Encellet Profiling for å utvikle og modne Retinal Neurons

1. Cell Dissosiasjon

1. Et flytdiagram som beskriver protokollen vises er Figur 1. For katalog tallene for de spesielle reagenser som brukes i denne protokollen, se tabell 1. Dissekere netthinnen i en PBS bad. Under disseksjonen, er det best å fjerne glasslegemet og linsen siden holde dem med netthinnen kan hindre dissosiasjon. Det er ikke alltid kritisk viktig å fjerne alt av retinal pigment epitelet (RPE) og i noen tilfeller kan det være umulig å fjerne det. Men for encellete profilering eksperimenter fotoreseptorene bør RPE fjernes. Unnlatelse av å fjerne RPE kan føre til forurensning av stangen celle profiler med RPE uttrykt gener. Dette er antagelig på grunn av forbindelsen mellom fotoreseptorene og RPE.
   For dissosiasjon, er hele den voksne murine netthinne inkuberes ved 37 ° C i 10 min i en 1,5 ml mikrosentrifuge rør som inneholder 20mL aktivert papain, 20 mL 25 mm Cysteine ​​i 5 mM EDTA, og 360 mL Hank Balanced Salt Solution (HBSS) supplert med 10 mm HEPES. Filter-tipped pipettespisser brukes for alle trinn i hele protokollen for å minimere potensiell forurensning. Den papain konsentrasjon og tid inkubasjonstiden vil variere i forhold til alder og arten av vev. For eksempel, å ta avstand utvikle netthinne isolert ved postnatal dag 0 (P0), inkuberes netthinnen i 10 mL aktivert papain, 10 mL 25 mm Cysteine ​​i 5 mM EDTA, og 380 mL Hank Balanced Salt Solution (HBSS) supplert med 10 mm HEPES i 10 min ved 37 ° C. Netthinne fra ulike arter krever også litt forskjellige forhold. Kylling netthinne er tynnere enn mus netthinne på de fleste stadier av utviklingen. Bruke 10 mL aktivert papain, 10 mL 25 mm Cysteine ​​i 5 mM EDTA, og 380 mL Hank Balanced Salt Solution (HBSS) supplert med 10 mm HEPES i 5 min ved 37 ° C er tilstrekkelig til å distansere these netthinne.
2. Forsiktig på røret for å løsne noen bosatte celler, deretter triturate forsiktig 10-20 ganger med en P1000 pipettor. Inkuber i ytterligere 10 minutter ved 37 ° C dersom store klumper av vev vedvarer og deretter re-triturate 10-20 ganger.
3. Tilsett 5 mL av DNase I (10 U / mL) og inkuberes i 5 minutter i romtemperatur. Triturate forsiktig med en P1000 pipettor. Det nøyaktige antallet ganger må bestemmes empirisk, men generelt faller mellom 10-20.
4. Sentrifuger i en table-top sentrifuger ved 3000 rpm i 3 min Fjern supernatanten, etterlot 100-200 mL med væske nederst, og trykk på røret for å løsne pellet. Tilsett 1 ml HBSS og resuspender pelleten med forsiktig trituration. Tapping røret er kritisk her som rett og slett resuspending pelleten med lyse mange av netthinnens celler. Dette gjelder spesielt med voksne murine netthinne.
5. Sentrifuger ved 3000 rpm i 3 min forsiktig ut supernatanten og resuspender i 450 mL PBS inneholdering 0,1% BSA. Det er viktig å fjerne så mye av supernatanten som mulig for å minimere forekomsten av mRNA fra lyserte celler og eventuelle produkter fra dissosiasjon som kan hemme fremtidige reaksjoner.

2. Høsting enkeltceller

1. Forbered to 6 cm retter som inneholder 5 ml PBS supplert med 0,1% BSA. Plate de dissosiert cellene på én tallerken og la cellene til å betale for minst 5 min. Cellen tetthet som brukes avhenger mye av hva slags enkeltceller blir profilert. For eksempel, for svært sjeldne celler merket med et fluoriserende fargestoff slik GFP, er hele dissosiert netthinne belagt på en enkel 6 cm parabolen. For celler som er litt rikere, blir færre celler i utgangspunktet belagt å gjøre det lettere å høste en (eller svært nær en) celle med den første mikropipette.
2. Sett platen på dissosiert celler på en invertert mikroskop. Vi bruker IMT-2-modell fra Olympus. Bruke mikropipetter som har blitt trukket til en fine spissen (indre diameter 0,5 mm, ytre diameter 1,04 mm) (figur 2) og sammen med en vifte rør, høste en enkelt celle. Cellene lett inn i mikropipette når den er plassert nær dem på fatet. Det er viktig at aspirator røret er verken for lang eller for kort til at avstanden til scenen tilknyttet invertert mikroskop (De Aspirator rørene vi bruker med våre invertert mikroskop er 38,1 cm lang). Hvis røret er for lang, kan cellene ikke bli utvist effektivt fra mikropipette inn i samlingen røret. Den primære grunnen til at vi bruker den eldre IMT-2-modellen invertert mikroskop er at vi har funnet den har en ideell avstand til scenen for våre Aspirator montering rør. Etter inntasting av mikropipette, blir cellen (eller celler) utvist på en andre plate (vask plate) for å sikre at én og bare én celle er høstet for genuttrykk profilering. På den andre platen er det ofte nødvendig å enten fjerne unødvendige celler med en ny mikropipetteeller flytte cellen av interesse for en annen plassering for å sikre at bare en enkelt celle entrer mikropipette.
3. Når en enkelt celle er fullstendig isolert fra nabocellene, bruk en ny mikropipette til å suge cellen av interesse som i avsnitt 2.2, og deretter utvise den direkte inn i en 0,2 ml PCR rør som inneholder 4,5 mL cellelyse buffer. Cellen blir utvist på siden av røret, være forsiktig med å bryte av tuppen av mikropipette inn i røret. Prøvene kan spinnes kort i en benk topp mikrosentrifuge å fordype cellen i lysis buffer. Dette spinnende gjøres vanligvis etter hver femte celle og deretter igjen i slutten av collection.Tubes inneholder enkeltceller i lysis buffer bør holdes på is så lenge den eneste celle isolasjon. For optimale resultater, er enkeltceller hentet innen en to-timers vindu post-dissosiasjon. Etter denne tiden er gått, er det best å gå videre til revers transkripsjon steg siden ekstra tid har vært observed å øke sjansene for RNA degradering.

3. Revers transkripsjon

1. Kort spinner prøvene i en Borstemmaskin minicentrifuge å sikre at alle enkeltceller er nedsenket i cellelyse buffer. For å fremme cellelyse, inkuber prøven ved 70 ° C i 90 sek. i en thermocycler. Umiddelbart plassere rørene tilbake på isen.
2. La rørene på is i 2 min. For alle reagens filer, bruker filter-tip pipettespisser for å hindre forurensning. For å utføre revers transkripsjon, tilsett 0,33 mL Hevet III (200 U / mL), 0,05 mL RNase inhibitor (40 U / mL), og 0,07 mL T4 genet 32 ​​protein. Inkuber reaksjonsblandingen for 50 minutter ved 50 ° C i en thermocycler. Inaktivere enzymet ved 70 ° C i 15 min og legg på is.
3. Hvis du vil fjerne gratis primer, tilsett 0,1 mL exonuclease Buffer (10X), 0,8 mL dH ₂ 0 (molekylærbiologi klasse), og 0,1 mL exonuclease I (20 U / mL). Inkuber ved 37 ° C i 30 min ien thermocycler. Inaktivere enzymet ved å inkubere reaksjonen ved 80 ° C i 25 min og deretter plassere rørene på is.

4. Tailing og Single-Cell PCR

1. Legg 6 mL av tailing reaksjonsblandingen og bruke en thermocycler å ruge prøven ved 37 ° C i 20 min, 70 ° C i 10 min, og hold ved 4 ° C
2. Tilsett 10 mL av tailed prøven til PCR reaksjonsblandingen og utføre andre tråd syntese og PCR forsterkning ved hjelp av følgende vilkår:
   1. 95 ° C i 2 min
   2. 37 ° C i 5 min
   3. 72 ° C i 16 min
   4. 93 ° C for 40 sek
   5. 67 ° C i 1 min
   6. 72 ° C i 6 min, og legger til 6 sekunder per syklus
   7. Gå til trinn 4 34 ganger
   8. 72 ° C i 10 min
   9. Hold ved 4 ° C

5. Merking for Affymetrix Chips

1. Etikett 10-20 mikrogram cDNA (konsentrasjonen av den forsterkede cDNA resultateting fra en enkelt celle er vanligvis msgstr 1 mikrogram / mL) for å få en robust hybridisering på Affymetrix mikromatriser. Først fragmentere cDNA ved å legge til 10-20 mL av den encellede cDNA til 8 mL 1X One-Phor-All buffer og en mL fortynnet (1:10 i 1X One-Phor-All buffer) DNaseI i en 80 mL reaksjon. Inkuber i en thermocycler for 13 minutter ved 37 ° C. Inaktivere DNase jeg for 15 min ved 100 ° C og legg på is.
2. Tilsett 20 mL 5X TDT buffer, 2,5 mL Biotin N6-ddATP (Enzo biovitenskap), og en mL TDT (utvannet 01:08 i TDT buffer).
3. Inkuber 90 min ved 37 ° C, deretter 5 min ved 65 ° C. Oppbevar ved -20 ° C eller hybridize umiddelbart til en Affymetrix microarray. Den hybridisering utføres ved hjelp av standard Affymetrix protokoller.

6. Representative Resultater

For å vurdere kvaliteten på cDNA, 10 mL av cDNA prøven ble lastet på en 1% agarose gel. Den cDNA er hovedsakelig dømt av størrelsesområdet (500-2000 bp)og intensitet av cDNA smear (Figur 1 og figur 3a). I gel avbildet i figur 1, viser annenhver kjørefelt en cDNA smear fra netthinnens celler isolert E16.5. Banene i mellom viser de resulterende utstryk når det bare media som aspireres til nålen og satt inn på PCR røret. Disse baner er aldri helt blottet for en svak smøre, men de viser ikke noen resultater når gen-spesifikke PCR primere blir brukt til å forsterke gener fra dem. I tillegg kan intensiteten av cDNA smøre variere noe (sammenlign figur 1 og figur 3a). I Figur 3a baner a, f, g og h inneholde robuste cDNA utstryk mens baner b, c, d og e er vesentlig mindre robust.

Gene-spesifikk PCR brukes som en sekundær skjerm av kvaliteten på cDNA fra en enkelt celle. De cDNAs i figur 3 ble isolert fra lysstoffrør netthinnens ganglieceller og de ​​var Tested bruker PCR primere for retinal ganglion celle markører Brn3b og Pax6. For denne analysen ble en mL av cDNA utsatt for PCR i 30 sykluser. Real-time kvantitativ PCR ville være en fordel analysen, men det kan være uoverkommelig dyrt og er ikke nødvendig for bare vurdere cDNA kvalitet. Alle åtte av de enkelte cellene testet positivt for Brn3b og 6 8 for Pax6 (figur 3b). Selv de cDNA utstryk som var mindre robust produsert band for Brn3b og Pax6. Til tross for disse PCR resultater, er det vår erfaring at cDNA utstryk som de i baner b, c, d og e ikke gir robuste hybridizations på Affymetrix arrayer og er generelt unngås. Gene spesifikk PCR for fotoreseptoren markør CRX ble brukt til å bestemme nivået av forurensning i de encellete cDNAs (figur 3b). En fotoreseptoren markør ble valgt fordi disse cellene utgjør majoriteten av netthinnen (~ 70%), og derfor vil enhver cellelyse som skjedde mest sannsynlig innebære stang photoreceptors. Det var bare en svak mengde CRX stede i disse cDNA forberedelsene selv etter 30 sykluser av PCR. Endelig kan denne PCR-baserte skjermen brukes til å begynne å finne ut hvilke undergrupper av en bestemt celletype de cDNAs var avledet fra før å utsette dem for en full microarray profilering. Dette kan bidra til å prioritere de cellene som er profilert, da dette er den dyreste trinn i prosessen. For eksempel har vi identifisert undergrupper av netthinnens ganglieceller ved screening dem for tilstedeværelsen av genet Tachykinin1 (figur 3b).

Fra den lille PCR-basert skjerm, er særlig enkeltceller valgt og deres cDNAs hybridisert til en Affymetrix microarray. Den microarray data er sammenlignet og mønstre kan bli oppdaget ved hjelp av standard clustering algoritmer. Heatmaps, slik som i figur 4, er generert til grafisk representere dataene. Det er to hovedkonklusjoner vedrørende de encellete profilerende data i Figur4. Først er gener som uttrykkes i bestemte celletyper finnes nesten utelukkende i de celletyper etter enkelt celle protokollen er utført. I de fleste tilfeller der markør gener av en celletype finnes også i en annen celletype, for eksempel observasjon som bipolare celler uttrykker noen "stake" gener på lavere nivåer, dette uttrykket i den andre cellen type er lett bekreftes av enten i situ hybridisering eller antistoff farging. Second, innenfor den mer mangfoldig amacrine og ganglion celle profiler, er heterogenitet av genuttrykk åpenbare. Pou4f1 er bare uttrykt i ca 1/4 av utviklingslandene ganglieceller, mens Nr4a2 og Scube2 er to eksempler på heterogent uttrykt gener i ulike amacrine celler. Faktisk genene vist i heatmap er bare et lite utvalg som flere hundre gener har blitt identifisert og bekreftet som markører for utvikling av ganglieceller eller som markører av forskjellige populasjoner av amacrine celler ^2,4.

Et stadig voksende antall studier er avslørende robust celle-til-celle variasjon i populasjoner som ble antatt å være mer homogen med hensyn til deres genuttrykk ^6,8. I minst ett tilfelle har dette genet uttrykket "støy" vist seg å spille en viktig biologisk funksjon ^13. Genekspresjon forskjeller mellom de enkelte cellene er skjult ved hjelp av tradisjonelle hel-vev metoder. Disse eksperimentene generere uttrykk profilen en "gjennomsnittlig" celle, som kanskje ikke er representative ^14. Her presenterer vi en metode for isolering og identifisering av genuttrykk mønstre fra enkeltrom netthinnens celler. Studiet av individuelle celler tillater forskerne å undersøke cellulære heterogenitet underliggende komplekse vev, noe som er avgjørende for å bestemme karakteristiske genuttrykk mønstre av ulike celletyper. I tillegg kan encellet isolasjon gir innsikt i genet programmene som driver aktivitet av individual celler i tidspunkter gjennom hele utviklingen. Selv om spesielt nyttig i å studere nervesystemet, hvor den fungerer komplekse mobiltelefonnett kan avhenge unike genuttrykk av sjeldne celletyper, kan denne protokollen tilpasses isolere enkeltceller fra ulike vev.

I begynnelsen voksende murine netthinnen, er ganglieceller, horisontale celler, kjegle fotoreseptorlidelser celler og amacrine celler alt generert på en overlappende vindu av tid ^15. I tillegg er hver celle som har gått ut cellesyklus i en annen fase av modningen og dette faktum bare legger til kompleksiteten i å utvikle netthinnen. Til slutt, for noen typer av netthinnens nerveceller, det finnes mange forskjellige morfologi (opp til ~ 30 i tilfelle av amacrine celler) i modne netthinnen ^16. Siden netthinnen er en slik blanding av celletyper, microarray og seriell analyse av genuttrykk (SAGE) baserte studier ^17-19 som støttet seg på homogenizasjon av hele netthinnen ikke klarer å avdekke markører gener uttrykt i sjeldne undergrupper og ute av stand til å løse dynamiske genekspresjon forskjeller mellom celletyper, spesielt under utvikling. For å begynne å forstå kompleksiteten i ulike celletyper både i den voksne netthinnen og under retinal utvikling, har de encellede genuttrykk profiler på ~ 200 individuelle celler fra mange ulike tidspunkt blitt analysert ^2-5,8. De resulterende dataene har gitt en rekke nye markører for individuelle celletyper og ga et vindu inn i viktige overganger i utviklingspsykologi tid som tidligere var lite verdsatt.

De encellede uttrykk profiler har avdekket betydelig heterogenitet i genuttrykk i amacrine celler ^4, der det ble forventet, og i Müller gliaceller cellene, hvor det var uventet ^5. Mens en undersøkelse av de enkelte amacrine celledataene avdekket mer enn 450 gener som ble uttrykt i amacrineceller og ekskluderte fra andre retinale celletyper, ble ingen av disse genene uttrykt i alle amacrine cellene ^4. Disse resultatene mest sannsynlig oppstår fra det faktum at amacrine cellen klassen er ekstremt mangfoldig og den underliggende heterogeniteten er en refleksjon av de forskjellige funksjonene til disse cellene. Disse funnene ville ikke vært mulig å bruke hele vev-baserte tilnærminger. Til slutt vises sykling netthinnens stamceller (RPCS) den høyeste grad av heterogenitet i genuttrykk av noen av de retinale celletypene profilerte ^8. Transkripsjonsfaktorer var klasse av gener med den høyeste grad av heterogenitet blant stamceller, som tyder på at dynamiske genuttrykk mønstre kan spille en viktig rolle i utviklingen av de forskjellige netthinnens celletyper ^8. Igjen, ville disse resultatene ikke vært mulig uten bruk av én celle genuttrykk profilering teknikk.

Encellete transkriptom studierkan også benyttes til å få innsikt i sykdomsmekanismer. I mange nevrodegenerative sykdommer, inkludert netthinnens degenerative sykdommer, noen nerveceller dør mens nabolandet nevronene overleve ^20. Forstå hvorfor noen celler gjennomgå apoptose krever identifisering av gener eller gener programmer som er endret i enkeltceller i disse sykdom modellene. Hel-vev modeller vil igjen potensielt tilsløre de endringer siden cellene ofte ikke dør på samme tid, og derfor til enhver tid vevet er en blanding av døende og etterlatte celler. I tillegg til mange kreftformer cellen opprinnelseslandet er et åpent spørsmål. Dette er spesielt tilfelle med barndommen øyet svulsten retinoblastom. Nylig bruker enkelt celle profilering protokollen detaljert her, ble det vist at individuelle celler fra retinoblastomas besitte genuttrykk programmer av flere celletyper ^21. Det ser ut til at disse cellene er hybrider av udifferensierte stamceller og nevroner ²1. Disse eksperimentene kreves en analyse på én celle-nivå og ville ikke vært mulig med hele vev tilnærminger.

Alternative tilnærminger

Lineær forsterkning er et alternativ til PCR-baserte forsterker protokoll detaljert her. Mens PCR-basert forsterkning antas å resultere i en forskyvning av overflod relasjoner, er lineær forsterkning tenkt å opprettholde disse relasjonene ^22. Teknikken av lineær forsterkning har blitt brukt til å profilere flere nevronale typer ^23. Imidlertid har direkte sammenligninger mellom de to metodene indikerte at den lineære forsterkningen teknikken kan være forbundet med en høy falsk negativ kurs ^24,25. Vi favorisere PCR-basert metode beskrevet i denne rapporten av to grunner. Først i våre eksperimenter har vi fokus på gener med robuste uttrykk forskjeller mellom celler. Andre har vi funnet en meget god korrelasjon mellom vår eneste celle microarray proarkivering eksperimenter og in situ hybridisering studier for de samme genene. Faktisk, hittil har vi utført i situ hybridizations for hundrevis av gener og har observert minst 75% samsvarer med forventet mønster fra mikromatriser. Dette er mest sannsynlig et konservativt estimat ettersom den vanligste årsaken til avvik er mangel på signal fra in situ probe.