Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

1. Del 1: Kultur i hNPCs i PuraMatrix

1. I förväg till den generationen av en byggnadsställning med en PuraMatrix koncentration på 0,25% utan laminin man behöver förbereda följande lösningar
2. Bered en lösning som innehåller 20% sackaros och en lösning som innehåller 10% sackaros löst i sterilt destillerat vatten.
3. För lösningen en mix 120 ìl av 20% sackaroslösning med 120 l destillerat vatten i en 1,5 ml konisk rör.
4. För lösning 2 mix 60 ìl av PuraMatrix lösning med 60 l på 20% sackaros lösning i en 1,5 ml konisk rör.

För en beredning av en byggnadsställning med en PuraMatrix koncentration av 0,25% kompletteras med laminin (8 mikrogram per 100 l Matrix) ett behov av att förbereda följande lösningar.

1. För lösningen en mix 72 l destillerat vatten med 120 l 20% sackaroslösning och 48 l laminin i en 1,5 ml konisk rör.
2. För lösning 2 mix 60 l PuraMatrix lösning med 60 ìl av 20% sackaros lösning i en 1,5 ml konisk rör.

5. För ingjutning av celler i PuraMatrix förbereda ett 4-brunnar cellodling och placera en steriliserad slip glaskupa (diameter 13 mm) i två brunnar. Förvara plattan i sterilbänk för senare användning. Glas täckglas används endast för immuncytokemiska studier. Om inga immuncytokemiska stainings är avsedda för, kan steget hoppas över.

För att förbereda hNPCs för inkapsling i 3D ställningar man måste förbereda följande lösningar. Späd bensonas i Trypsin / EDTA-lösning, med hjälp av en utspädningsfaktor på 1:10.000. För en Trypsin-Inhibitor/Benzonase lösning mix: DMEM/F12 + bensonas 25U/μl + 1% HSA + Trypsin-hämmare (0.5mg/ml).

6. Lossa cellerna genom att tillsätta 500 l Trypsin / bensonas lösning och inkubera i 5 minuter i en inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎. Stoppa reaktionen med Trypsin-Inhibitor/Benzonase lösning. Därefter centrifugera loss celler i 5 minuter vid 3000 x g. Tvätta cellerna med 5 ml 10% sackaroslösning och centrifugera igen. Kassera supernatanten.
7. Resuspendera cellerna i 10% sackaroslösning bör den sista cellen lösningen innehÃ¥ller 1x10 ⁶ celler / ml.

I nästa steg, från 1,8 till 1,11 bör göras så fort som möjligt, på grund av det låga pH PuraMatrix lösning, som kan vara skadliga för cellerna.

8. Blanda 60 l cellsuspension med lösning 1.
9. Tillsätt 120 l av lösning 1, som innehåller celler, för att de koniska röret med lösning 2 och blanda noga.
10. Häll 100 ìl av blandningen omedelbart på varje täckglas bott i 4-brunnar.
11. Tillsätt långsamt 200 l cellkulturens medium per brunn och efter 2-3 minuter ytterligare 200 l. Detta kommer att inleda självorganisering av matrisen.
12. Inkubera Calnar vid 37 ° C, för 1h i sterilbänk på en värmeplatta eller uppvärmd yta i ditt sterilbänk. Så långt som möjligt inte flytta plattan eftersom det kan skada montering av matriser.
13. Ta bort det mesta av mediet men inte alla, för att undvika matriser falla torr, med en 1000 l pipett. Tillsätt 500 l av medium för att tvätta matriser i 10 min. Slutligen ta bort mediet och tillsätt 500 l färska medelstora och placera kulturen plattan i en inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Eftersom matriserna är känsliga för stötar plattorna bör flyttas som mindre som möjligt och lagras, om möjligt, i en separat kuvös.
14. Det här används hNPCs var frodats i 7 dagar i 3D-ställningar och differentiering initierades av indragning av tillväxtfaktorer ^13. Medium var byts var 2-3 dagar.

2. Del 2: immuncytokemiska färgning av hela matriser

1. I förväg för att färgningsproceduren ett måste förbereda: ablåsning buffertlösning bestående av 5% normala get serum och 0,3% av Triton X-100 löst i PBS, en 4% paraformaldehyd lösning baserad på 0,1 M PBS och om det behövs en lösning med 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) för en kärnor färgning innehåller 100 ng DAPI / ml upplöst i PBS. Prover var monterade med en blandning av Mowiol och DABCO.
2. Att tvätta matriser bort mediet med en 1000 l pipett och tvätta ställningar med PBS gång i 5 minuter.
3. För att fixera byggnadsställningar bort PBS och tillsätt 400 ìl paraformaldehyd (4% i 0,1 M PBS) till varje brunn och inkubera matriserna i 30 minuter vid rumstemperatur. Fast Byggnadsställningar kan lagras i PBS kompletteras med 0,02% NaN ₃ vid 4 ° C i flera veckor upp till flera mÃ¥nader.
4. Inför en färgning tvätta ställningar med PBS i 5 minuter.
5. Inkubera ställningar i blockerande buffertlösning. Blockerande lösningen ändrades tre gånger varje 2-3 timmar och subsequently ställningar inkuberades i blockerande lösningen över natten vid 4 ° C.
6. Avlägsna den blockerande buffertlösning och tillsätt den primära antikroppen löst i PBS kompletterad med 1% normala get serum och inkubera matriserna över natten vid 4 ° C.
7. Ta bort den primära antikroppen lösningen och tvätta ställningar 4 gånger under 2 h och därefter över natten vid 4 ° C med PBS.
8. Ta bort PBS och tillsätt lösningen med den sekundära antikroppen, upplöst i PBS kompletterad med 1% normala get serum, för 4 timmar vid rumstemperatur i mörker.
9. Tvätta prover med PBS 4-6 gånger under 1 timme och därefter över natten vid 4 ° C i mörker.
10. För en kärnor färgning kan man lägga 400 ìl av DAPI lösningen i 30 min.
11. För att montera prover man behöver objektglas. Tillsätt 50 l Mowiol / Dabco på objektglas. Ta bort locket glider från 4-brunnar och lägg dem försiktigt på monteringsmedel.
12. Här har vi använt en Biozero 8000mikroskop (KEYENCE, Tyskland, Karlsruhe) för att erhålla enstaka micrographs och z-stackar. Varje bunt innehåller 30 enskilda bilder med ett avstånd på 1-2 ìm. Med hjälp av motsvarande analysator programvaran oskärpa inneboende fluorescens togs bort före full projektioner av z-stackar producerade var.

3. Del 3: Utsläpp av hNPCs från ställningar för flödescytometri analys

1. I förväg till frisläppandet av celler från byggnadsställningar tvätta ställningar med 500 l HBSS.
2. Överför ställningar med hjälp av ett 1000 l pipett till ett 15 ml koniskt rör som innehåller cellkulturens medium.
3. Att störa byggnadsställningar mekaniskt resuspendera cellen lösningen flera gånger med en 1000 l pipett och sedan centrifugera lösningen vid 3000 xg under 5 min.
4. Avlägsna supernatanten med en pipett, tillsätt 500 ìl Trypsin / bensonas lösning och resuspendera cellpelleten flera gånger.
5. Inkubera cellerna i 5 minutervid 37 ° C i Trypsin / bensonas lösning. För att stoppa reaktionen Tillsätt 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase och pipettera upp och ned flera gånger.
6. Centrifugera cellsuspensionen 5 min vid 3000 xg, avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 2 ml HBSS buffert. Upprepa detta steg två gånger. Detta förfarande kommer att ta bort matrisen skräp.
7. Pass cellen tråg fjädring lösningen en cell sil (porstorlek 70 mikrometer) för att ta bort aggregat och samla de celler i cellodling medium. De erhållna celler kan seedas igen t.ex. på täckglas för funktionella studier som plåster klämma eller fluometric mätningar. För att bearbeta cellerna för flödescytometri, fixera cellerna omedelbart (se 4.1).

4. Del 4: Kvantifiering av βIII-tubulin positiva celler med flödescytometri

1. Fixera släppt celler som erhållits i steg 3,7 med 1% PFA i 15 min i rumstemperatur.
2. Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 3000 xg och Avtagbare supernatanten. Om det behövs kan cellerna vara beredd att lagras vid 4 ° C för senare analys. Därför resuspendera cellerna i tvättbuffert (PBS kompletteras med 0,5% BSA och 0,02% Na-azide).
3. Att gå vidare med förberedelserna för flödescytometri, centrifugera cellsuspension i 10 min vid 350 xg, kassera supernatanten och suspendera cellerna i 25 ìl av antikroppar lösningen. Därför den första antikroppen blandas med saponin buffert vid en koncentration 1:100 t.ex. βIII-tubulin. Den saponin buffert består av PBS med en saponin koncentration av 0,5%, en BSA koncentration av 0,5% och en Na-azide koncentration av 0,02%.
4. Inkubera cellsuspension med den första antikroppen i 2 timmar i rumstemperatur på en shaker. Som negativ kontroll förbereda ett prov utan den första antikroppen.
5. För första tvätt lägga 300 l saponin buffert direkt till cellerna. Centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 350 x g. För det andra tvätt, kasserasupernatanten, lägg till 300 l buffert och centrifugera cellsuspension i 5 min vid 350 x g.
6. Avlägsna supernatanten och tillsätt 25 l lösning innehållande den sekundära antikroppen (t.ex. Alexa Fluor 647, 1:1000, upplöst i saponin buffert). Inkubera cellerna med den sekundära antikroppen 1h i rumstemperatur, i mörkret.
7. För första tvätt lägga 300 l saponin buffert direkt till cellerna. Centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 350 x g. För det andra tvätt, kassera supernatanten, tillsätt 300 l buffert och centrifugera cellsuspension i 5 min vid 350 x g.
8. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 500 l tvättbuffert för flödescytometri analys.

5. Representativa resultat

Ett exempel pÃ¥ hNPCs odlas i självordnande hydrogel schavotten PuraMatrix visas i figur 1. Den hNPCs växer i sfärisk som strukturer i omodifierade PM. I denna kultur tillstÃ¥nds, celler kan knappast erkänns i en sändning ljus, även om buntar av processer mellan sfärerna är synliga (fig. 1A). Beroende pÃ¥ odlingsbetingelser den använda celltyp, kan matrisen ändras t.ex. genom att lägga till laminin. För hNPC cellinje ReNcell VM (Millipore) laminin är nödvändigt för att Ã¥stadkomma en tillväxt mönster med mindre tät aggregat utan en mer homogen fördelning av celler (fig. 1B). Oberoende av ändringar kan matrisen användas för att studera t.ex. neuronal differentiering. Figur 1C visar en färgning av hNPCs för neuronala markör βIII-tubulin. I detta exempel cellerna odlades i 7 dagar i matrisen och sedan differentieras i 4 dagar, där differentieringen var en följd av indragning av tillväxtfaktorer fonden och bFGF. ¹³ kroppar Cell och ett tätt nätverk av processer som byggts upp av cellerna kan erkänt lätt. Det är dock uppenbart att en kvantifiering av antalet celler är tidskrävande, eftersom ett stort antalBilder pÃ¥ olika regioner i matrisen mÃ¥ste analyseras, för att erhÃ¥lla en tillförlitlig databas över en statistisk analys. I fig 1D man kan se ett exempel pÃ¥ celler som frigörs frÃ¥n matrixen och därefter platted pÃ¥ täckglas. Dessa celler kan användas för funktionella studier.

Frisläppandet av celler frÃ¥n 3D-ställningar ger möjlighet att analysera olika parametrar som uttryck för markör proteiner eller överlevnaden av cellerna genom att AnnexinV / PI färgning eller en Tunel analys. Figur 2 visar ett exempel pÃ¥ en flödescytometri analys av andelen βIII-tubulin ⁺ celler. Den negativa kontrollen (celler som inte är markerade för βIII-tubulin) visas i figur 2A. Dessa kontroller används för att bestämma grinden för att senare upptäcka βIII-tubulin ⁺ celler (fig. 2B). En jämförelse av en manuell räkning av celler och en analys med flödescytometri visas i figur 2C. Andelen βIII-tubulin ⁺ celler var determINED genom att räkna det totala antalet celler (med hjälp av en kärnteknisk DAPI färgning) och antalet βIII-tubulin celler ⁺ i fluorescens bilder.

Figur 1. hNPCs odlas i självordnande peptid hydrogel PuraMatrix. A) hNPCs inkapslade i PuraMatrix (PM) växer i sfärisk, packade täta strukturer, där diametern på områden kan vara upp till flera hundra ìm. Mellan sfärerna en kan känna igen buntar av processer byggs upp av celler (pilar). B) celler inkapslade i PuraMatrix kompletteras med laminin (PML) växer i mindre tät struktur, mer homogent fördelad. I laminin kompletteras matrisen en kan känna igen enstaka celler i mindre tät områden (pilar), men det är knappast möjligt att kvantifiera antalet celler. C) hNPCs differentieras för 4 dagar i PML uttrycka neuronal markör som βIII-tubulin (grön). För utvärderingTe andelen positiva celler man har att fastställa det totala antalet celler med en kärnor färgning som DAPI (blå). Den microphotograph presenterar fullt projektion av en z-bunt med bilder tagna med Biozero-8000 mikroskop. D) Celler frigörs från matrixen kan seedas på t.ex. täckglas för vidare funktionella studier. Den microphotograph visar celler odlade för 3D, därefter till förfarandet för frigivningen. Den färgning för βIII-tubulin (röd) visar en jämförbar morfologi till cellerna värd i 3D-ställningen.

Figur 2. Flödescytometrisk analys celler frisätts frÃ¥n PuraMatrix. Att övervinna tidskrävande kvantifiering av mikrofotografier använde vi ett protokoll för att frigöra celler odlade i PuraMatrix som ger tillgÃ¥ng till snabbare analys med flödescytometri. A) Obehandlat celler användes som negativ kontroll, för att ställa in porten (svart ram) för senare analysav t.ex. βIII-tubulin celler. B) För att kvantifiera andelen βIII-tubulin ⁺ celler i samma port, som ligger i den negativa kontrollen, användes. Positiva celler visas i den högra delen av x-axeln, där även en mellanliggande population observerades (prickad ram), troligen representerar cellrester. C) En jämförelse av manuella räknade celler och räknas med flödescytometri avslöjade en mycket högre andel positiva celler, där tiden beroende av antalet βIII-tubulin ⁺ var jämförbar, med angivande av tillförlitligheten i flödescytometri protokollet.

Användandet av 3D-ställningar ger möjlighet att studera utvecklingen av olika celltyper i en cellkultur situation närmare in vivo-situationen. Men när det gäller analysen av t.ex. neuronal differentiering eller funktionella studier man måste övervinna vissa hinder för att få tillförlitliga data för t.ex. kvantifiering av celltyper.

Här har vi beskrivit kulturen i hNPCs i peptid hydrogelen baserade schavotten PuraMatrix och sedan frigöra de celler som skall användas för studier i ett 2D-läge som ger en enkel tillgÃ¥ng till verktyg som FACS eller funktionella analyser. Nyligen har vi visat pÃ¥verkan av PuraMatrix koncentration pÃ¥ bildandet av 3D-schavotten av atomkraftsmikroskopi och pÃ¥verkan pÃ¥ överlevnad och differentiering av celler. ¹³ Dock mÃ¥ste man hÃ¥lla i minnet att varje celltyp kan behöva annan kultur villkor eller matriser som bestÃ¥r av annat material, t.ex. matrigel eller kollagen.

Protokollet att släppa cellerna bygger pÃ¥ ett protokoll frÃ¥n tillverkaren ¹⁸ och är jämförbart med protokoll som används för att förbereda t.ex. grundskolor neuronala kulturer där en mekanisk isolering av celler följs av en nedbrytning av omgivande material av enzymer. Cellerna tolererar detta förfarande och stanna vital och byggt upp processer och uttrycka neuronal markör som βIII-tubulin, när de är seedade igen pÃ¥ en laminin belagda ytan. Här har vi utfört studier flödescytometri med ut celler för att kvantifiera mängden βIII-tubulin ⁺ celler. I jämförelse med en kvantifiering göras "manuellt" genom att räkna celler i micrographs visade en betydligt högre andel βIII-tubulin ⁺ celler. Detta är troligen pÃ¥ grund av det högre antalet celler räknas av flödescytometern (50,000 per givare) jämfört med manuell analys (flera hundra per givare). Men kinetiken av antalet & beta, III-tubulin ⁺ celler följer samma mönster i bÃ¥da proven, där vi upptäcker en minskning av βIII-tubulin ⁺ celler med tiden. Detta är i enlighet med studier med ReNcell VM-cellerna. ^15-17 Andra hinder att övervinna under en manuell analys är mycket täta omrÃ¥den av matriser som knappast kan analyseras eller hög bakgrund av den matris material resulterar i en underskattning av den "riktiga" mobilnummer. Vi är övertygade om att detta protokoll kan anpassas till andra celltyper, som ger en snabb och tillförlitlig metod för att kvantifiera olika aspekter av proliferation, differentiering eller överlevnad av cellerna.