Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

1. Dissociazione cellulare

1. Un diagramma di flusso che illustra il protocollo viene mostrata è Figura 1. Per i numeri di catalogo dei particolari reagenti usati in questo protocollo, si prega di fare riferimento alla Tabella 1. Sezionare la retina in un bagno PBS. Durante la dissezione, è preferibile rimuovere il vitreo e la lente dal tenendoli con la retina può impedire la dissociazione. Non è sempre di fondamentale importanza per rimuovere tutto l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e in alcuni casi può essere impossibile rimuoverla completamente. Tuttavia, per esperimenti singoli profili cellule di fotorecettori, la RPE deve essere rimosso. La mancata rimozione della RPE può portare alla contaminazione dei profili della cellula a bastoncello con RPE geni espressi. Questo è presumibilmente dovuto al collegamento tra i fotorecettori e dell'epitelio pigmentato.
   Per la dissociazione, interi retine adulti murini sono incubate a 37 ° C per 10 min in una provetta da 1,5 ml contenente 20microlitri attivato papaina, 20 pl cisteina 25 mM a 5 mM EDTA, e 360 ​​microlitri di Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM di HEPES. Col filtro puntali vengono utilizzati per tutte le fasi di tutto il protocollo per minimizzare la contaminazione potenziale. La concentrazione papaina e il tempo di incubazione varierà a seconda dell'età e la natura del tessuto. Ad esempio, per dissociare sviluppo retine isolato al giorno postnatale 0 (P0), incubare la retina in 10 pl attivato papaina, 10 pl 25 cisteina mM a 5 mM EDTA, e 380 microlitri di Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM di HEPES per 10 min a 37 ° C. Retine di specie diverse anche esigere condizioni leggermente diverse. Retine di pollo sono più sottili di retina di topo alla maggior parte delle fasi di sviluppo. Utilizzo di 10 pl attivato papaina, 10 microlitri 25 mM cisteina in 5 mM EDTA, e soluzione salina bilanciata di 380 pl di Hank (HBSS) supplementato con 10 mM di HEPES per 5 min a 37 ° C è sufficiente per dissociare these retine.
2. Battere delicatamente il tubo per rimuovere tutte le cellule si stabilirono, quindi triturare delicatamente 10-20 volte con una pipetta P1000. Incubare per altri 10 min a 37 ° C se si osservano grandi di tessuto persistono e poi ri-triturare 10-20 volte.
3. Aggiungere 5 pl di DNasi I (10 U / pl) e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Triturare delicatamente con una pipetta P1000. Il numero esatto di volte che dovrà essere determinata in modo empirico, ma cade in genere tra i 10-20.
4. Centrifugare in un tavolo centrifugare a 3000 rpm per 3 min Rimuovere il surnatante, lasciando 100-200 ul di liquido sul fondo, e toccare il tubo per rimuovere il pellet. Aggiungere 1 ml di HBSS e risospendere il pellet con la triturazione gentile. Toccando il tubo è fondamentale qui semplicemente come risospendere il pellet con molti lisi delle cellule retiniche. Ciò è vero soprattutto con adulti retine murine.
5. Centrifugare a 3000 rpm per 3 min Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere in 450 microlitri di PBS contieneING BSA 0,1%. È importante rimuovere la maggior quantità di supernatante possibile per minimizzare la presenza di mRNA da cellule lisate e altri prodotti dalla dissociazione che potrebbe inibire reazioni future.

2. Raccolta di cellule singole

1. Preparare due piatti 6 cm contenenti 5 ml di PBS supplementato con 0,1% BSA. Piastra di cellule dissociate su un piatto e consentono alle cellule di riposare per almeno 5 min. La densità cellulare usata dipende molto dalla natura delle singole celle essendo profilati. Ad esempio, per le celle molto rari marcate con un marcatore fluorescente tale GFP, intere retine dissociate sono piastrate su un piatto unico 6 cm. Per le celle che sono un po 'più abbondante, meno cellule vengono piastrate inizialmente per rendere più facile il raccolto uno (o molto vicino a uno) cella con la prima micropipetta.
2. Porre la piastra di cellule dissociate su un microscopio invertito. Usiamo l'IMT-2 modello da Olympus. Utilizzo di micropipette che sono stati attirati da una fiNE punta (diametro interno 0,5 mm, diametro esterno 1,04 millimetri) (Figura 2) e con un tubo aspiratore, raccogliere una singola cella. Le cellule facilmente entrare nella micropipetta quando è posto vicino a loro sul piatto. E 'fondamentale che il tubo di aspirazione non è né troppo lungo né troppo corto per la distanza alla fase associata al microscopio invertito (I tubi aspiratori che usiamo con il nostro microscopio invertito sono 38,1 cm di lunghezza). Se il tubo è troppo lungo, le cellule non può essere espulso in modo efficiente dal micropipetta nel tubo di raccolta. La ragione principale che usiamo il vecchio modello IMT-2 microscopio invertito è che abbiamo trovato è la distanza ideale per la fase di tubi aspiratori nostra assemblea. Dopo aver inserito la micropipetta, la cella (o celle) viene espulso su una seconda piastra (piastra lavaggio) per assicurare che uno e solo una cella viene raccolto per profili di espressione genica. Sulla seconda piastra è spesso necessario rimuovere o cellule estranee con una micropipetta nuovao spostare la cella di interesse in una posizione diversa per assicurare che solo una singola cellula entra micropipetta.
3. Quando una singola cella è completamente isolato da cellule vicine, utilizzare una micropipetta nuovo per aspirare la cella di interesse come al punto 2.2 e quindi espellere direttamente in una provetta da 0,2 ml PCR contenente 4,5 microlitri tampone di lisi cellulare. La cella viene espulso sul lato del tubo, facendo attenzione a non rompere la punta della micropipetta nel tubo. I campioni possono essere centrifugati brevemente in una microcentrifuga da banco per immergere la cella in tampone di lisi. Questo filatura viene solitamente eseguita dopo ogni cella 5a e quindi nuovamente alla fine della collection.Tubes contenenti singole cellule in tampone di lisi devono essere tenuti in ghiaccio per tutta la durata della isolamento singola cella. Per ottenere risultati ottimali, le singole celle vengono raccolte all'interno di una finestra di due ore post-dissociazione. Trascorso questo tempo è trascorso, è meglio procedere alla fase di trascrizione inversa in quanto tempo supplementare è stato ossered aumentare le possibilità di degradazione dell'RNA.

3. Trascrizione inversa

1. Brevemente girare i campioni in un minicentrifuge banco per assicurare che tutte le singole cellule sono immerse nel buffer di lisi cellulare. Per promuovere la lisi cellulare, incubare il campione a 70 ° C per 90 sec. in un termociclatore. Porre immediatamente i tubi di nuovo sul ghiaccio.
2. Lasciare le provette su ghiaccio per 2 min. Per tutte le aggiunte di reagente, utilizzare il filtro-punta punte di pipetta per evitare contaminazioni. Per eseguire la trascrizione inversa, aggiungere 0,33 microlitri Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl inibitore della RNasi (40 U / pl), e 0,07 microlitri gene T4 32 proteina. Incubare la miscela di reazione per 50 min a 50 ° C in un termociclatore. Inattivare l'enzima a 70 ° C per 15 min e posto su ghiaccio.
3. Per rimuovere il primer libero, aggiungere 0,1 microlitri esonucleasi Buffer (10X), 0,8 microlitri dH ₂ 0 (per biologia molecolare), e 0,1 microlitri esonucleasi I (20 U / mL). Incubare a 37 ° C per 30 min inun termociclatore. Inattivare l'enzima incubando la reazione a 80 ° C per 25 min e quindi posizionare i tubi in ghiaccio.

4. Tailing e Single-Cell PCR

1. Aggiungere 6 pl della miscela di reazione tailing e utilizzare un termociclatore per incubare il campione a 37 ° C per 20 min, 70 ° C per 10 min, e mantenere a 4 ° C
2. Aggiungere 10 microlitri del campione coda alla miscela di reazione PCR ed eseguire la sintesi secondo filamento e amplificazione PCR usando le seguenti condizioni:
   1. 95 ° C per 2 min
   2. 37 ° C per 5 min
   3. 72 ° C per 16 min
   4. 93 ° C per 40 sec
   5. 67 ° C per 1 min
   6. 72 ° C per 6 minuti, aggiungendo 6 sec per ciclo
   7. Passare al punto 4 34 volte
   8. 72 ° C per 10 min
   9. Mantenere a 4 ° C

5. Etichettatura per Chips Affymetrix

1. Etichetta 10-20 pg di cDNA (la concentrazione del risultato cDNA amplificatore da una singola cellula è di solito ~ 1 pg / pl) per ottenere un forte ibridazione su microarray Affymetrix. In primo luogo, il frammento di cDNA aggiungendo 10-20 pl della singola cellula cDNA di 8 microlitri 1X One-Phor All-tampone e 1 ml di diluito (1:10 in 1X One-Phor-Tutto buffer) DNaseI in 80 pl reazione. Incubare in un termociclatore per 13 min a 37 ° C. Inattivare la DNasi per 15 min a 100 ° C e posto su ghiaccio.
2. Aggiungere 20 ul tampone TdT 5X, 2,5 microlitri Biotina N6-ddATP (Enzo Biosciences), e 1 pl TdT (diluito 1:8 in tampone TdT).
3. Incubare per 90 min a 37 ° C, quindi 5 min a 65 ° C. Conservare a -20 ° C o ibridarsi immediatamente ad un microarray Affymetrix. La ibridazione viene eseguita utilizzando protocolli standard Affymetrix.

6. Risultati rappresentativi

Per valutare la qualità del cDNA, 10 microlitri del campione di cDNA è stato caricato su un gel di agarosio all'1%. Il cDNA è principalmente giudicata dal campo di dimensioni (500-2000 bp)e l'intensità della macchia cDNA (Figura 1 e Figura 3a). Nel gel illustrato in Figura 1, ogni altra corsia mostra una striscio cDNA isolato da cellule retiniche E16.5. Le corsie tra mostrano gli strisci risultanti quando solo supporti viene aspirata nella dell'ago e depositato nel tubo PCR. Queste linee non sono completamente privi di uno striscio debole, ma non mostrano alcun risultato quando gene-specifici primer PCR sono utilizzati per amplificare i geni da loro. Inoltre, l'intensità del striscio cDNA può variare un po '(comparare Figura 1 e Figura 3a). In Figura 3a corsia a, f, g, h e contenere robusti strisci di cDNA, mentre corsie b, c, d, ed e sono molto meno robusti.

Gene-specifico PCR viene utilizzato come schermo secondario della qualità del cDNA da una singola cellula. I cDNA in figura 3 sono stati isolati da cellule gangliari retiniche fluorescenti ed erano tested utilizzando primer PCR per l'ganglio retinico cella marcatori Brn3b e Pax6. Per questo saggio, 1 microlitri del cDNA è stato sottoposto a PCR per 30 cicli. Real-PCR quantitativa in tempo sarebbe un saggio preferibile, ma può essere costosa e non è necessaria soltanto per valutare la qualità cDNA. Tutte 8 delle singole celle sono risultati positivi per Brn3b e 6 su 8 per Pax6 (Figura 3b). Anche gli strisci di cDNA che erano meno robusta band prodotte per Brn3b e Pax6. Nonostante questi risultati PCR, è la nostra esperienza che strisci di cDNA come quelle corsie b, c, d, ed e non cedono ibridazioni robusti su array Affymetrix e sono generalmente evitato. Gene PCR specifici per il marcatore fotorecettore Crx è stato utilizzato per determinare il livello di contaminazione dei cDNA singola cellula (Figura 3b). Un marcatore fotorecettore è stato scelto perché queste cellule costituiscono la maggioranza della retina (~ 70%) e, pertanto, qualsiasi lisi cellulare che si è verificato molto probabilmente comporta asta photoreceptors. C'era solo una quantità debole Crx presenti in queste preparazioni di cDNA anche dopo 30 cicli di PCR. Infine, questo PCR basato schermo può essere usato per iniziare a determinare quale sottoinsiemi di un particolare tipo di cellula i cDNA sono stati derivati ​​da prima di sottoporli ad una profilatura microarray completo. Ciò può aiutare a priorità le cellule che sono sagomati, in quanto questo è il passo più costoso nel processo. Ad esempio, abbiamo identificato sottoinsiemi di cellule gangliari retiniche mediante screening loro per la presenza del gene Tachykinin1 (Figura 3b).

Dal piccolo PCR basato schermo, particolari cellule singole sono scelti e loro cDNA ibridati uno microarray Affymetrix. I dati microarray viene confrontato e modelli può essere scoperto usando algoritmi di clustering standard. Mappe di calore, come in figura 4, vengono generati a rappresentare graficamente i dati. Ci sono due conclusioni principali per quanto riguarda i singoli dati delle celle di profilatura in figura4. In primo luogo, i geni espressi in specifici tipi cellulari si trovano quasi esclusivamente in questi tipi di cellule dopo il protocollo singola cella viene eseguita. Nella maggior parte dei casi in cui si trovano i geni marcatori di un tipo di cellula anche in un secondo tipo di cellule, come l'osservazione che le cellule esprimono bipolari alcuni geni "asta" a bassi livelli, questa espressione nel secondo tipo di cellule è confermato facilmente da o in situ ibridazione o colorazione anticorpale. In secondo luogo, all'interno del amacrine più diversificata e profili delle cellule gangliari, l'eterogeneità di espressione genica è immediatamente evidente. Pou4f1 è espresso solo in circa 1/4 delle cellule gangliari in via di sviluppo, mentre Nr4a2 e Scube2 sono due esempi di geni espressi in modo eterogeneo diversi cellule amacrine. Infatti, i geni mostrati nella heatmap sono solo un piccolo campione di diverse centinaia di geni sono stati identificati e confermati come marcatori di cellule gangliari sviluppo o come marcatori di differenti popolazioni di cellule amacrine ^2,4.

Un sempre crescente numero di studi stanno rivelando robusta cellula-cellula variabilità nelle popolazioni che sono state ritenute più omogenee per quanto riguarda la loro espressione genica ^6,8. In almeno un caso, questa espressione genica "rumore" ha dimostrato di giocare un importante funzione biologica ^13. Le differenze di espressione genica tra le singole cellule sono oscurate con i tradizionali metodi di interi tessuti. Questi esperimenti generare il profilo di espressione di una cella "medio", che non possono essere rappresentativi ^14. Presentiamo qui un metodo per l'isolamento e l'identificazione dei pattern di espressione genica di singole cellule retiniche. Lo studio delle singole cellule permette ai ricercatori di sondare la eterogeneità cellulare alla base di tessuti complessi, che è critica per determinare distintivi schemi di espressione genica di vari tipi di cellule. Inoltre, singola cella di isolamento possono approfondire la conoscenza dei programmi genetici di guida l'attività di indivcellule idual a intervalli di tempo durante lo sviluppo. Sebbene particolarmente utile nello studio del sistema nervoso, in cui il funzionamento del complesso reti cellulari può dipendere dalla genica unica di tipi di cellule rare, questo protocollo può essere adattato per isolare le singole celle da vari tessuti.

Nei primi anni in via di sviluppo-retina di topo, le cellule gangliari, cellule orizzontali, cellule fotorecettori coni e cellule amacrine sono tutti generati in una finestra sovrapposta di tempo ^15. Inoltre, ogni cella che ha terminato il ciclo cellulare è in una differente fase di maturazione e questo fatto soltanto contribuisce alla complessità della retina sviluppo. Infine, per alcuni tipi di neuroni retinici, esistono numerosi differenti morfologie (fino a ~ 30 nel caso di cellule amacrine) nella retina ¹⁶ maturo. Poiché la retina è una miscela di tipi cellulari, microarray e analisi seriale dell'espressione genica (SAGE) studi basati ^17-19 che si basava sulla homogenizzione dell'intera retina non sono in grado di scoprire i geni marcatori espressi in sottotipi rare e dinamiche in grado di risolvere le differenze di espressione genica tra i tipi di cellule, in particolare durante lo sviluppo. Per iniziare a comprendere la complessità di diversi tipi di cellule nella retina, sia adulto e durante lo sviluppo della retina, i singoli profili di espressione genica delle cellule di ~ 200 celle singole da molti punti di tempi diversi sono stati analizzati ^2-5,8. I dati risultanti ha fornito una serie di nuovi marcatori per i tipi delle singole celle e ha fornito una finestra importanti transizioni in tempo di sviluppo che in precedenza erano apprezzati.

I singoli profili di espressione di cellule hanno rivelato notevole eterogeneità di espressione genica in cellule amacrine ^4, dove era atteso, e nelle cellule gliali Müller, dove era inaspettato ^5. Mentre un esame dei dati di singole cellule amacrine rivelato più di 450 geni che sono stati espressi in amacrinecellule e esclusi da altri tipi di cellule retiniche, nessuno di questi geni sono stati espressi in tutte le cellule amacrine ^4. Questi risultati molto probabilmente derivano dal fatto che la classe cella amacrine è estremamente vario e la eterogeneità sottostante è un riflesso delle diverse funzioni di queste cellule. Questi risultati non sarebbero stati possibili utilizzando interi tessuti a base di approcci. Infine, cellule progenitrici retiniche bicicletta (RPC) visualizzato il massimo grado di eterogeneità in espressione genica di uno qualsiasi dei tipi di cellule retiniche profilato ^8. I fattori di trascrizione sono la classe di geni con il massimo grado di eterogeneità tra le cellule progenitrici, suggerendo che dinamiche pattern di espressione genica potrebbe svolgere un ruolo importante nello sviluppo dei diversi tipi di cellule retiniche ^8. Ancora, questi risultati non sarebbe stato possibile senza l'uso della tecnica singolo gene profiling cella di espressione.

Singole cellule trascrittoma studipuò essere utilizzato anche per ottenere informazioni sui meccanismi della malattia. In molte malattie neurodegenerative, tra cui malattie degenerative della retina, alcuni neuroni muoiono, mentre i neuroni vicini sopravvivono ^20. Capire perché alcune cellule subiscono apoptosi richiede l'identificazione di geni o programmi di geni che vengono alterati nelle cellule individuali in questi modelli di malattia. Tutta-tessuto modelli nuovamente potenzialmente oscurare le modifiche rispetto cellule spesso non muoiono al tempo stesso e, quindi, in ogni momento il tessuto è una miscela di cellule sopravvissute e morte. Inoltre, per molti tumori la cellula di origine è una questione aperta. Ciò è particolarmente il caso del retinoblastoma tumore infantile dell'occhio. Recentemente utilizzando il protocollo singola cella profilatura dettagliati qui, è stato dimostrato che le cellule individuali retinoblastomi possedere programmi di espressione genica di molteplici tipi cellulari ^21. Sembra che queste cellule sono ibridi di cellule progenitrici indifferenziate e neuroni ²1. Questi esperimenti hanno richiesto un'analisi a livello di singola cellula e non sarebbe stato possibile con i metodi dei tessuti interi.

Approcci alternativi

Amplificazione lineare è un'alternativa alla PCR basato su protocollo di amplificazione descritti qui. Mentre PCR-amplificazione basata Si ritiene comportare una inclinazione di rapporti abbondanza, amplificazione lineare è pensato di mantenere queste relazioni ^22. La tecnica di amplificazione lineare è stato utilizzato per analizzare diversi tipi neuronali ^23. Tuttavia, confronti diretti tra i due metodi hanno indicato che la tecnica di amplificazione lineare può essere associata ad un alto tasso di falsi negativi ^24,25. Siamo favorevoli alla PCR-based metodo descritto in questa relazione per due motivi. In primo luogo, nei nostri esperimenti ci concentriamo sui geni con le differenze di espressione robuste tra le cellule. In secondo luogo, abbiamo trovato una correlazione molto buona tra la nostra singola cellula microarray prodeposito esperimenti e studi di ibridazione in situ per gli stessi geni. In effetti, ad oggi abbiamo svolto in ibridazioni in situ per centinaia di geni e hanno osservato almeno il 75% corrisponde al modello previsto dalle microarrays. Questo è probabilmente una stima per difetto in quanto la ragione più comune per una discrepanza è una mancanza di segnale proveniente dalla sonda in situ.