioria dos casos em que genes marcadores de um tipo de célula são encontrados também em um segundo tipo de célula, tal como a observação de que células bipolares expressar algumas "rod" genes em níveis mais baixos, esta expressão no tipo de célula segundo é prontamente confirmada por quer in situ hibridação ou de coloração de anticorpos. Em segundo lugar, no amácrinas mais diversificada e perfis de células ganglionares, a heterogeneidade da expressão do gene é imediatamente aparente. Pou4f1 só é expressa em cerca de 1/4 das células ganglionares em desenvolvimento, enquanto que Nr4a2 e Scube2 são dois exemplos de genes heterogeneamente expressas em diferentes células amácrinas. Na verdade, os genes mostrados na heatmap são apenas uma pequena amostra como várias centenas de genes foram identificados e confirmado como marcadores de células ganglionares de desenvolvimento ou como marcadores de diferentes populações de células amácrinas ^2,4.

Um número cada vez maior de estudos estão revelando variabilidade célula-célula robusta em populações que se acreditava serem mais homogêneas no que diz respeito à sua expressão gênica ^6,8. Em pelo menos um exemplo, este gene expressão "ruído" tem sido demonstrado que desempenham uma função importante biológica ^13. Diferenças de expressão gênica entre as células individuais são obscurecidos usando os tradicionais métodos de todo tecido. Essas experiências geram o perfil de expressão de uma célula "média", que pode não ser representativa ^14. Apresentamos aqui um método para o isolamento e identificação dos padrões de expressão genética a partir de células da retina individuais. O estudo das células individuais permite que os investigadores para sondar a heterogeneidade celular subjacente tecidos complexos, que é crítico para a determinação dos padrões de genes distintos de expressão de vários tipos de células. Além disso, uma única célula isolada pode fornecer informações sobre os programas de genes de condução da atividade de indivcélulas idual em pontos de tempo ao longo do desenvolvimento. Embora especialmente útil no estudo do sistema nervoso, onde o funcionamento de complexos de redes celulares pode depender da expressão do gene única de tipos de células raras, este protocolo pode ser adaptado para isolar as células individuais a partir de vários tecidos.

Na retina precoce do desenvolvimento de murino, as células ganglionares, células horizontais, células fotorreceptoras de cone e células amácrinas são todos gerados em uma janela de tempo a sobreposição ^15. Além disso, cada célula que tenha saído do ciclo celular está em uma fase diferente da maturação e este facto, apenas aumenta a complexidade da retina em desenvolvimento. Finalmente, para alguns tipos de neurónios retinais, existem numerosas diferentes morfologias (até ~ 30 no caso de células amácrinas) na retina madura ^16. Uma vez que a retina é uma tal mistura de tipos de células, microarray e análise de série da expressão do gene (SAGE) estudos de base ^17-19 que se baseou na homogenizção de toda a retina são incapazes de detectar marcadores genes expressos em subtipos raras e incapaz de resolver diferenças genéticas dinâmicas de expressão entre os tipos de células, especialmente durante o desenvolvimento. Para começar a compreender a complexidade de tipos de células diferentes, tanto na retina do adulto e durante o desenvolvimento da retina, os únicos de células perfis de expressão génica de ~ 200 células individuais a partir de vários pontos de tempo diferentes foram analisados ^​​2-5,8. Os dados resultantes tem proporcionado uma série de novos marcadores de tipos de células individuais e desde uma janela para importantes transições em tempo de desenvolvimento que antes eram apreciados.

Os perfis de expressão de célula única revelaram heterogeneidade considerável na expressão de genes em células amácrinas ^4, onde se esperava, e em células da glia Müller, onde era ⁵ inesperado. Enquanto um exame dos dados da célula única amácrinas revelou mais de 450 genes que foram expressos em amacrinacélulas e excluídos outros tipos de células da retina, nenhuma destas genes foram expressos em todas as células amácrinas ^4. Estes resultados mais provável advir do facto de que a classe de células amacrina é extremamente diversa ea heterogeneidade subjacente é uma reflexão das funções distintas dessas células. Estes achados não teria sido possível, utilizando inteiros tecido abordagens baseadas. Finalmente, ciclismo células progenitoras da retina (RPCs) demonstraram o mais alto grau de heterogeneidade na expressão do gene de qualquer um dos tipos de células da retina perfilados ^8. Factores de transcrição foram a classe de genes com o mais elevado grau de heterogeneidade entre as células progenitoras, sugerindo que os padrões de expressão de genes dinâmicos poderia desempenhar um papel importante no desenvolvimento das diferentes tipos de células da retina ^8. Novamente, estes resultados não teria sido possível sem a utilização da célula técnica único gene perfil de expressão.

Estudos transcritoma única célulatambém pode ser utilizado para obter uma visão em mecanismos da doença. Em muitas doenças neurodegenerativas, incluindo doenças degenerativas da retina, alguns neurônios morrem, enquanto os neurônios vizinhos sobreviver ^20. Entender por algumas células em apoptose requer a identificação de genes ou de programas de genes que são alterados em células individuais, nestes modelos de doença. Todo o tecido-modelos irá novamente potencialmente obscurecer as mudanças desde células frequentemente não morrem ao mesmo tempo e, por conseguinte, em qualquer momento dado o tecido é uma mistura de morrer e células sobreviventes. Além disso, para muitos cancros da célula de origem é uma questão em aberto. Este é particularmente o caso com o retinoblastoma tumor infância olho. Recentemente, utilizando o protocolo de célula única de perfis detalhados aqui, foi mostrado que as células individuais de retinoblastomas possuem programas de expressão génica de vários tipos de células ^21. Afigura-se que estas células são híbridos de células progenitoras indiferenciadas e neurónios ²1. Estas experiências necessária uma análise ao nível da célula individual e não teria sido possível com as abordagens tecido inteiro.

Abordagens alternativas

Amplificação linear é uma alternativa para o protocolo de amplificação por PCR baseada detalhados aqui. Embora baseada em PCR da amplificação é acreditado para resultar em uma inclinação de relações de abundância, a amplificação linear é pensado para manter estas relações ^22. A técnica de amplificação linear foi utilizada para o perfil de vários tipos neuronais ^23. No entanto, as comparações directas entre os dois métodos têm indicado que a técnica de amplificação linear pode ser associado com uma alta taxa de falsos negativos ^24,25. Somos a favor do método de PCR baseado detalhadas neste relatório por duas razões. Em primeiro lugar, em nossos experimentos nos concentramos em genes com expressão diferenças robustas entre as células. Em segundo lugar, encontramos uma correlação muito boa entre a nossa única célula microarray proa apresentação de experiências e em estudos de hibridação in situ para os mesmos genes. De facto, até à data temos realizado em hibridizações in situ para centenas de genes e ter observado pelo menos 75% coincidir com o padrão previsto a partir das microarrays. Isso é mais provável uma estimativa conservadora já que a razão mais comum para uma discrepância é a falta de sinal da sonda em situ.