Une seule cellule de profilage de développer et d'âge mûr neurones de la rétine

1. Dissociation cellulaire

1. Un organigramme décrivant le protocole qui est affiché est la figure 1. Pour les numéros de catalogue des réactifs particuliers utilisés dans le présent protocole, s'il vous plaît se référer au tableau 1. Disséquer la rétine dans un bain de PBS. Lors de la dissection, il est préférable d'enlever le vitré et la lentille depuis les garder avec la rétine peuvent entraver la dissociation. Il n'est pas toujours une importance cruciale pour supprimer tous les de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et, dans certains cas, il peut être impossible de le supprimer complètement. Toutefois, pour les simples expériences de profilage des cellules de photorécepteurs, l'EPR devrait être supprimée. Si vous n'enlevez pas l'EPR peut conduire à une contamination des profils de cellules de tige avec des RPE gènes exprimés. C'est probablement à cause de la connexion entre les photorécepteurs et l'EPR.
   Pour la dissociation, l'ensemble des adultes rétines de souris sont incubées à 37 ° C pendant 10 min dans un microtube de 1,5 ml contenant 20ul activé la papaïne, 20 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d'EDTA, et 360 ul de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM de HEPES. Des pointes de pipette à bout filtre sont utilisés pour toutes les étapes à travers le protocole pour réduire au minimum la contamination potentielle. La concentration papaïne et le temps d'incubation varie en fonction de l'âge et la nature du tissu. Par exemple, de dissocier le développement rétines isolées au jour postnatal 0 (P0), incuber la rétine dans 10 ul papaïne activée, 10 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d'EDTA, et 380 Solution ul saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM d'HEPES pendant 10 min à 37 ° C. Rétines de différentes espèces requièrent également des conditions légèrement différentes. Rétines de poulet sont plus minces que la rétine de souris dans la plupart des stades de développement. Utilisation de 10 ul activé la papaïne, 10 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d'EDTA, et la solution de 380 ul saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM de HEPES pendant 5 min à 37 ° C est suffisante pour dissocier trétines Hese.
2. Tapoter légèrement le tube pour déloger les cellules sédimentées, puis triturer doucement 10-20 fois avec une pipette P1000. Incuber pendant 10 min de plus à 37 ° C si de grosses touffes de tissu persistent et puis re-triturer 10-20 fois.
3. Ajouter 5 ul de DNase I (10 U / pl) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Triturer doucement avec une pipette P1000. Le nombre exact de fois devra être déterminé de manière empirique, mais se situe généralement entre 10-20.
4. Centrifugeuse dans une centrifugeuse de table à 3000 tours par minute pendant 3 min Enlever le surnageant, laissant 100-200 pi de liquide au fond, puis sur le tube pour déloger la pastille. Ajouter 1 ml de HBSS et remettre en suspension le culot avec trituration douce. Exploiter le tube est critique ici comme une simple remise en suspension le culot avec beaucoup de lyser les cellules de la rétine. Cela est particulièrement vrai avec les adultes rétines de souris.
5. Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 min Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension dans 450 ul de PBS contenantBSA ment 0,1%. Il est important d'enlever autant de surnageant que possible afin de minimiser la présence d'ARNm de cellules lysées et les produits de la dissociation qui pourraient inhiber les réactions futures.

2. La récolte des cellules individuelles

1. Préparer deux boîtes de 6 cm contenant 5 ml de PBS additionné de 0,1% de BSA. Plate les cellules dissociées sur une seule antenne et permettent aux cellules de se contenter d'au moins 5 min. La densité cellulaire utilisé dépend fortement de la nature des cellules individuelles étant profilées. Par exemple, pour les cellules très rares marqués avec un marqueur fluorescent une telle GFP, entières rétines dissociées sont étalées sur un plat unique de 6 cm. Pour les cellules qui sont un peu plus abondante, moins de cellules sont initialement ensemencées pour le rendre plus facile à récolter un (ou très proche de un) de cellules à la micropipette en premier.
2. Placer la plaque de cellules dissociées sur un microscope inversé. Nous utilisons le modèle IMT-2 de l'Olympe. Utilisation de micropipettes qui ont été tirées à une fine pointe (diamètre intérieur de 0,5 mm, diamètre extérieur 1,04 mm) (figure 2) et avec un tube d'aspiration, la récolte d'une seule cellule. Les cellules facilement pénétrer dans la micropipette lorsqu'il est placé à proximité de leur sur le plat. Il est essentiel que le tube d'aspiration n'est ni trop long ni trop court pour la distance à l'étape associée avec le microscope inversé (Les tubes de prélèvement que nous utilisons avec notre microscope inversé sont 38,1 cm de long). Si le tube est trop long, les cellules ne peuvent être expulsés de manière efficace à partir de la micropipette dans le tube de collecte. La raison principale que nous utilisons plus l'IMT-2 modèle microscope inversé, c'est que nous avons trouvé qu'il a la distance idéale à la scène pour nos tubes d'assemblage d'aspiration. Après être entré dans la micropipette, la cellule (ou des cellules) est expulsé vers une seconde plaque (plaque de lavage) de sorte que un et un seul est récoltée pour profil d'expression génique. Sur la seconde plaque, il est souvent nécessaire pour éliminer les cellules superflues, soit avec une micropipette nouvelleou déplacer la cellule d'intérêt à un emplacement différent pour veiller à ce que d'une unique cellule entre dans la micropipette.
3. Lorsque une cellule individuelle est complètement isolé des cellules voisines, utiliser une micropipette nouvelle pour aspirer la cellule d'intérêt que dans la section 2.2 et l'expulsent ensuite directement dans un tube de 0,2 ml PCR contenant 4,5 pi de tampon de lyse cellulaire. La cellule est expulsé sur le côté du tube, en faisant attention de ne pas rompre la pointe de la micropipette dans le tube. Les échantillons peuvent être filée brièvement dans une microcentrifugeuse de paillasse pour plonger la cellule dans un tampon de lyse. Cette filage se fait généralement après chaque cellule 5 et ensuite à nouveau à la fin de collection.Tubes contenant des cellules individuelles dans un tampon de lyse doit être maintenu dans la glace pendant la durée de l'isolement seule cellule. Pour des résultats optimaux, les cellules sont collectées dans une fenêtre de deux heures l'après-dissociation. Passé ce délai s'est écoulé, il est préférable de procéder à l'étape de transcription inverse puisque le temps supplémentaire a été observed pour augmenter les chances de la dégradation de l'ARN.

3. Transcription inverse

1. Brièvement tourner les échantillons dans une surface de travail pour assurer minicentrifuge tous les cellules individuelles sont immergés dans le tampon de lyse cellulaire. Afin de promouvoir la lyse des cellules, incuber l'échantillon à 70 ° C pendant 90 sec. dans un thermocycleur. Placer immédiatement les tubes de retour sur la glace.
2. Laisser reposer les tubes sur la glace pendant 2 min. Pour tous les ajouts de réactifs, utiliser le filtre à pointe des pointes de pipette pour éviter la contamination. Pour effectuer la transcription inverse, ajouter 0,33 ul Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl inhibiteur de RNase (40 U / pl), et 0,07 ul gène 32 de T4 des protéines. Incuber le mélange réactionnel pendant 50 min à 50 ° C dans un thermocycleur. Inactiver l'enzyme à 70 ° C pendant 15 min et le lieu sur la glace.
3. Pour enlever l'apprêt libre, ajouter 0,1 Tampon Exonuclease ul (10X), 0,8 pi dH ₂ 0 (qualité biologie moléculaire), et 0,1 ul exonucléase I (20 U / pl). Incuber à 37 ° C pendant 30 min dansun thermocycleur. Inactiver l'enzyme par incubation de la réaction à 80 ° C pendant 25 min, puis placer les tubes sur de la glace.

4. Tailing et des cellules individuelles PCR

1. Ajouter 6 pi du mélange réactionnel de résidus et d'utiliser un thermocycleur à incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 20 min, 70 ° C pendant 10 min, et le maintenir à 4 ° C
2. Ajouter 10 ml de l'échantillon à queue au mélange réactionnel de PCR et d'effectuer la synthèse du second brin et l'amplification PCR en utilisant les conditions suivantes:
   1. 95 ° C pendant 2 min
   2. 37 ° C pendant 5 min
   3. 72 ° C pendant 16 min
   4. 93 ° C pendant 40 secondes
   5. 67 ° C pendant 1 min
   6. 72 ° C pendant 6 minutes, en ajoutant 6 secondes par cycle
   7. Passez à l'étape 4 34 fois
   8. 72 ° C pendant 10 min
   9. Maintenir à 4 ° C

5. Étiquetage pour les puces Affymetrix

1. Étiquette 10-20 g d'ADNc (la concentration de l'ADNc amplifié résultatING à partir d'une seule cellule est généralement ~ 1 ug / ul) pour obtenir une hybridation sur puces Affymetrix robuste. Tout d'abord, un fragment de l'ADNc en ajoutant 10-20 ul de l'ADNc à cellule unique à 8 1X ul-One Phor-All tampon et 1 ul de dilution (1:10 dans 1X One-Phor-All tampon) DNaseI dans un 80 pi réactionnel. Incuber dans un thermocycleur pendant 13 min à 37 ° C. Désactiver la DNase I pendant 15 min à 100 ° C et le lieu sur la glace.
2. Ajouter 20 ul de tampon TdT 5X, 2,5 pi biotine N6-ddATP (Enzo Biosciences), et 1 ul TdT (dilué 1:8 dans un tampon TdT).
3. Incuber pendant 90 min à 37 ° C, puis 5 min à 65 ° C. Conserver à -20 ° C ou s'hybrider immédiatement à une puce à ADN Affymetrix. L'hybridation est réalisée en utilisant des protocoles standard d'Affymetrix.

6. Les résultats représentatifs

Pour évaluer la qualité de l'ADNc, pl 10 de l'échantillon d'ADNc a été chargé sur un gel d'agarose 1%. L'ADNc est principalement jugé par la gamme de taille (500-2000 pb)et l'intensité de l'étalement d'ADNc (Figure 1 et Figure 3a). Dans le gel décrite sur la figure 1, chaque voie de l'autre représente un frottis ADNc à partir de cellules rétiniennes isolée E16.5. Les voies entre montrent les frottis résultant lorsque les médias seulement est aspiré dans l'aiguille et déposés dans le tube de PCR. Ces voies ne sont jamais complètement dépourvue d'un frottis faible, mais ils ne montrent pas de résultats lors de gènes spécifiques des amorces de PCR sont utilisés pour amplifier les gènes de leur part. En outre, l'intensité de l'étalement d'ADNc peut varier quelque peu (comparer la figure 1 et figure 3a). Dans la figure 3A voies a, f, g, h et contiennent robustes frottis d'ADNc alors voies b, c, d et e sont considérablement moins robuste.

Spécifique du gène PCR est utilisé comme un écran secondaire de la qualité de l'ADNc à partir d'une seule cellule. Les ADNc de la figure 3 ont été isolés à partir fluorescentes cellules ganglionnaires de la rétine et ils étaient tested en utilisant des amorces de PCR pour la rétine marqueurs des cellules ganglionnaires Brn3b et Pax6. Pour cet essai, 1 pl de l'ADNc a été soumis à une PCR pendant 30 cycles. Real-PCR quantitative en temps serait un test de préférence, mais il peut être prohibitif et n'est pas nécessaire pour la simple évaluation de la qualité d'ADNc. Tous les 8 des cellules individuelles ont été testés positifs pour Brn3b et 6 à 8 pour Pax6 (Figure 3b). Même les frottis d'ADNc qui ont été moins robustes bandes produites pour Brn3b et Pax6. En dépit de ces résultats de la PCR, il est de notre expérience que les frottis d'ADNc tels que ceux dans les couloirs b, c, d et e ne donnent pas hybridations robustes sur Affymetrix et sont généralement évités. Gene PCR spécifique pour la Crx photorécepteur marqueur a été utilisé pour déterminer le niveau de contamination dans les ADNc seule cellule (figure 3b). Un marqueur photorécepteur a été choisi parce que ces cellules constituent la majorité de la rétine (~ 70%) et, par conséquent, toute la lyse des cellules qui ont eu lieu très probablement impliquer tige photoreceptors. Il y avait seulement une quantité faible de l'actuelle Crx dans ces préparations d'ADNc, même après 30 cycles de PCR. Enfin, cet écran reposant sur la PCR peut être utilisée pour commencer à déterminer les sous-ensembles d'un type cellulaire particulier les ADNc ont été dérivés à partir avant de les soumettre à un profilage microréseau intégral. Cela peut aider à prioriser les cellules qui sont profilées, car c'est l'étape la plus coûteuse dans le processus. Par exemple, nous avons identifié des sous-ensembles de cellules ganglionnaires de la rétine par eux le dépistage de la présence du gène Tachykinin1 (Figure 3b).

De la petite à base de PCR écran, notamment des cellules simples sont choisis et leurs ADNc hybridé à un microréseau Affymetrix. Les données microarray est comparé et les modèles peuvent être découverts en utilisant des algorithmes de clustering standards. Heatmaps, comme dans la figure 4, sont générées pour représenter graphiquement les données. Il ya deux principales conclusions concernant les données de profilage simples cellules de la figure4. Tout d'abord, les gènes exprimés dans des types cellulaires spécifiques se trouvent presque exclusivement dans ces types cellulaires après le protocole de cellule unique est effectué. Dans la plupart des cas où les gènes marqueurs d'un type de cellule se trouvent également dans un second type de cellules, telles que l'observation que les cellules bipolaires exprimer certains gènes «bâtonnet» à des niveaux inférieurs, cette expression dans le second type de cellules est facilement confirmé par soit in situ hybridation ou marquage par anticorps. Deuxièmement, au sein de la amacrines plus diversifiée et profils des cellules ganglionnaires, l'hétérogénéité de l'expression génique est immédiatement apparent. Pou4f1 est exprimé uniquement dans environ 1/4 des cellules ganglionnaires en développement, tout en NR4A2 et Scube2 sont deux exemples de gènes exprimés dans différents hétérogène des cellules amacrines. En fait, les gènes indiqués dans le heatmap sont juste un petit échantillon que plusieurs centaines de gènes ont été identifiés et confirmés en tant que marqueurs de cellules ganglionnaires en développement ou en tant que marqueurs de différentes populations de cellules amacrines ^2,4.

Un nombre sans cesse croissant d'études révèlent robustes cellule à cellule variabilité des populations que l'on croyait à être plus homogènes en ce qui concerne leur expression génique ^6,8. Dans un cas au moins, cette expression du gène du «bruit» a été montré à jouer un rôle important biologique ^13. Différences d'expression des gènes entre les cellules individuelles sont obscurcies à l'aide de tissus traditionnels ensemble des méthodes. Ces expériences de générer le profil d'expression d'une «moyenne» de cellules, qui peuvent ne pas être représentatif ^14. Nous présentons ici une méthode pour l'isolement et l'identification des profils d'expression génique de simples cellules de la rétine. L'étude des cellules individuelles permet aux chercheurs de sonder l'hétérogénéité cellulaire qui sous-tend les tissus complexes, ce qui est essentiel pour déterminer un modèle distinctif de l'expression des gènes de différents types cellulaires. En outre, une seule cellule d'isolement peut donner un aperçu des programmes de gènes de conduire l'activité de indivcellules idual en points dans le temps long du développement. Bien que particulièrement utile dans l'étude du système nerveux, où le fonctionnement de réseaux complexes cellulaires peut dépendre de l'expression du gène unique de types de cellules rares, ce protocole peut être adapté à isoler des cellules individuelles à partir de tissus différents.

Dans la rétine précoce en développement murin, les cellules ganglionnaires, les cellules horizontales, des cellules photoréceptrices à cônes et les cellules amacrines sont tous générés dans une fenêtre de temps qui se chevauchent ^15. En outre, chaque cellule qui a quitté le cycle cellulaire est à un stade différent de maturation et de ce fait ne fait qu'ajouter à la complexité de la rétine en développement. Enfin, pour certains types de neurones de la rétine, il existe de nombreuses morphologies différentes (jusqu'à ~ 30 dans le cas des cellules amacrines) dans la rétine maturité ^16. Depuis la rétine est un mélange de types de cellules, puces à ADN et l'analyse en série de l'expression génique (SAGE) des études basées sur ^17-19 qui s'appuie sur la homogenization de la rétine entière sont incapables de découvrir des gènes marqueurs exprimés dans les sous-types rares et n'arrivent pas à résoudre les différences d'expression génique dynamiques entre les différents types de cellules, en particulier au cours du développement. Pour commencer à comprendre la complexité des différents types de cellules à la fois dans la rétine adulte et au cours du développement de la rétine, les profils d'expression génique de cellules simples de ~ 200 cellules individuelles de nombreux points dans le temps différents ont été analysés ^2-5,8. Les données qui en résultent a fourni une foule de nouveaux marqueurs pour les types cellulaires individuels et a fourni une fenêtre sur les transitions importantes dans le temps de développement qui étaient auparavant méconnus.

Les profils d'expression de cellules simples ont révélé une hétérogénéité considérable dans l'expression des gènes dans les cellules amacrines ^4, où il a été prévu, et dans les cellules gliales de Müller, où il était de ⁵ inattendu. Alors que l'examen des données simples cellules amacrines révélé que plus de 450 gènes qui ont été exprimées dans amacrinescellules et exclu des autres types de cellules rétiniennes, aucun de ces gènes étaient exprimés dans toutes les cellules amacrines ^4. Ces résultats les plus susceptibles proviennent du fait que la classe de cellules amacrines est très diversifiée et de l'hétérogénéité sous-jacente est un reflet des fonctions distinctes de ces cellules. Ces résultats n'auraient pas été possible en utilisant l'ensemble des tissus des approches fondées sur. Enfin, le vélo cellules progénitrices rétiniennes (RPC) affiché le plus haut degré d'hétérogénéité dans l'expression du gène de l'un des types de cellules rétiniennes profilés ^8. Les facteurs de transcription ont été la classe de gènes avec le plus haut degré d'hétérogénéité entre les cellules progénitrices, suggérant que dynamiques profils d'expression génique pourrait jouer un rôle majeur dans le développement des différents types de cellules rétiniennes ^8. Encore une fois, ces résultats n'auraient pas été possibles sans l'utilisation de la technique de profilage génique des cellules seule expression.

Les études de la transcriptome des cellulespeuvent également être utilisées pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie. Dans de nombreuses maladies neurodégénératives, y compris les maladies de dégénérescence rétinienne, certains neurones meurent, tandis que les neurones voisins survivre ^20. Comprendre pourquoi certaines cellules en apoptose nécessite l'identification des gènes ou des programmes de gènes qui sont altérés dans des cellules individuelles dans ces modèles de maladie. Whole-tissus modèles seront à nouveau risque d'obscurcir les changements survenus depuis les cellules ne meurent pas souvent dans le même temps et, par conséquent, à un moment donné le tissu est un mélange de mourir et de cellules survivantes. En outre, pour de nombreux cancers de la cellule d'origine est une question ouverte. Ceci est particulièrement le cas avec le rétinoblastome tumeur enfance oeil. Récemment en utilisant le protocole profilage seule cellule détaillé ici, il a été montré que les cellules individuelles de rétinoblastomes possèdent des programmes d'expression génique de plusieurs types cellulaires ^21. Il semble que ces cellules sont des hybrides de cellules progénitrices non différenciées et les neurones ²1. Ces expériences nécessaires à une analyse au niveau individuel des cellules et n'aurait pas été possible avec les approches des tissus entiers.

Des approches alternatives

Amplification linéaire est une alternative au protocole d'amplification basée sur la PCR en détail ici. Bien que basée sur la PCR d'amplification est estimé à entraîner une distorsion des relations d'abondance, l'amplification linéaire est pensé pour maintenir ces relations ^22. La technique d'amplification linéaire a été utilisé pour profiler plusieurs types de neurones ^23. Cependant, les comparaisons directes entre les deux méthodes ont indiqué que la technique d'amplification linéaire peut être associé à un taux élevé de faux négatifs ^24,25. Nous sommes favorables à la méthode basée sur la PCR en détail dans ce rapport pour deux raisons. Tout d'abord, dans nos expériences, nous nous concentrons sur les gènes avec des différences d'expression entre les cellules robustes. Deuxièmement, nous avons trouvé une très bonne corrélation entre notre cellule unique puce prodépôt des expériences et des études d'hybridation in situ pour les mêmes gènes. En fait, à ce jour, nous avons effectué des hybridations in situ pour des centaines de gènes et ont observé au moins 75% correspondent au modèle prédit à partir des puces à ADN. Ceci est probablement une estimation prudente, puisque la raison la plus commune pour un écart est un manque de signal de la sonde dans situ.