Dyrkning af humane neurale stamceller i en 3-dimensionel selvsamlende peptid Hydrogel

1. Del 1: Culture of hNPCs i PuraMatrix

1. På forhånd at dannelsen af ​​et stillads med en PuraMatrix koncentration på 0,25% uden laminin man nødt til at forberede følgende løsninger
2. Forbered en opløsning indeholdende 20% saccharose og en opløsning indeholdende 10% saccharose opløst i sterilt destilleret vand.
3. For løsning 1 mix 120 μl af de 20% rørsukkeropløsning med 120 μl destilleret vand i et 1,5 ml konisk rør.
4. For Løsning 2 mix 60 μl af PuraMatrix løsning med 60 μl 20% saccharose opløsning i en 1,5 ml konisk rør.

For et præparat af et stillads med en PuraMatrix koncentration på 0,25%, suppleret med laminin (8 mg per 100 μl Matrix) er man nødt til at forberede følgende løsninger.

1. For løsning 1 mix 72 μl destilleret vand med 120 μl på 20% rørsukkeropløsning og 48 μl laminin i en 1,5 ml konisk rør.
2. For Løsning 2 mix 60 μl PuraMatrix løsning med 60 μl af de 20% rørsukkeropløsning i en 1,5 ml konisk rør.

5. Til indlejring af celler i PuraMatrix udarbejde en 4-vel cellekultur tallerken og placere et steriliseret glas dække slip (diameter 13 mm) i to brønde. Store pladen i det rene bænk for senere brug. Glasafdækning smutter kun bruges til immuncytokemiske studier. Hvis der ikke immuncytokemiske farvninger er beregnet til, kan de trin springes over.

For at forberede hNPCs til indkapsling i 3D stilladser man nødt til at forberede følgende løsninger. Fortynde benzonase i trypsin / EDTA-løsning ved hjælp af en fortyndingsfaktor på 1:10.000. For en Trypsin-Inhibitor/Benzonase løsning mix: DMEM/F12 + benzonase 25U/μl + 1% HSA + trypsin-inhibitor (0.5mg/ml).

6. Frigør de celler, ved at tilsætte 500 μl trypsin / benzonase løsning og inkuber i 5 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎. Stop reaktion med Trypsin-Inhibitor/Benzonase løsning. Efterfølgende centrifuger løsrevne celler i 5 minutter ved 3000 x g. Vask cellerne med 5 ml 10% rørsukkeropløsning og centrifuger igen. Supernatanten fjernes.
7. Cellerne i 10% saccharose løsning, bør den endelige cellen løsningen indeholde 1x10 ⁶ celler / ml.

De næste trin, fra 1,8 til 1,11, bør ske så hurtigt som muligt, på grund af den lave pH PuraMatrix løsning, som kan være skadelige for cellerne.

8. Bland 60 μl af cellesuspensionen med løsning 1.
9. Tilsæt 120 μl af opløsningen 1, der indeholder celler, at de koniske rør med løsning 2 og blandes omhyggeligt.
10. Placere 100 μl af blandingen umiddelbart på hver dækker glider opholdt sig i 4-brønds plade.
11. Tilsæt langsomt 200 μl cellekulturmedium per godt, og efter 2-3 minutter yderligere 200 μl. Dette vil indlede selvsamling af matricen.
12. Inkuber calen på 37 ° C, for 1h i det rene bænk på en varmeplade eller det opvarmede område af dit rene bænk. Så vidt muligt ikke bevæger pladen, da dette kan skade samling af matricer.
13. Fjern det meste af mediet, men ikke alle, for at undgå de matricer falde tørt, med en 1000 μl pipette. Tilsæt 500 μl af middel til at vaske matricer i 10 min. Endelig fjernes medium og tilsæt 500 μl frisk substrat og placere agarplade i en inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Da matricer er følsomme over for stød pladerne skal flyttes som mindre som muligt og opbevares, hvis det er muligt, i en separat kuvøse.
14. Den her anvendte hNPCs blev skudt i 7 dage i 3D-scaffolds og differentiering blev indledt af tilbagetrækningen af de vækstfaktorer ^13. Medium blev skiftes hver 2-3 dage.

2. Del 2: immuncytokemiske farvning af hele matricer

1. På forhånd farvningsproceduren man nødt til at forberede: ABlåsning bufferopløsning bestående af 5% normale ged serum og 0,3% af Triton X-100 opløst i PBS, 4% paraformaldehyd løsning baseret på 0,1 M PBS, og om nødvendigt en løsning med 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) for et kerner farvning indeholdende 100 ng DAPI / ml opløst i PBS. Prøverne blev monteret med en blanding af Mowiol og DABCO.
2. At vaske matricer fjerne mediet med en 1000 μl pipette og vaske stilladser med PBS en gang i 5 minutter.
3. Du kan løse stilladser fjerne PBS og tilsættes 400 μl af paraformaldehyd (4% i 0,1 M PBS) til hver brønd og inkuber matricerne i 30 minutter ved stuetemperatur. Fast Stilladser kan gemmes i PBS suppleret med 0,02% NaN ₃ ved 4 ° C i flere uger op til flere mÃ¥neder.
4. Forud for en farvning vaske stilladser med PBS i 5 minutter.
5. Inkubér stilladser i blokerende buffer løsning. Blokering Løsningen blev ændret tre gange hver 2-3 time og subsequstændigt stilladser blev inkuberet i blokerende opløsning natten over ved 4 ° C.
6. Fjern blokeringen bufferopløsning og tilføje det primære antistof opløst i PBS suppleret med 1% normal ged serum og inkuber matricerne natten over ved 4 ° C.
7. Fjern det primære antistof løsningen og vask stilladser 4 gange i 2 timer og efterfølgende natten over ved 4 ° C med PBS.
8. Fjern PBS og tilsæt løsning med det sekundære antistof, opløst i PBS suppleret med 1% normal ged serum, i 4 timer ved stuetemperatur i mørke.
9. Vask prøver med PBS 4-6 gange i 1 time og efterfølgende natten over ved 4 ° C i mørke.
10. For en kerner farvning man kan tilsættes 400 μl af DAPI løsning til 30 min.
11. Sådan monterer du prøver man skal objektglas. Tilsæt 50 μl Mowiol / Dabco på objektglas. Fjern dækslet glider fra den 4-brønds plade og læg dem forsigtigt på Mounting Medium.
12. Her har vi brugt en Biozero 8000mikroskop (KEYENCE, Tyskland, Karlsruhe) for at få en enkelt micrographs og z-stakke. Hver stakken indeholder 30 enkelt billeder med en afstand på 1-2 μm. Brug det tilsvarende analysator software sløring uløseligt forbundet med fluorescens blev fjernet, før fuld fremskrivninger af den producerede z-stakke var.

3. Del 3: Frigivelse af hNPCs fra stilladser for flowcytometri analyse

1. På forhånd til frigivelsen af ​​celler fra stilladser vaske stilladser med 500 μl HBSS.
2. Overfør stilladser ved hjælp af en 1000 μl pipette til en 15 ml koniske rør, der indeholder cellekulturmedium.
3. At forstyrre stilladser mekanisk resuspender cellen løsningen flere gange med en 1000 μl pipette og efterfølgende centrifuger løsning ved 3000 xg i 5 min.
4. Fjern supernatanten med en pipette, Tilsæt 500 μl af trypsin / benzonase løsning og resuspender cellepelleten flere gange.
5. Inkuber cellerne for 5 minved 37 ° C i trypsin / benzonase løsning. For at stoppe reaktionen tilsættes 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase opløsning og pipette op og ned flere gange.
6. Centrifuger cellesuspensionen 5 min ved 3000 xg, fjern supernatanten og vaske celler med 2 ml HBSS buffer. Gentag dette trin to gange. Denne procedure vil fjerne matrix vragrester.
7. Pass cellesuspensionen løsning trug en celle si (porestørrelse 70 μm) til at fjerne aggregater og indsamle de celler i cellekulturmedium. De opnåede celler kan være seedet igen f.eks dækning slipper for funktionelle undersøgelser som patch clamp eller fluometric målinger. At behandle celler til flowcytometri, fastsætte de celler det samme (se 4.1).

4. Del 4: Kvantificering af βIII-tubulin positive celler ved flowcytometri

1. Fix den frigivne celler udtaget i takt 3,7 med 1% PFA i 15 min ved stuetemperatur.
2. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 3000 xg og løsnee supernatanten. Hvis det er nødvendigt, kan cellerne være parat til at blive opbevaret ved 4 ° C til senere analyse. Derfor resuspender celler i vaskebuffer (PBS suppleret med 0,5% BSA og 0,02% Na-azid).
3. At fortsætte med forberedelserne til flowcytometri, centrifugeres cellesuspensionen i 10 min ved 350 xg, Supernatanten fjernes, og cellerne i 25 μl af antistoffet løsning. Derfor er det første antistof er blandet med saponin buffer i en koncentration 1:100 f.eks βIII-tubulin. Den saponin buffer består af PBS med et saponin koncentration på 0,5%, en BSA koncentration på 0,5% og en Na-azid koncentration på 0,02%.
4. Inkubér cellesuspensionen med den første antistof i 2 timer ved stuetemperatur på rystebord. Som negativ kontrol forberede en prøve, uden at den første antistof.
5. For det første vasketrin Tilsæt 300 μl saponin buffer direkte til cellerne. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 350 x g. For det andet vasketrin, kasseressupernatanten, Tilsæt 300 μl buffer og centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 350 x g.
6. Fjern supernatanten og tilsættes 25 μl opløsning, som indeholder det sekundære antistof (f.eks Alexa Fluor 647, 1:1000, opløst i saponin buffer). Inkuber celler med det sekundære antistof 1 time ved stuetemperatur, i mørke.
7. For det første vasketrin Tilsæt 300 μl saponin buffer direkte til cellerne. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 350 x g. For det andet vasketrin, Supernatanten fjernes, Tilsæt 300 μl buffer og centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 350 x g.
8. Supernatanten fjernes, og cellerne i 500 μl vaskebuffer til flowcytometri analyse.

5. Repræsentative resultater

Et eksempel pÃ¥ hNPCs kulturperler i selvsamlende hydrogel stillads PuraMatrix er vist i figur 1. Den hNPCs vokser i sfærisk lignende strukturer i uændret PM. I denne kultur tilstands, celler kan næppe blive anerkendt i en transmission lys, selv om bundter af processer mellem de sfærer er synlige (fig. 1A). Afhængigt af dyrkningsbetingelser af de anvendte celletype, kan matricen ændres fx ved at tilføje laminin. For hNPC cellelinie ReNcell VM (Millipore) laminin er nødvendig for at fremkalde en vækst mønster med mindre tæt aggregater, men en mere homogen fordeling af celler (fig. 1B). Uafhængig af ændringer, kan matricen bruges til at studere f.eks neuronal differentiering. Figur 1C præsenterer en farvning af hNPCs for neuronal markør βIII-tubulin. I dette eksempel cellerne blev dyrket i 7 dage i matrixen og efterfølgende differentieret i 4 dage, hvor differentiering er fremkaldt ved tilbagekaldelsen af vækstfaktorer Globaliseringsfonden og bFGF. ¹³ Cell organer og et tæt net af processer er bygget op af celler kan anerkendt nemt. Men det er indlysende, at en kvantificering af celle nummer er tidskrævende, idet et stort antalbilleder af de forskellige regioner i matrix skal analyseres, for at opnÃ¥ en pÃ¥lidelig database for en statistisk analyse. I fig 1D kan man se et eksempel pÃ¥ celler frigøres fra matrix og efterfølgende flettede om dækning glider. Disse celler kan anvendes til funktionelle studier.

Frigivelsen af ​​cellerne fra 3D-stilladser giver mulighed for at analysere forskellige parametre som udtryk for markørproteiner eller overlevelse af celler ved AnnexinV / PI farvning eller en Tunel assay. Figur 2 viser et eksempel pÃ¥ en flowcytometri analyse af den procentdel af βIII-tubulin ⁺ celler. Den negative kontrol (celler, der ikke er markeret til βIII-tubulin) er vist i figur 2A. Disse knapper bruges til at bestemme porten til senere pÃ¥visning af βIII-tubulin ⁺ celler (fig. 2B). En sammenligning af en manuel optælling af celler og en analyse af flowcytometri er vist i figur 2C. Andelen af βIII-tubulin ⁺ celler blev determINED ved at tælle det samlede celle nummer (ved hjælp af et nukleart DAPI farvning) og antallet af βIII-tubulin ⁺ celler i fluorescens billeder.

Figur 1. hNPCs kulturperler i selvsamlende peptid hydrogel PuraMatrix. A) hNPCs indkapslet i PuraMatrix (PM) vokse i sfærisk, tæt pakket strukturer, hvor diameteren af kugler kan være op til flere hundrede μm. I mellem de områder, man kan genkende bundter af processer er bygget op af celler (pile). B) Celler indkapslet i PuraMatrix suppleret med laminin (PML) vokse i mindre tætte strukturer, mere homogent fordelt. I laminin suppleret matrix man kan genkende enkelte celler i mindre tætte områder (pile), er det dog næppe muligt at kvantificere antallet af celler. C) hNPCs differentieres for de 4 dage i PML udtrykke neuronal markør som βIII-tubulin (grøn). Til evalueringte den procentvise andel af positive celler, man har til at bestemme det samlede celle nummer af et kerner farvning som DAPI (blå). Den microphotograph præsenterer den fulde projektion af en z-stak af billeder taget med Biozero-8000 mikroskop. D) celler frigives fra matricen kan seedede på f.eks dækning slipper for videre funktionelle studier. Den microphotograph viser celler dyrkes for 3d, efterfølgende kan selve fremgangsmåden for løsladelse. Den farvning for βIII-tubulin (rød) afslører en sammenlignelig morfologi til cellerne vært i 3D stilladset.

Figur 2. Flowcytometri analyse celler frigives fra PuraMatrix. For at overvinde de tidskrævende kvantificering af microphotographs brugte vi en protokol til at frigive celler dyrket i PuraMatrix giver adgang til hurtigere analyse ved flowcytometri. A) Ufarvet celler blev brugt som negativ kontrol, for at indstille porten (sort ramme) for efterfølgende analyseaf fx βIII-tubulin celler. B) At kvantificere den andel af βIII-tubulin ⁺ celler den samme port, som ligger i den negative kontrol, blev brugt. Positive celler vises i højre del af x-aksen, hvor ogsÃ¥ et mellemliggende befolkning blev observeret (punkteret ramme), sandsynligvis repræsenterer cellefragment. C) En sammenligning af manuelle tælles celler og cellerne tælles ved flowcytometri afslørede en langt højere andel af positive celler, hvor tiden afhængighed af antallet af βIII-tubulin ⁺ var sammenlignelige, med angivelse af pÃ¥lideligheden af flowcytometri protokollen.

Brugen af 3D-scaffolds giver mulighed for at studere udviklingen af forskellige celletyper i en cellekultur situationen tættere på in vivo situationen. Men med hensyn til analysen af ​​f.eks neuronal differentiering eller funktionelle studier man har til at overvinde nogle forhindringer for at få pålidelige data for f.eks kvantificering af celletyper.

Her har vi beskrev kultur hNPCs i peptid hydrogel baseret stillads PuraMatrix og den efterfølgende frigivelse af celler, der skal bruges til undersøgelser i en 2D-situation, der giver en nem adgang til værktøjer som FACS eller funktionelle assays. Vi har for nylig vist, hvilken indflydelse de PuraMatrix koncentration om dannelsen af 3D-stilladset ved atomic force mikroskopi og indflydelse pÃ¥ overlevelse og differentiering af cellerne. ¹³ Men man mÃ¥ huske pÃ¥, at hver celle type kan have brug for anderledes kultur betingelser eller matricer, der bestÃ¥r af andre materialer, som f.eks matrigel eller collagen.

Protokollen at frigive cellerne er baseret pÃ¥ en protokol, som fabrikanten har ¹⁸ og kan sammenlignes med protokoller, der bruges til at forberede f.eks primære neuronale kulturer, hvor en mekanisk isolation af cellerne er efterfulgt af en nedbrydning af omgivende materiale ved hjælp af enzymer. Cellerne tolerere denne procedure, og forblive vital og opbygget processer og udtrykke neuronale markør som βIII-tubulin, nÃ¥r de er seedede igen pÃ¥ en laminin overflade. Her har vi udført flowcytometri studier med frigivet celler til at kvantificere mængden af βIII-tubulin ⁺ celler. Sammenligningen med en kvantificering gjort "manuelt" ved at tælle celler i micrographs afslørede en langt højere andel af βIII-tubulin ⁺ celler. Dette er mest sandsynligt pÃ¥ grund af det højere antal celler tælles ved flowcytometeret (50.000 pr sonde) i forhold til den manuelle analyse (flere hundrede per sonde). Men kinetik af antallet af & bETA, III-tubulin ⁺ celler følger det samme mønster i begge prøver, hvor vi registrerer et fald pÃ¥ βIII-tubulin ⁺ celler over tid. Dette er i overensstemmelse med studier ved hjælp af ReNcell VM cellerne. ^15-17 Andre hindringer, som skal overvindes i løbet af en manuel analyse er meget tætte omrÃ¥der af matricer, der kan næppe blive analyseret eller høj baggrund af den matrix materiale, hvilket resulterer i en undervurdering af de "rigtige" celle nummer. Vi er overbeviste om, at denne protokol kan tilpasses til andre celletyper giver en hurtig og pÃ¥lidelig metode til at kvantificere flere aspekter af proliferation, differentiering eller overlevelsen af ​​cellerne.