La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

1. Partie 1: Culture de hNPCs dans PuraMatrix

1. À l'avance pour la génération d'un échafaudage avec une concentration de 0,25% PuraMatrix sans laminine on a besoin pour préparer les solutions suivantes
2. Préparer une solution contenant du saccharose à 20% et une solution contenant 10% de saccharose dissous dans de l'eau distillée stérile.
3. Pour la solution 1 mix 120 pl de la solution de saccharose à 20% avec 120 pi d'eau distillée dans un tube de 1,5 ml conique.
4. Pour la solution 2 mix 60 pl de la solution avec 60 ul PuraMatrix de solution de saccharose à 20% dans un tube de 1,5 ml conique.

Pour une préparation d'un échafaud avec une concentration de 0,25% PuraMatrix complétée par la laminine (8 pg pour 100 Matrice ul) on a besoin pour préparer les solutions suivantes.

1. Pour la solution 1 mix 72 ul d'eau distillée avec 120 pi de solution de saccharose à 20% et 48 ul laminine dans un tube de 1,5 ml conique.
2. Pour la solution 2 mélanger 60 solution PuraMatrix ul avec 60 ul de la solution de saccharose à 20% dans un tube de 1,5 ml conique.

5. Pour l'ancrage des cellules dans le PuraMatrix préparer une plaque de 4 puits de culture cellulaire et le lieu un glissement de verre stérilisés couvercle (diamètre 13 mm) dans deux puits. Magasin de la plaque dans le banc de nettoyage pour les utiliser plus tard. Lamelles de verre sont utilisés uniquement pour les études immunocytochimiques. Si aucune des colorations immunocytochimiques sont destinés, l'étape peut être sautée.

Pour préparer le hNPCs pour l'encapsulation dans une échafaudages 3D doit préparer les solutions suivantes. Diluer le Benzonase dans la solution de trypsine / EDTA, en utilisant un facteur de dilution de 1:10.000. Pour un mélange solution Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + trypsine-inhibiteur (0.5mg/ml).

6. Détacher les cellules en ajoutant 500 ul de trypsine / Benzonase solution et incuber pendant 5 min dans un incubateur (37 ° C CO, 5% ₂₎. Arrêter la réaction avec une solution Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Par la suite centrifuger les cellules détachées pendant 5 min à 3000 x g. Laver les cellules avec 5 ml de solution de saccharose à 10% et centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant.
7. Resuspendre les cellules dans une solution de saccharose à 10%, la solution finale des cellules doit contenir 1x10 ⁶ cellules / ml.

Les prochaines étapes, 01/08 à 01/11, devrait être fait aussi vite que possible, en raison de la faible pH de la solution PuraMatrix, ce qui pourrait être nocif pour les cellules.

8. Mélanger 60 pi de suspension cellulaire avec la solution 1.
9. Ajouter 120 ul de la solution 1, contenant les cellules, le tube conique avec la solution 2 et mélanger soigneusement.
10. Placer 100 ul du mélange immédiatement sur chaque couvercle glisse résidé dans la plaque 4-même.
11. Ajouter lentement 200 pl de milieu de culture cellulaire par puits et après 2-3 minutes, un autre ul 200. Ceci lancera l'auto-assemblage de la matrice.
12. Incuber caunes à 37 ° C, pour 1h dans le banc de nettoyage sur une plaque chauffante ou dans la zone chauffée de votre banc propre. Autant que possible, ne pas déplacer la plaque car cela pourrait nuire à l'assemblage des matrices.
13. Retirer la plupart des moyennes, mais pas tous, pour éviter les matrices tomber à sec, avec une pipette 1000 pi. Ajouter 500 pi de milieu pour laver les matrices pendant 10 min. Enfin éliminer le milieu et ajouter 500 pl de milieu frais et placer la plaque de culture dans un incubateur (37 ° C CO, 5% _2). Comme les matrices sont sensibles aux chocs des plaques doivent être déplacés le moins possible et stockés, si possible, dans un incubateur séparés.
14. Le hNPCs utilisé ici ont été multipliées pendant 7 jours dans les échafaudages 3D et de la différenciation a été initié par le retrait des ¹³ facteurs de croissance. Milieu a été changé tous les 2-3 jours.

2. Partie 2: coloration immunocytochimique des matrices entière

1. En avance à la procédure de coloration on a besoin de se préparer: à partir desolution tampon de blocage composée de sérum de chèvre normal de 5% et 0,3% de Triton X-100 (dissous dans du PBS, une solution de paraformaldéhyde à 4% sur la base PBS 0,1 M, et si besoin d'une solution avec 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid DAPI) pour une coloration des noyaux contenant 100 ng DAPI / ml dissous dans du PBS. Les échantillons ont été montés avec un mélange de Mowiol et DABCO.
2. Pour laver les matrices éliminer le milieu de 1000 avec une pipette ul et laver les échafaudages fois avec du PBS pendant 5 minutes.
3. Pour fixer les échafaudages enlever le PBS et ajouter 400 l de paraformaldéhyde (4% en PBS 0,1 M) dans chaque puits et incuber les matrices pendant 30 minutes à température ambiante. Échafaudages fixes peuvent être stockées dans du PBS additionné de 0,02% NaN ₃ à 4 ° C pendant plusieurs semaines à plusieurs mois.
4. En avance d'une coloration laver les échafaudages avec du PBS pendant 5 minutes.
5. Incuber les échafaudages dans le blocage de la solution tampon. Solution de blocage a été changé trois fois toutes les 2-3 heures et subsequently échafaudages ont été incubés dans une solution de blocage pendant la nuit à 4 ° C.
6. Retirer la solution tampon de blocage et d'ajouter l'anticorps primaire dissous dans du PBS additionné de sérum de chèvre normal de 1% et incuber les matrices pendant la nuit à 4 ° C.
7. Retirer la solution d'anticorps primaire et laver échafaudages 4 fois pendant 2 h et ensuite pendant la nuit à 4 ° C avec du PBS.
8. Retirez le PBS et ajouter la solution avec l'anticorps secondaire, dissoute dans du PBS additionné de sérum de chèvre normal de 1%, pendant 4 h à température ambiante dans l'obscurité.
9. Lavez les échantillons avec du PBS 4-6 fois pendant 1 h et ensuite pendant la nuit à 4 ° C dans l'obscurité.
10. Pour une coloration des noyaux, on peut ajouter 400 ul de la solution de DAPI pendant 30 min.
11. Pour monter les échantillons on a besoin des lames de microscope. Ajouter 50 ul Mowiol / Dabco sur les lames de microscope. Retirer les lamelles de la plaque de 4 puits et mettez-les soigneusement sur le support de montage.
12. Ici nous avons utilisé un 8000 Biozeromicroscope (Keyence, Allemagne, Karlsruhe) pour obtenir micrographies unique et z-piles. Chaque pile contient 30 photos unique avec une distance de um 1-2. Utilisation du logiciel analyseur correspondant le flou inhérent à la fluorescence a été retiré avant les projections complet de la z-piles ont été produites.

3. Partie 3: Sortie de hNPCs des échafaudages pour l'analyse de cytométrie en flux

1. À l'avance pour la libération des cellules à partir d'échafaudages laver les échafaudages avec 500 ul de HBSS.
2. Transfert des échafaudages à l'aide d'une pipette 1000 pi à un tube de 15 ml conique contenant un milieu de culture cellulaire.
3. Pour perturber la mécanique échafaudages resuspendre la solution de cellules à plusieurs reprises avec une pipette et ensuite 1000 ul de la solution par centrifugation à 3000 xg pendant 5 min.
4. Enlever le surnageant avec une pipette, ajouter 500 ul de trypsine / Benzonase solution et remettre en suspension les moments culot cellulaire de plusieurs.
5. Incuber les cellules pendant 5 minà 37 ° C dans la solution de trypsine / Benzonase. Pour arrêter la réaction ajouter 1 ml solution Trypsin-inhibitor/Benzonase pipette et de haut en bas plusieurs fois.
6. Centrifuger la suspension cellulaire 5 min à 3000 xg, éliminer le surnageant et laver les cellules avec 2 ml de tampon HBSS. Répétez cette étape deux fois. Cette procédure va enlever les débris de la matrice.
7. Passez le creux solution de cellules en suspension de cellules d'une passoire (taille des pores 70 um) pour enlever les agrégats et de recueillir les cellules dans un milieu de culture cellulaire. Les cellules obtenues peuvent être semées à nouveau, par exemple sur des lamelles pour des études fonctionnelles en patch-clamp ou des mesures fluometric. Pour traiter les cellules pour la cytométrie de flux, fixer les cellules immédiatement (voir 4.1).

4. Partie 4: Quantification des βIII-tubuline des cellules positives par cytométrie en flux

1. Fixer les cellules libérées obtenu à l'étape 3.7 avec 1% PFA pendant 15 min à température ambiante.
2. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 3000 xg et Remove le surnageant. Si nécessaire, les cellules peuvent être préparés pour être conservés à 4 ° C pour analyse ultérieure. Par conséquent remettre les cellules dans un tampon de lavage (PBS additionné de 0,5% de BSA et 0,02% Na-azide).
3. Pour procéder à la préparation de la cytométrie en flux, centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 350 xg, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 25 pl de la solution d'anticorps. Par conséquent, le premier anticorps est mélangé avec le tampon de la saponine à une concentration de 1:100 par exemple βIII-tubuline. Le tampon de la saponine se compose de PBS avec une concentration de 0,5% saponine, une concentration de BSA de 0,5% et une concentration de Na-azide de 0,02%.
4. Incuber la suspension cellulaire avec le premier anticorps pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur. Comme un contrôle négatif de préparer un échantillon sans le premier anticorps.
5. Pour la première étape de lavage ajouter 300 ul de tampon saponine directement aux cellules. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. Pour le second lavage, jeterle surnageant, ajouter 300 pi de tampon et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g.
6. Enlever le surnageant et ajouter 25 ul solution contenant l'anticorps secondaire (par exemple Alexa Fluor 647, 1:1000, dissous dans du tampon saponine). Incuber les cellules avec l'anticorps secondaire 1h à température ambiante, dans l'obscurité.
7. Pour la première étape de lavage ajouter 300 ul de tampon saponine directement aux cellules. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. Pour le second lavage, éliminer le surnageant, ajouter 300 pi de tampon et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g.
8. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 ul de tampon de lavage pour l'analyse par cytométrie en flux.

5. Les résultats représentatifs

Un exemple de hNPCs cultivés dans l'auto-assemblage d'hydrogel échafaudage PuraMatrix est montré dans la figure 1. Le hNPCs croître dans des structures sphériques comme dans PM non modifié. Dans cette condition, la cultures, les cellules ne peuvent guère être reconnue dans une transmission de la lumière, bien que des faisceaux de processus entre les sphères sont visibles (figure 1A). Selon les conditions de culture du type cellulaire utilisé, la matrice peut être modifié par exemple en ajoutant la laminine. Pour la lignée cellulaire hNPC ReNcell VM (Millipore) laminine est nécessaire pour induire un modèle de croissance avec des granulats moins dense, mais une répartition plus homogène des cellules (fig 1b). Indépendante de modifications, la matrice peut être utilisée pour étudier par exemple la différenciation neuronale. Figure 1C présente une coloration de la hNPCs pour le marqueur neuronal βIII-tubuline. Dans cet exemple les cellules ont été cultivées pendant 7 jours dans la matrice et ensuite différenciés pour les 4 jours, où la différenciation a été induite par le retrait des facteurs de croissance EGF et l'bFGF. ¹³ corps cellulaire et un réseau dense de processus construits par les cellules peuvent être reconnus facilement. Cependant, il est évident que la quantification du nombre de cellules prend du temps, comme un grand nombre dedes photos de différentes régions de la matrice doit être analysé, afin d'obtenir une base de données fiables pour une analyse statistique. Dans la figure 1D, on peut voir un exemple de cellules libéré de la matrice et par la suite platted sur lamelles. Ces cellules pourraient être utilisées pour des études fonctionnelles.

La libération des cellules provenant de la échafaudages 3D offre la possibilité d'analyser les différents paramètres comme l'expression de protéines marqueurs ou des taux de survie des cellules par AnnexinV / PI coloration ou un essai TUNEL. La figure 2 montre un exemple d'une analyse de cytométrie en flux du pourcentage de cellules ⁺ βIII-tubuline. Le contrôle négatif (cellules non marquées pour βIII-tubuline) est montré dans la figure 2A. Ces commandes sont utilisées pour déterminer la grille pour la détection ultérieure de βIII-tubuline ⁺ cellules (figure 2B). Une comparaison d'un comptage manuel des cellules et une analyse par cytométrie en flux est montré dans la figure 2C. Le pourcentage de cellules ⁺ βIII-tubuline a été détermINED en comptant le nombre total de cellules (par le biais d'une coloration nucléaire au DAPI) et le nombre de cellules βIII-tubuline ⁺ dans les images de fluorescence.

Figure 1. hNPCs cultivées en PuraMatrix auto-assemblage de peptides hydrogel. Un hNPCs) encapsulé dans PuraMatrix (PM) poussent dans sphérique, dense structures emballés, où le diamètre de la sphère peut être jusqu'à plusieurs centaines de um. Entre les sphères, on peut reconnaître des paquets de processus construits par les cellules (flèches). B) les cellules encapsulées dans PuraMatrix complétée par la laminine (LEMP) poussent dans des structures moins denses, plus distribuée de façon homogène. Dans la laminine complété la matrice, on peut reconnaître des cellules individuelles dans les zones moins denses (flèches), cependant il n'est guère possible de quantifier le nombre de cellules. C) hNPCs différenciés pour les 4 jours de LEMP expresse marqueur neuronal, comme βIII-tubuline (vert). Pour évaluationte le pourcentage de cellules positives on doit déterminer le nombre total de cellules par une coloration des noyaux tels que le DAPI (bleu). La microphotographie présente la projection complète de a à z-stack des photos prises avec Biozero-8000 microscope. D) Les cellules libéré de la matrice peut être ensemencées sur des lamelles par exemple pour des études fonctionnelles. La microphotographie montre des cellules en culture pour la 3D, suite à la procédure de libération. La coloration pour βIII-tubuline (rouge) révèle une morphologie comparable aux cellules hébergés dans l'échafaud 3D.

Figure 2. Cellules d'analyse de cytométrie en flux libérés de PuraMatrix. Afin de surmonter la quantification du temps de microphotographies, nous avons utilisé un protocole visant à libérer des cellules cultivées dans PuraMatrix donnant accès à une analyse plus rapide par cytométrie en flux. Un cellules) non colorées ont été utilisées comme contrôle négatif, de mettre la porte (cadre noir) pour l'analyse par la suitedes ex-tubuline βIII cellules. B) Afin de quantifier le pourcentage de βIII-tubuline ⁺ cellules de la même porte, situé dans le contrôle négatif, a été utilisé. Cellules positives apparaissent dans la partie droite de l'axe des x, où a également une population intermédiaire a été observée (cadre pointillé), très probablement des débris de cellules représentant. C) La comparaison des manuels cellules comptées et les cellules comptées par cytométrie en flux a révélé une proportion beaucoup plus élevée de cellules positives, où la dépendance temporelle du nombre de βIII-tubuline ⁺ était comparable, indiquant la fiabilité du protocole de cytométrie en flux.

L'utilisation de la 3D-échafaudages offre l'opportunité d'étudier le développement de différents types de cellules dans une situation de culture cellulaire plus proche de la situation in vivo. Toutefois, concernant l'analyse de la différenciation neuronale par exemple ou des études fonctionnelles on doit surmonter certains obstacles pour obtenir des données fiables pour la quantification, par exemple des types de cellules.

Ici, nous décrit la culture de hNPCs dans l'hydrogel à base de peptide échafaudage PuraMatrix et la libération par la suite des cellules à utiliser pour les études dans une situation 2D offrant un accès facile aux outils que FACS ou des tests fonctionnels. Récemment, nous avons démontré l'influence de la concentration PuraMatrix sur la formation de la 3D-échafaud par microscopie à force atomique et de l'influence sur la survie et la différenciation des cellules. ¹³ Cependant, on doit garder à l'esprit que chaque type de cellule peut avoir besoin de culture différente conditions ou des matrices comprenant d'autres matériaux, par exemple matrigel ou de collagène.

Le protocole pour libérer les cellules est basée sur un protocole fourni par le fabricant ^{de 18 ans} et est comparable avec les protocoles utilisés pour préparer par exemple des cultures primaires de neurones, où une isolation mécanique des cellules est suivie d'une digestion des matières environnantes par des enzymes. Les cellules tolèrent cette procédure et rester vitale et construit des processus et d'exprimer, comme marqueur neuronal βIII-tubuline, une fois qu'ils sont ensemencées à nouveau sur une surface laminine couché. Ici nous avons effectué des études de cytométrie de flux avec les cellules libérées de quantifier la quantité de cellules ⁺ βIII-tubuline. La comparaison à une quantification fait «manuellement» par le comptage des cellules dans les micrographies ont révélé une proportion beaucoup plus élevée de cellules ⁺ βIII-tubuline. Ceci est probablement dû à l'augmentation du nombre de cellules comptées par le cytomètre en flux (50.000 par sonde) en comparaison à l'analyse manuelle (plusieurs centaines par sonde). Cependant, la cinétique du nombre d'hôtesETA; III-tubuline ⁺ cellules suit le même schéma dans les deux échantillons, où nous détectons une diminution de βIII-tubuline ⁺ cellules au cours du temps. Ceci est en accord avec les études utilisant des cellules ReNcell VM. ^15-17 autres obstacles à surmonter lors d'une analyse manuelle sont des zones très denses des matrices qui ne peuvent guère être analysées ou bruit de fond élevé du matériau de la matrice résultant en une sous-estimation de la "vraie" nombre de cellules. Nous sommes convaincus que ce protocole peut être adapté à d'autres types cellulaires offrant une méthode rapide et fiable pour quantifier plusieurs aspects de la prolifération, la différenciation ou la survie des cellules.