Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

1. Cell Dissociatie

1. Een stroomdiagram waarin het protocol wordt getoond is fig. 1. Voor de catalogusnummers van de specifieke reagentia gebruikt in dit protocol wordt verwezen naar tabel 1. Ontleden het netvlies in een PBS bad. Bij de dissectie is het best om het glasvocht en de lens te verwijderen omdat ze te houden met het netvlies kan belemmeren de dissociatie. Het is niet altijd een belangrijke vereiste voor alle retinale pigment (RPE) te verwijderen en in sommige gevallen kan het niet volledig te verwijderen. Voor enkele cel profilering experimenten fotoreceptoren moet de RPE worden verwijderd. Als de RPE te verwijderen kan leiden tot verontreiniging van de staaf cel profielen met RPE uitgedrukte genen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verbinding tussen de fotoreceptoren en RPE.
   Voor de dissociatie worden totale volwassen muizen netvlies geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 min in een 1,5 ml microcentrifugebuisje met 20il geactiveerde papaïne, 20 pi 25 mM cysteine ​​in 5 mM EDTA en 360 ul Balanced Salt Solution Hank's (HBSS) aangevuld met 10 mM HEPES. Filter-tip pipetpunten worden gebruikt voor alle stappen in het protocol naar mogelijke besmetting te minimaliseren. De papaïne concentratie en de incubatietijd is afhankelijk van de leeftijd en de aard van het weefsel. Bijvoorbeeld dissociëren ontwikkeling netvlies geïsoleerd op postnatale dag 0 (P0) incuberen van de retina in 10 pi geactiveerde papaïne, 10 pi 25 mM cysteine ​​in 5 mM EDTA en 380 ul Balanced Salt Hank's oplossing (HBSS) aangevuld met 10 mM HEPES gedurende 10 min. bij 37 ° C. Netvlies van verschillende soorten vereisen ook enigszins andere omstandigheden. Chicken netvliezen zijn dunner dan de muis netvliezen bij de meeste stadia van ontwikkeling. Met 10 pi geactiveerde papaïne, 10 pi 25 mM cysteine ​​in 5 mM EDTA en Balanced Salt 380 pi Hank's oplossing (HBSS) aangevuld met 10 mM HEPES gedurende 5 min bij 37 ° C voldoende om t dissociëreneze netvliezen.
2. Tik voorzichtig tegen de buis aan een geregeld cellen los te maken, dan voorzichtig 10-20 keer fijnstampen met een P1000 pipet. Incubeer gedurende nog eens 10 min bij 37 ° C als er grote klonten van het weefsel daarna blijven bestaan ​​en opnieuw te vermalen 10-20 keer.
3. Voeg 5 ul DNase I (10 U / pl) en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vermaal voorzichtig met een pipet P1000. Het exacte aantal malen moet empirisch worden bepaald, maar in het algemeen ligt tussen 10-20.
4. Centrifugeer in een tafelblad centrifuge bij 3000 rpm gedurende 3 min Verwijder het supernatant, waarbij 100 tot 200 ul van vloeistof op de bodem en tik de buis aan de pellet verwijderen. Voeg 1 ml HBSS en resuspendeer de pellet met zachte tritureren. Door op de buis is van cruciaal belang hier zo eenvoudig resuspenderen de pellet met lyseren veel van de retinale cellen. Dit geldt vooral met volwassen muizen netvliezen.
5. Centrifuge bij 3000 rpm gedurende 3 min Verwijder de supernatant en hersuspenderen in 450 pi PBS bevattenING 0,1% BSA. Het is belangrijk om zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk opheffen de aanwezigheid van mRNA van gelyseerde cellen en een product uit dissociatie die kan remmen toekomst te minimaliseren.

2. Oogsten enkele cellen

1. Bereid twee 6 cm schalen 5 ml PBS aangevuld met 0,1% BSA. Plaat het gedissocieerde cellen op een schaal en laat de cellen te regelen ten minste 5 minuten. De gebruikte celdichtheid sterk afhankelijk van de aard van de interne cellen worden geprofileerd. Bijvoorbeeld voor zeldzame cellen gelabeld met een fluorescerende merker dergelijke GFP worden hele gescheiden netvlies uitgeplaat op een 6 cm schotel. Voor cellen die enigszins overvloediger zijn minder cellen eerst bedekt om het gemakkelijker een (of dicht bij een) cel oogsten met de eerste micropipet.
2. Plaats de plaat van gescheiden cellen op een omgekeerde microscoop. We gebruiken de IMT-2-model van Olympus. Met behulp van micropipetten die zijn gevestigd op een fine tip (inwendige diameter 0,5 mm, 1,04 mm buitendiameter) (Figuur 2) en samen met een aspiratorinstelling buis oogsten een cel. De cellen gemakkelijk op de micropipet wanneer het in de nabijheid daarvan op de schotel. Het is cruciaal dat de aspirator buis niet te lang of te kort voor de afstand tot het podium in verband met de omgekeerde microscoop (De aspirator buizen gebruiken we met onze omgekeerde microscoop zijn 38,1 cm lang). Indien de buis te lang is, kunnen cellen niet efficiënt worden uitgezet micropipet de verzamelbuis. De belangrijkste reden dat we gebruik maken van de oudere IMT-2-model omgekeerde microscoop is dat we hebben gevonden heeft het de ideale afstand tot het podium voor onze aspirator montage buizen. Na het invoeren van de micropipet, wordt de cel (of cellen) uitgezet op een tweede plaat (wassen plaat) om ervoor te zorgen dat een en slechts een cel wordt geoogst voor de gen expressie profilering. Op de tweede plaat is vaak nodig om een ​​vreemde cellen te verwijderen met een nieuwe micropipetof verplaats de cel van belang zijn voor een andere locatie om ervoor te zorgen dat slechts een enkele cel van de micropipet binnenkomt.
3. Wanneer een individu cel volledig is geïsoleerd van naburige cellen, gebruik een nieuwe micropipet naar de cel van belang te zuigen als in paragraaf 2.2 en vervolgens direct te verdrijven hem in een 0,2 ml PCR-buis met 4,5 pl cellysis buffer. De cel wordt uitgedreven aan de zijkant van de buis, dat evenwel niet afbreken de punt van de micropipet in de buis. De monsters kunnen in het kort worden gesponnen in een tafelmodel microcentrifuge naar de cel in lysisbuffer onder te dompelen. Deze draaiende gebeurt meestal na elke vijfde cel en vervolgens weer aan het einde van collection.Tubes met individuele cellen in lysisbuffer worden op ijs gehouden voor de duur van een enkele cel geïsoleerd. Voor optimale resultaten worden enkele cellen verzameld binnen een twee uur durende venster post-dissociatie. Na deze tijd is verstreken, is het het beste om door te gaan naar de reverse transcriptie stap aangezien extra tijd is waarneembareed de kans RNA verslechteren.

3. Reverse transcriptie

1. In het kort draaien de monsters in een benchtop minicentrifuge om ervoor te zorgen alle afzonderlijke cellen worden ondergedompeld in de cel lysis buffer. Om cellysis bevorderen incuberen het monster bij 70 ° C gedurende 90 sec. een thermocycler. Onmiddellijk zetten de buizen weer op het ijs.
2. Laat de buizen op ijs gedurende 2 minuten. Voor alle reagentia die toevoegingen, gebruik filter-tip pipet tips om besmetting te voorkomen. De omgekeerde transcriptie uitvoeren toe 0,33 pl Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl RNase-inhibitor (40 U / pl), en 0,07 pi T4 gen 32 eiwit. Incubeer het reactiemengsel gedurende 50 min bij 50 ° C in een thermocycler. Inactiveren het enzym bij 70 ° C gedurende 15 min en plaats op ijs.
3. Om de gratis primer te verwijderen, toe te voegen 0,1 pl exonuclease Buffer (10x), 0,8 ul dH ₂ 0 (moleculaire biologie graad), en 0,1 pl exonuclease I (20 U / pl). Incuberen bij 37 ° C gedurende 30 min ineen thermocycler. Inactiveren het enzym door het incuberen van de reactie bij 80 ° C gedurende 25 min. en plaatsen van de buizen op ijs.

4. Tailing en Single-Cell PCR

1. Voeg 6 ul van het reactiemengsel en staart gebruiken thermocycler het monster incuberen bij 37 ° C gedurende 20 min, 70 ° C gedurende 10 min, en houden bij 4 ° C
2. Voeg 10 ul van de staart monster aan de PCR-reactiemengsel en het uitvoeren van de tweede streng synthese en PCR amplificatie met behulp van de volgende voorwaarden:
   1. 95 ° C gedurende 2 min
   2. 37 ° C gedurende 5 min
   3. 72 ° C gedurende 16 min
   4. 93 ° C gedurende 40 sec
   5. 67 ° C gedurende 1 min.
   6. 72 ° C gedurende 6 min, toegevoegd 6 sec per cyclus
   7. Ga naar 4 34 keer stap
   8. 72 ° C gedurende 10 min
   9. Houd bij 4 ° C

5. Etikettering voor Affymetrix Chips

1. Label 10-20 ug van cDNA (de concentratie van het geamplificeerde cDNA resultaatING uit een enkele cel is meestal op ~ 1 ug / ul) om een ​​robuuste hybridisatie op Affymetrix microarrays te verkrijgen. Eerst fragment het cDNA door toevoeging 10-20 ul van de eencellige cDNA 8 pi 1 x One-Phor-All-buffer en 1 pi van verdunde (1:10 in 1X One-Phor-All buffer) DNasel in 80 pi reactie. Incubeer in een thermocycler voor 13 min bij 37 ° C. Inactiveren de DNase I gedurende 15 min bij 100 ° C plaats en op ijs.
2. Voeg 20 pi 5X TdT buffer, 2,5 pi biotine N6-ddATP (Enzo Biosciences), en 1 pi TdT (verdund 1:08 in TdT buffer).
3. Incubeer 90 min bij 37 ° C, daarna 5 min bij 65 ° C. Bewaar bij -20 ° C of hybridiseren onmiddellijk naar een Affymetrix microarray. De hybridisatie wordt uitgevoerd met standaard Affymetrix-protocollen.

6. Representatieve resultaten

Om de kwaliteit van de cDNA, 10 pi van de cDNA monster beoordelen werd geladen op een 1% agarose gel. Het cDNA wordt voornamelijk beoordeeld door de orde van grootte (500-2000 bp)en intensiteit van de cDNA uitstrijkje (figuur 1 en figuur 3a). In de gel in figuur 1, om de baan toont een cDNA uitstrijk van retinacellen geïsoleerd E16.5. De banen zien tussen de daaruit voortvloeiende vegen wanneer alleen de media wordt verslikken in de naald en gestort in het PCR-buis. Deze banen zijn nooit helemaal verstoken van een zwakke uitstrijkje, maar ze vertonen geen resultaten bij het gen-specifieke PCR-primers worden gebruikt om genen van hen te versterken. Daarnaast kan de intensiteit van de cDNA uitstrijkje enigszins variëren (vergelijk figuur 1 en figuur 3a). In figuur 3a banen a, f, g en h bevatten robuuste cDNA uitstrijkjes terwijl doorgangen b, c, d en e aanmerkelijk minder robuust.

Gene-specifieke PCR wordt gebruikt als tweede scherm van de kwaliteit van de cDNA uit een enkele cel. De cDNA's in figuur 3 werden geïsoleerd uit fluorescerende retinale ganglioncellen en ze waren tested met behulp van PCR-primers voor de retinale ganglion cel markers Brn3b en PAX6. Voor deze test werd 1 pi van de cDNA onderworpen aan PCR 30 cycli. Real-time kwantitatieve PCR zou voorkeur assay, maar het kan kostbaar en niet noodzakelijk is voor de beoordeling van de cDNA alleen kwaliteit. Alle 8 van de individuele cellen positief getest op Brn3b en 6 uit 8 voor PAX6 (figuur 3b). Zelfs de cDNA uitstrijkjes die minder robuust geproduceerd banden voor Brn3b en PAX6. Ondanks deze PCR-resultaten, is het onze ervaring dat cDNA uitstrijkjes zoals die in lanen b, c, d en e niet robuust hybridisaties rendement op Affymetrix arrays en zijn over het algemeen vermeden. Gene specifieke PCR voor de fotogeleider marker Crx werd gebruikt om de mate van verontreiniging in de cel cDNA (figuur 3b) te bepalen. Een fotoreceptor marker is gekozen omdat deze cellen vormen de meerderheid van het netvlies (~ 70%) en daarom zou een cellysis die zich het meest waarschijnlijk te betrekken staaf photoreceptors. Er werd slechts een zwakke hoeveelheid Crx in deze cDNA preparaten ook na 30 cycli van PCR. Tenslotte kan deze PCR scherm worden beginnen te bepalen welke subsets van een bepaald celtype de cDNA's werden afgeleid van voor deze te onderwerpen aan een volledig microarray profilering. Dit kan helpen om de cellen die zijn geprofileerd, want dit is de duurste stap in het proces te prioriteren. Zo hebben wij vastgesteld subsets van retinale ganglioncellen door screening aan de aanwezigheid van het gen Tachykinin1 (figuur 3b).

Van de kleine PCR-gebaseerde scherm, zijn vooral enkele cellen gekozen en hun cDNA's gehybridiseerd aan een microarray Affymetrix. De microarray gegevens worden vergeleken en patronen kunnen worden ontdekt met behulp van standaard clustering algoritmen. Heatmaps, zoals in figuur 4, worden gegenereerd grafisch vertegenwoordigen data. Er zijn twee belangrijke conclusies met betrekking tot de enkele cel profilering gegevens in figuur4. Eerst worden genen uitgedrukt in specifieke celtypen vrijwel uitsluitend in deze celtypen na cel protocol wordt uitgevoerd. In de meeste gevallen waar markergenen een celtype ook in een tweede celtype, zoals de waarneming dat de bipolaire cellen sommige "rod" genen tot expressie op een lager niveau, dat expressie in de tweede cel type gemakkelijk bevestigd door een in situ hybridisatie of antilichaam kleuring. Ten tweede, binnen de meer diverse amacrine en ganglion cel profielen, heterogeniteit van genexpressie is meteen duidelijk. Pou4f1 wordt alleen uitgedrukt in ongeveer 1/4 van de zich ontwikkelende ganglion cellen, terwijl Nr4a2 en Scube2 zijn twee voorbeelden van heterogeen uitgedrukte genen in verschillende amacrine cellen. In feite is de genen die in de heatmap zijn slechts een kleine greep als een paar honderd genen geïdentificeerd en bevestigd als markers van de ontwikkeling van ganglion cellen of als markers van verschillende populaties van amacrine cellen ^2,4.

Een steeds groeiend aantal studies zijn onthullend robuuste cel-tot-cel variatie in populaties die werden geloofd om meer homogeen zijn met betrekking tot hun genexpressie ^6,8. In ten minste een geval, dit genexpressie "ruis" blijkt een belangrijke biologische functie ¹³ spelen. Genexpressie verschillen tussen individuele cellen worden verduisterd met behulp van traditionele gehele weefsel methoden. Deze experimenten genereren de expressie profiel van een "gemiddelde" cel, die mogelijk niet representatief zijn ^14. Hier vormen een methode voor het isoleren en identificeren van de genexpressie patronen een retinacellen. De studie van individuele cellen stelt onderzoekers in staat om te ontdekken of de cellulaire heterogeniteit ten grondslag liggen aan complexe weefsels, die van cruciaal belang voor het bepalen van onderscheidende genexpressie patronen van verschillende celtypen. Bovendien kunnen single-cell isolatie geven inzicht in het gen-programma's besturen van de activiteit van individual cellen tijdstippen gedurende de ontwikkeling. Hoewel bijzonder nuttig bij het bestuderen van zenuwstelsel, waar de werking van complexe cellulaire netwerken kan afhangen van de unieke genexpressie van zeldzame celtypes, kan dit protocol worden aangepast aan individuele cellen te isoleren uit verschillende weefsels.

In het begin van ontwikkelende muizen netvlies, worden ganglion cellen, horizontale cellen, kegel fotoreceptorcellen en amacrine cellen alle gegenereerd in een overlappend venster van de tijd ^15. Bovendien elke cel die is afgesloten de celcyclus in een andere fase van rijping en dit feit alleen bij tot de complexiteit van de ontwikkeling retina. Tenslotte voor sommige retinale neuronen, er talrijke verschillende morfologie (tot ongeveer 30 bij amacrine cellen) in de volwassen retina ^16. Omdat het netvlies is zo'n een mengsel van celtypen, microarray en seriële analyse van genexpressie (SAGE) op basis van studies ^17-19, die berustte op de homogenizatie van de gehele netvlies niet in staat zijn markers genen die tot expressie in zeldzame subtypes en niet in staat om dynamische genexpressie verschillen tussen de soorten cellen op te lossen bloot te leggen, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling. Om te beginnen de complexiteit van verschillende celtypes, zowel in de volwassen netvlies en in het netvlies ontwikkeling te begrijpen, hebben de enkele cel genexpressie profielen van ~ 200 individuele cellen uit veel verschillende tijdstippen geanalyseerd ^2-5,8. De resulterende gegevens heeft een groot aantal nieuwe markers voor individuele celtypes en voorzien van een venster in de belangrijke overgangen in ontwikkelingstijd die voorheen niet gewaardeerd.

De enkele cel expressie profielen is gebleken aanzienlijke heterogeniteit in genexpressie in amacrine cellen ^4, waar het werd verwacht, en in het Müller gliacellen, waar het was onverwacht ^5. Hoewel een onderzoek van de interne amacrine cel gegevens bleek meer dan 450 genen die werden uitgedrukt in amacrinecellen en niet van andere retinale celtypen geen van deze genen tot expressie in de amacrine cellen ^4. Deze resultaten waarschijnlijk voort uit het feit dat de amacrine cel klasse is zeer divers en de onderliggende heterogeniteit is een weerspiegeling van de verschillende functies van deze cellen. Deze bevindingen zouden niet mogelijk zijn geweest met hele weefsel-gebaseerde benaderingen. Tot slot, fietsen retinale progenitorcellen (RPC's) getoond de hoogste graad van heterogeniteit in de genexpressie van een van de retinale celtypen geprofileerd ^8. Transcriptie factoren waren de klasse van genen met de hoogste graad van heterogeniteit van de stamcellen, wat suggereert dat dynamische genexpressiepatronen kan een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van de verschillende retinale celtypen ^8. Ook zou deze resultaten niet mogelijk zonder het gebruik van de cel genexpressie techniek.

Enkele cel transcriptoom studieskan ook worden gebruikt om inzicht te krijgen in ziektemechanismen. In vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder retinale degeneratieve ziekten, sommige neuronen sterven terwijl de naburige neuronen overleven ^20. Het begrijpen waarom sommige cellen ondergaan apoptose vereist de identificatie van genen of gen programma's die worden in individuele cellen veranderd in deze ziekte modellen. Whole-weefsel modellen weer mogelijk verduisteren de veranderingen sinds cellen vaak niet sterven op hetzelfde moment, en dus op een bepaald moment het weefsel is een mengsel van sterven en overlevende cellen. Daarnaast is het voor vele vormen van kanker de cel van oorsprong, is een open vraag. Dit is vooral het geval bij de jeugd oogtumor retinoblastoom. Onlangs met behulp van de enkele cel profilering protocol hier worden beschreven, werd aangetoond dat individuele cellen van retinoblastomen genexpressie programma's van meerdere celtypen ²¹ bezitten. Het blijkt dat deze cellen zijn hybriden van ongedifferentieerde stamcellen en neuronen ²1. Deze experimenten vereist een analyse op de single cell niveau en zou niet mogelijk zijn geweest met hele weefsel benaderingen.

Alternatieve benaderingen

Lineaire versterking is een alternatief voor de PCR-amplificatie protocol hier beschreven. Hoewel PCR amplificatie wordt aangenomen leiden tot een scheeftrekken van overvloed verhoudingen, wordt lineaire versterking gedacht te handhaven deze relaties ^22. De techniek van lineaire versterking is gebruikt bij profiel verschillende neurontypen ^23. Echter, de directe vergelijkingen tussen de twee methoden aangegeven dat de lineaire versterking techniek kan worden geassocieerd met een hoge vals-negatieve tarief ^24,25. Wij geven de voorkeur van de PCR-methode beschreven in dit rapport om twee redenen. Ten eerste, in onze experimenten richten we ons op genen met een robuuste expressie verschillen tussen de cellen. Ten tweede hebben we een zeer goede correlatie tussen onze eencellige micro-array proindiening experimenten en in situ hybridisatie studies dezelfde genen. In feite heden zijn we in situ hybridisatie voor honderden genen en hebben waargenomen ten minste 75% overeenkomt met het voorspelde patroon van microarrays. Dit is waarschijnlijk een conservatieve schatting, omdat de meest voorkomende reden voor een discrepantie is een gebrek aan signaal van de in situ-sonde.