Enkelt-celle Profilering af at udvikle og Ældre retinaneuroner

1. Celledissociering

1. Et rutediagram skitserer protokol er vist, er figur 1. For katalognumre af de særlige reagenser, der anvendes i hele denne protokol henvises til tabel 1. Dissekere nethinden i en PBS-bad. Under dissektion, er det bedst at fjerne glaslegemet og linsen, da holde dem med nethinden kan hindre dissociation. Det er ikke altid kritisk vigtigt at fjerne alle de retinale pigmentepitel (RPE) og i nogle tilfælde kan det være umuligt at fjerne den. Men for encellede profilering eksperimenter af fotoreceptorer, bør RPE fjernes. Manglende fjernelse af RPE kan føre til forurening af stangelementerne celle profiler med RPE udtrykte gener. Dette skyldes formentlig forbindelsen mellem fotoreceptorer og RPE.
   For dissociation, er hele den voksne murine nethinder inkuberet ved 37 ° C i 10 minutter i en 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 20pi aktiveret papain, 20 ul 25 mM cystein i 5 mM EDTA og 360 pi Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 10 mM HEPES. Filter-tippes pipettespidser bruges til alle trin i hele protokollen til at minimere potentiel forurening. Den papain koncentration og inkubationstiden vil variere afhængigt af alderen og arten af ​​vævet. For eksempel til at dissociere udvikle nethinder isoleret ved postnatal dag 0 (P0) inkubere nethinden i 10 pi aktiveret papain, 10 ul 25 mM cystein i 5 mM EDTA og 380 pi Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 10 mM HEPES i 10 minutter ved 37 ° C. Nethinder fra forskellige arter også kræve lidt forskellige forhold. Chicken nethinder er tyndere end mus nethinder i de fleste faser af udvikling. Anvendelse af 10 gl aktiveret papain, 10 ul 25 mM cystein i 5 mM EDTA og 380 pi Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 10 mM HEPES i 5 minutter ved 37 ° C er tilstrækkelig til at dissociere these nethinder.
2. Bank forsigtigt på røret for at løsne eventuelle afviklede celler, derefter tritureres forsigtigt 10-20 gange med en P1000 pipette. Inkuber i yderligere 10 minutter ved 37 ° C, hvis store klumper af væv fortsætter, og derefter igen udriv 10-20 gange.
3. Tilsættes 5 ul af DNase I (10 U / ul) og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Findel forsigtigt med en P1000 pipette. Det nøjagtige antal gange skal bestemmes empirisk, men generelt ligger mellem 10-20.
4. Centrifugeres i en table-top centrifuge ved 3000 rpm i 3 minutter fjernes supernatanten, hvilket efterlader 100-200 ml væske på bunden, og tryk på røret for at fjerne bundfaldet. Tilsæt 1 ml HBSS og resuspender pelleten med forsigtig triturering. Trykke røret er kritisk her som simpelthen at resuspendere pelleten med lysere mange af de retinale celler. Dette er især tilfældet med voksne murine nethinder.
5. Centrifuge ved 3000 rpm i 3 minutter forsigtigt fjernes supernatanten og resuspender i 450 pi PBS indeholderING 0,1% BSA. Det er vigtigt at fjerne så meget af supernatanten som muligt for at minimere tilstedeværelsen af ​​mRNA'er fra lyserede celler, og alle produkter fra dissociationen som kan inhibere fremtidige reaktioner.

2. Høst Enkelt celler

1. Forberede to 6 cm skåle indeholdende 5 ml PBS suppleret med 0,1% BSA. Plade de dissocierede celler på en skål og tillader cellerne at bundfælde i mindst 5 min. Den anvendte celle densitet høj grad afhænger af arten af ​​de enkelte celler, der profilerede. For eksempel for meget sjældne celler mærket med en fluorescerende markør, såsom en GFP er hele dissocierede nethinder udpladet på en enkelt 6 cm skål. For celler, der er lidt større, er færre celler indledningsvis udpladet for at gøre det lettere at høste en (eller meget tæt på en) celle med den første mikropipette.
2. Pladen af ​​dissocierede celler på et inverteret mikroskop. Vi bruger IMT-2 model fra Olympus. Brug af mikropipetter, der er blevet trukket til en fine spids (indre diameter 0,5 mm, ydre diameter 1,04 mm) (figur 2) og sammen med en sugeslangen, høste en enkelt celle. Cellerne let ind i mikropipette, når det er placeret tæt på dem på fadet. Det er vigtigt, at sugeslangen hverken er for lang eller for kort afstand til trin forbundet med inverteret mikroskop (De sugeslanger vi anvender vores inverteret mikroskop er 38,1 cm lang). Hvis røret er for lang, kan celler ikke udvises effektivt fra mikropipetten til opsamlingsrøret. Den primære årsag vi bruger den ældre IMT-2 modellen omvendt mikroskop er, at vi har fundet det har den ideelle afstand til scenen for vores emhætte montage rør. Efter indtastning af mikropipetten, er cellen (eller celler) udvist på en anden plade (vask plade) for at sikre, at én og kun én celle høstes til genekspressionsprofilering. På den anden plade er det ofte nødvendigt enten at fjerne fremmede celler med en ny mikropipetteeller flytte cellen af ​​interesse til et andet sted for at sikre, at kun en enkelt celle ind i mikropipetten.
3. Når en individuel celle er fuldstændigt isoleret fra naboceller, anvende et nyt mikropipette at aspirere cellen af ​​interesse, som i afsnit 2.2, og derefter udstøde den direkte i en 0,2 ml PCR-rør indeholdende 4,5 pi cellelysis puffer. Cellen udstødes på den side af røret, er omhyggelig med ikke at bryde spidsen af ​​mikropipetten ind i røret. Prøverne kan centrifugeret kortvarigt i en bænktop mikrocentrifuge at nedsænke cellen i lysisbuffer. Dette spinning sker som regel efter hver 5. celle og derefter igen i slutningen af ​​collection.Tubes indeholdende enkelte celler i lysisbuffer skal opbevares på is for varigheden af ​​enkelt celle isolation. For optimale resultater, er enkelte celler opsamles i et to-timers vinduet efter dissociation. Efter denne tid er gået, er det bedst at gå videre til revers transkription-trinnet, da ekstra tid har været obsered at øge chancerne for RNA-nedbrydning.

3. Revers transskription

1. Kort fortalt spinde prøverne i en benchtop minicentrifuge at sikre, at alle de enkelte celler nedsænkes i cellen lysisbuffer. For at fremme cellelyse, inkubere prøven ved 70 ° C i 90 sek. i en thermocycler. Læg straks rørene tilbage på isen.
2. Forlader rørene på is i 2 min. For alle reagens tilføjelser, skal du bruge filter-tip pipettespidser at forhindre forurening. For at udføre revers transkription, tilsættes 0,33 ul Superscript III (200 U / ul), 0,05 pi RNase-inhibitor (40 U / ul), og 0,07 gl T4 gen 32-protein. Inkubere reaktionsblandingen i 50 minutter ved 50 ° C i en thermocycler. Inaktivere enzymet ved 70 ° C i 15 minutter og anbringes på is.
3. For at fjerne frie primeren tilsættes 0,1 pi Exonuclease buffer (10X), 0,8 ul dH ₂ 0 (molekylærbiologisk kvalitet), og 0,1 pi exonuklease I (20 U / ul). Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter ien thermocycler. Inaktivere enzymet ved at inkubere reaktionen ved 80 ° C i 25 minutter og derefter anbringe rørene på is.

4. Hale og Single-Cell PCR

1. Tilsættes 6 ul af hale reaktionsblandingen og anvende en thermocycler at inkubere prøven ved 37 ° C i 20 minutter, 70 ° C i 10 minutter, og holdes ved 4 ° C
2. Tilsættes 10 ul af hale prøven til PCR-reaktionsblandingen og udføre den anden streng syntese og PCR-amplifikation under anvendelse af følgende betingelser:
   1. 95 ° C i 2 minutter
   2. 37 ° C i 5 minutter
   3. 72 ° C i 16 min
   4. 93 ° C i 40 sek
   5. 67 ° C i 1 minut
   6. 72 ° C i 6 minutter, tilsætning af 6 sekunder pr cyklus
   7. Gå til trin 4 34 gange
   8. 72 ° C i 10 minutter
   9. Henstand ved 4 ° C

5. Mærkning for Affymetrix Chips

1. Etiket 10-20 ug af cDNA (koncentrationen af ​​det amplificerede cDNA resultatring fra en enkelt celle er normalt på ~ 1 ug / ul) til opnåelse af en robust hybridisering af Affymetrix microarrays. Første fragment af cDNA ved tilsætning 10-20 ul af en enkelt-celle cDNA-8 pi 1X One-Phor-All buffer og 1 pi af fortyndet (1:10 i 1X One-Phor-All buffer) DNaseI i en 80 pi reaktion. Inkuber i en thermocycler i 13 minutter ved 37 ° C. Inaktivere DNase I i 15 minutter ved 100 ° C og anbringes på is.
2. Tilsættes 20 ul 5X TdT-puffer, 2,5 pi Biotin N6-ddATP (Enzo Biosciences), og 1 pi TdT (fortyndet 1:08 i TdT-puffer).
3. Inkuber i 90 minutter ved 37 ° C, derefter 5 minutter ved 65 ° C. Opbevar ved -20 ° C eller hybridisere til øjeblikkeligt at en Affymetrix mikroarray. Hybridiseringen udføres ved anvendelse af standard Affymetrix protokoller.

6. Repræsentative resultater

At vurdere kvaliteten af ​​cDNA'et, 10 ul cDNA prøven blev fyldt på en 1% agarosegel. CDNA hovedsageligt bedømt ved størrelsesområdet (500-2000 bp)og intensitet af cDNA smear (figur 1 og figur 3a). I gelen vist i figur 1, viser hver anden bane a cDNA smear af retinale celler isoleret E16.5. Banerne mellem viser de resulterende præparater, når kun mediet aspireres i nålen og aflejres i PCR-rør. Disse baner er aldrig fuldstændig blottet for en svag pletter, men de viser ikke nogen resultater, når gen-specifikke PCR-primere anvendes til at forstærke gener fra dem. Endvidere kan intensiteten af cDNA smear variere noget (sammenlign figur 1 og figur 3A). I figur 3A Banerne A, f, g og h indeholder robuste cDNA smears, mens bane b, c, d og e er betydeligt mindre robust.

Gen-specifik PCR anvendes som en sekundær screening af kvaliteten af ​​cDNA fra en enkelt celle. CDNA'erne i figur 3 blev isoleret fra fluorescerende retinale ganglieceller og de ​​var tested anvendelse af PCR-primere for retina-ganglieceller markører Brn3b og Pax6. Til dette assay blev 1 ul cDNA underkastedes PCR i 30 cykler. Kvantitativ realtids-PCR ville være at foretrække assay, men det kan være uoverkommeligt dyre og er ikke nødvendig for blot at vurdere cDNA kvalitet. Alle 8 af de enkelte celler testet positive for Brn3b og 6 ud 8 for Pax6 (figur 3b). Selv cDNA smears, der var mindre robust fremstillet bånd for Brn3b og Pax6. På trods af disse PCR-resultater, er det vores erfaring, at cDNA smears, såsom dem i bane b, c, d og e ikke giver stabile hybridiseringer på Affymetrix arrays og generelt undgås. Genspecifik PCR for fotoreceptor markør CRX blev anvendt til at bestemme niveauet af kontaminering i de enkelte celle cDNA'er (figur 3b). En fotoreceptor markør blev valgt, fordi disse celler udgør størstedelen af ​​nethinden (~ 70%), og derfor vil enhver cellelysis, der forekom mest sandsynligt involverer stang photoreReceptorerne. Der var kun en svag mængde CRX er til stede i disse cDNA præparater, selv efter 30 cykler af PCR. Endelig kan dette PCR-baseret screening anvendes til at begynde at bestemme, hvilke delmængder af en særlig celletype cDNA'erne blev afledt fra før udsætte dem for en fuld mikroarray profilering. Dette kan hjælpe til at prioritere de celler, der er profileret, da dette er den mest kostbare trin i processen. For eksempel har vi identificeret delmængder af retina-ganglieceller ved screening dem for tilstedeværelsen af genet Tachykinin1 (figur 3b).

Fra den lille PCR-baseret screening er særlig enkelte celler udvælges, og deres cDNA'er hybridiserer til en Affymetrix mikroarray. Den microarray data sammenlignes og mønstre kan blive opdaget ved hjælp af standard klyngedannelse algoritmer. Heatmaps såsom i figur 4, er dannet til grafisk gengivelse af dataene. Der er to væsentlige konklusioner vedrørende de encellede profilering af data i figur4. Første gener udtrykkes i specifikke celletyper findes næsten udelukkende i disse celletyper efter enkelt celle protokol udføres. I de fleste tilfælde, hvor markørgener af en celletype er findes også i en anden celletype, såsom iagttagelse, at bipolære celler udtrykker nogle "stang"-generne i lavere niveauer, dette udtryk i den anden celletype bekræftes let ved enten in situ hybridisering eller antistoffarvning. Sekund, som mere forskelligartet amacrine og gangliecelle profiler er heterogenitet af genekspression umiddelbart indlysende. Pou4f1 kun udtrykkes i omkring 1/4 af u ganglieceller, medens Nr4a2 og Scube2 er to eksempler på heterogent udtrykte gener i forskellige amacrine celler. Faktisk er de gener, der er vist i Heatmap kun et lille udsnit som flere hundrede gener er blevet identificeret og bekræftet som markører for at udvikle ganglieceller eller som markører for forskellige populationer af amacrine celler ^2,4.

Et stadigt voksende antal undersøgelser afsløre robust celle-til-celle variation i populationer, der menes at være mere homogene med hensyn til deres genekspression ^6,8. I mindst et tilfælde har denne genekspression "støj" blevet vist at spille en vigtig biologisk funktion ^13. Genekspressionssystemer forskelle mellem individuelle celler er dækket ved hjælp af traditionelle hel-væv metoder. Disse eksperimenter generere ekspressionsprofilen af et "gennemsnitligt" celle, som ikke kan være repræsentativ ^14. Her præsenterer en fremgangsmåde til isolering og identificering af genekspressionsmønstre fra enkelte retinale celler. Undersøgelse af individuelle celler giver forskere til at probe cellulær heterogenicitet underliggende komplekse væv, hvilket er kritisk for at bestemme karakteristiske genekspressionsmønstre af forskellige celletyper. Derudover kan en enkelt celle isolation give indblik i de gen-programmer, der driver virksomhed individual celler i tidspunkter gennem udvikling. Selvom især nyttig ved undersøgelse af nervesystemet, hvor funktionen af ​​komplekse cellulære net kan afhænge af unikke genekspression af sjældne celletyper, kan denne protokol kan tilpasses til at isolere individuelle celler fra forskellige væv.

I begyndelsen af udviklende muse nethinden, er ganglieceller, vandrette celler, kegle fotoreceptorceller og amacrine celler alle genereret i en overlappende tidsvindue ^15. Derudover hver celle, der har forladt cellecyklus er i en anden fase af modning og dette faktisk kun bidrager til kompleksiteten af ​​udviklingen nethinden. Endelig, for nogle typer af retinale neuroner, findes der adskillige forskellige morfologier (op til ~ 30 i tilfælde af amacrine celler) i det modne nethinden ^16. Idet nethinden er sådan en blanding af celletyper, microarray og serielle analyse af gen-ekspression (SAGE) baserede undersøgelser ^17-19, der påberåbes at homogeniztion af hele nethinden er i stand til at afdække markører gener udtrykt i sjældne undertyper og ude af stand til at løse dynamiske genekspressionssystemer forskelle mellem celletyper, især under udvikling. At begynde at forstå kompleksiteten af forskellige celletyper i både voksne nethinden og under retinal udvikling har encellede genekspressionsprofiler fra ~ 200 individuelle celler fra mange forskellige tidspunkter blev analyseret ^2-5,8. De resulterende data har givet et væld af nye markører for de enkelte celletyper og gav et vindue i vigtige overgange i udviklingspsykologi tid, der tidligere var påskønnet.

De enkelte celleekspressionsvektorer profiler har vist betydelig heterogenitet i genekspression i amacrine celler ^4, hvor det var forventet, og i Muller glia-celler, hvor det var uventet ^5. Mens en undersøgelse af de enkelte amacrine celle data viste mere end 450 gener, som blev udtrykt i amacrineceller og udelukket fra andre retinale celletyper, blev ingen af disse gener udtrykkes i alle amacrine cellerne ^4. Disse resultater mest sandsynligt skyldes, at amacrine celleklasse er yderst forskelligartet og den underliggende heterogenitet er en afspejling af de forskellige funktioner af disse celler. Disse resultater ville ikke have været muligt ved hjælp af hele vævs-baserede løsninger. Endelig cykler retinale progenitorceller (RPCer) viste den højeste grad af heterogenitet i genekspression af enhver af de retinale celletyper profilerede ^8. Transkriptionsfaktorer var klasse af gener med den højeste grad af heterogenitet blandt progenitorceller, hvilket antyder, at dynamiske genekspressionsmønstre kunne spille en vigtig rolle i udviklingen af forskellige retinale celletyper ^8. Igen, vil disse resultater ikke har været mulig uden brug af enkelt celle genekspressionsprofilering teknik.

Encellede transkriptomet undersøgelserkan også anvendes til at opnå indsigt i sygdomsmekanismer. I mange neurodegenerative sygdomme, herunder degenerative retinale sygdomme, dør nogle neuroner, mens de tilstødende neuroner overlever ^20. Forstå, at nogle celler undergår apoptose kræver identifikation af gener eller genprodukter programmer, der er ændret i individuelle celler i disse sygdomsmodeller. Hele-vævsmodeller igen potentielt tilsløre ændringerne siden cellerne ofte ikke dør på samme tid, og derfor til enhver tid vævet er en blanding af dø og overlevende celler. Derudover, for mange kræftformer cellen af ​​oprindelse er et åbent spørgsmål. Dette er især tilfældet med den barndom øjet tumor retinoblastoma. Nylig ved anvendelse af enkelt celle profilering protokol beskrevet her, blev det vist, at individuelle celler fra retinoblastomer besidder genekspressionssystemer programmer multiple celletyper ^21. Det fremgår, at disse celler er hybrider af udifferentierede stamceller og neuroner ²1. Disse eksperimenter krævede en analyse på enkelt celle niveau og ville ikke have været muligt med hele væv tilgange.

Alternative tilgange

Lineær forstærkning er et alternativ til PCR-baserede amplifikationsprotokol detaljeret her. Mens PCR-baseret amplificering menes at resultere i en skævhed i overflod forbindelser er lineær forstærkning menes at opretholde disse forbindelser ^22. Teknik lineær forstærkning er blevet anvendt til at profilere flere neuronale typer ^23. Imidlertid har direkte sammenligninger mellem de to metoder er angivet, at den lineære amplifikationsteknologi kan være forbundet med en høj falsk negativ rate ^24,25. Vi går ind for PCR-metode er beskrevet i denne betænkning af to årsager. Først i vores eksperimenter har vi fokus på gener med robuste udtryk forskelle mellem celler. For det andet har vi fundet en meget god korrelation mellem vores enkelt celle microarray proindgivelse eksperimenter og in situ-hybridiseringsundersøgelser af de samme gener. Faktisk har vi hidtil har udført in situ-hybridiseringer til hundreder af gener og har observeret i mindst 75% matcher forudsagte mønster fra microarrays. Dette er sandsynligvis et konservativt skøn, da den mest almindelige årsag til en afvigelse er en manglende signal fra in situ sonden.