に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド

Abanti Chattopadhyay*¹, A'Tondra V. Gilstrap*^1,2, Michael J. Galko^1,3,4

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, ²Scholars Academy/MARC Scholar, University of Houston-Downtown, ³Genes and Development Graduate Program, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, ⁴Neuroscience Graduate Program, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences

* These authors contributed equally

Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. T. V., Galko, M. J. Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837, doi:10.3791/3837 (2012).

本稿では、 ショウジョウバエの幼虫の熱痛覚を勉強するためのアッセイを示しています。第二は、ほとんどの卸売（グローバル）アクティベーションまたはすべてのそのようなニューロンの³が含まれている間1つのアッセイは、熱侵害受容器^1,2の（ローカル）空間的に制限された刺激が含まれます。一緒に、これらの技術は、 ショウジョウバエの侵害受容感覚ニューロンの行動機能の可視化と定量化を可能にします。

ショウジョウバエの幼虫は、熱痛覚、進化種の^1,2を越えて保存されている潜在的に有害な温度に感覚応答を研究するために確立されたモデルシステムです。そのような研究のためのショウジョウバエの利点は、すべての後生動物のように、responsその神経系やショウジョウバエでは基礎生物学^4-6の分子的基礎を分析するために使用することができ遺伝学的手法の高度化の相対的なシンプルさです。有害な熱刺激への電子は、一般的に提示刺激⁷ "nocifensive"嫌悪撤退を伴います。このような刺激は自由神経終末または侵害受容器を介して検出され、生物体の応答の振幅は、侵害刺激^8を受信した侵害受容器の数に依存しています。 ショウジョウバエでは、感光体¹⁰のような彼らの最近発見された役割に加えて有害な熱的、機械的刺激^9を検出するクラスIV樹状分枝の感覚ニューロンである。非常によく発達レベルで研究されているこれらのニューロンは、バリアの表皮シートの上に樹枝状になると^11,12のほぼすべての表皮細胞との接触を行います。彼らは二次ニューロンに接続することが中枢神経系¹¹の腹側神経索に各クラスIVニューロンのプロジェクトの一つの軸索は、脳へのプロジェクト。

ベースライン条件の下で、侵害受容性知覚神経相対的に高いしきい値に達するまで、nsは発生しません。アッセイは、研究者はベースラインの行動応答または、おそらく、次の組織の損傷をすさまじい感を定量化することができますここで説明する。各アッセイは、有害な熱刺激に異なるが、関連する運動器官の行動反応を引き起こし、 ショウジョウバエの幼虫の熱痛覚のさまざまな側面を可視化し定量化する研究を可能にします。アッセイは、所望の遺伝子型の幼虫や痛覚に影響を与える可能性があり、異なる環境条件下で飼育幼虫​​に適用することができます。熱痛覚が種間で保存されているので、 ショウジョウバエの遺伝的解剖から集められた知見は、おそらく脊椎動物を含む他の種で熱痛覚の我々の理解をお知らせします。

2熱痛覚アッセイのための正常又はUV増感型幼虫を準備するための実験手順の典型的な概要を図1に示されています。

1。幼虫の準備

1. 所望の遺伝子型の雄と雌子孫の幼虫を直接テストすることができます。また、遺伝的相互関心のある定義されている遺伝子型の子孫の幼虫を得るために設定することができます。 20から30まで処女雌15〜20人の男性を使用したフライ食品を含むボトルに十字架を設定します。
2. 卵が横たわって5日後、収穫とどろどろフライ食品をすくい、ゆっくりと630μmの（孔径）メッシュを介して流水で緊張によってクリーンな初期の3齢幼虫。飢餓とdessicationを防ぐために食品の小さな湿ったパッドに早期に3齢幼虫（前後軸に沿った長さで3〜4 mm）を転送します。侵害受容感は、テストする場合は、2.1から2.11以降の手順に従います。幼虫はabsencでテストする場合は組織損傷のeは、3.1のステップに進んでください。

2。エーテル麻酔し、UV照射

1. エーテル麻酔室を構築します。
   1. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブの底を切り取ります。
   2. 熱い金属のヘラでマイクロ遠心チューブのカットエッジを溶かす。
   3. 溶融管表面に貼り細かいメッシュを、冷却することができます。エーテル麻酔チャンバーは、エーテルの煙の進入を許可し、幼虫の脱出を防ぐことができます。
2. 優しくホームメイドエーテル麻酔チャンバー内の10の初期3齢幼虫を配置する鉗子またはペイントブラシを使用しています。
3. 蓋閉じの内側に沿って場所の幼虫。

注：エーテル爆発の恐れのある化学物質であり、その煙は人間と同様に幼虫を麻酔することができますように次の2つの手順はドラフト内で行う必要があります。

4. 携帯10mlのビーカーを含むコプリンジャー内部の幼虫を含むエーテル麻酔チャンバーを配置コットンボールはジエチルエーテルの〜1.5 mlを浸した。
5. 2から2.5分間エーテルフュームに幼虫を公開するコプリンジャーのキャップをします。長いエーテル麻酔時間が悪影響を幼虫の行動や生存に影響を与える可能性があることに注意してください。
6. エーテル麻酔後、放散するエーテルの蒸気用フードに数秒を与えて、コプリンジャー/ビーカーからエーテル麻酔チャンバーを削除します。あなたは今、ラボに戻ってボンネットから移動することができます。
7. そっと小さなペトリ皿にエーテル麻酔室から幼虫をすすぐために水の噴出ボトルを使用しています。
8. 麻酔幼虫は乾燥し、3 "×1"ガラス顕微鏡スライドに固定両面スコッチテープのストリップ上に穏やかに貼るそれらの背側を覆い隠すために鉗子とキムワイプを使用しています。
9. UV照射室の底面にスライドを置き、20 MJ / cm ^2の強度で6秒間紫外線に幼虫を公開します。
10. 軽く両面scotcの幼虫をオフにフロートを水にスライドを浸すhのテープ。
11. 静かに彼らが25℃時の変数の期間（8 -24時間）°Cを回復することができますフライ食品の〜1.0 mlを含む15×45ミリメートル1ドラムのガラス培養バイアルに照射された幼虫を配置する鉗子や絵筆を使用するか、熱痛覚アッセイの再収穫する前に、他の所望の培養温度。

3。ローカルヒートプローブアッセイ

我々は、Pro-Devに工学（材料の表を参照）によって製造された特注のサーマルプローブを使用して、個々の幼虫の体セグメントに有害な熱刺激を提供します。このプローブは、原則として、最適な設計上の特徴（〜0.07ミリメートル^2の面積の小さな金属製のチップと正確に23°Cから65°Cに設定温度を維持する能力）を加熱することができる小型のチップで任意のツールを持っていますが最大20秒までの期間の定義された温度に十分でなければなりません。プローブの先端はdorsumの複数形で正確に早く第³齢幼虫を刺激するために使用されます腹部のセグメントA4でLの正中線（ 図2を参照）。この熱刺激に応答して、幼虫は一般に360度以上横方向に圧延の嫌悪離脱動作を示します。この動作は一般的に運動器官の活動の¹³の短い一時停止を含む、非有害な室温の金属プローブへの軽いタッチレスポンスとは異なります。

ヒートプローブアッセイのためのプロトコル：

1. 希望するセットポイントへの熱プローブの事前設定温度。
2. そっと幼虫が続いて刺激される上に平らプラットフォーム（私たちは通常、バインダーからビニールカットの小片を使用）に個々の幼虫を転送するために絵筆やピンセットを使用しています。幼虫は、サーマルプローブと接触する前に水の薄膜で覆われるべきである。ビニールに触れたときに幼虫が乾燥していないことを確保しながら、幼虫を覆う水の膜が、可能な限り少ない、完全に幼虫をカバーしなければなりません。
3. 優しくプローブと幼虫の表面（ 図2を参照）の間に約45°の角度で先端の光の圧力を適用するセグメントA4で幼虫に対するプローブの先端を押してください。圧力は、幼虫の表面上のわずかなくぼみが発生する必要があり、通常は移動を防ぐのに十分であろう。幼虫が移動し続けている場合は、多少の圧力を適用すると、通常は停止します。ビューまたは一定のプローブコンタクトのフィールドを超えた動きが応答または20秒のカットオフまで達成することができない幼虫からのデータを記録されません。
4. 撤退の応答が展示されるまで、または20秒のカットオフに達するまで、幼虫を刺激し続けて、いずれかが最初に発生します。幼虫を応答すると、通常、最初の頭と尾を持ち上げての予備的な動作を示しています。これは通常、少なくとも360度回転の離脱行動が続いている。唯一の360度の完全なロールをnocifensive動作（予備HEAとして採点されるdまたは尾レイズ）ではありません。
5. 一度撤退の動作は、プローブとの接触を解放し、撤退に待ち時間や時刻を記録が開始されます。なく撤退の動作は20秒以内に観察されない場合は、幼虫は、非応答者です。レスポンダーは、さらに2つのカテゴリに分けることができます。撤退の動作が5秒以内に表示されている場合、幼虫は、高速応答者です。撤退の動作は、5月20日秒の間表示されている場合、幼虫は、低速の応答（バブコックら 、2009年に図1を参照）は¹です。

4。グローバルヒートプレートアッセイ

熱プレートアッセイは、全体の動物が有害な熱刺激に直面されたときに、ショウジョウバエの幼虫の熱痛覚を測定するために設計されています。アッセイセットの回路図と写真図3を参照してください-個々の半ば第³齢幼虫は、60×15ミリメートルのペトリ皿に水80μlのドロップに配置されているアップ。ペトリ皿は、その後、固体加熱ブロック（ "熱板"と呼ばれる）に配置されます。水滴の温度が上昇するとして、幼虫は、我々が頭のスラッシュ、ロール、鞭、発作、麻痺と呼ばれた5つの紋切り型の行動のシリーズを示す。これらの行動はある程度熱プレートの設定温度と我々は最適な条件（95℃の熱板、80μlのドロップであることが判明したものをここで紹介する幼虫を浸漬されている水の量の関数であるとして水）、それらの間の最小限の重複での行動の全て（5件）を観察するため。

熱プレートアッセイのためのプロトコル：

1. 幼虫を表示するための十分な高コントラスト照明があることを確認するために、光ファイバライトガイドを置きます。必要に応じてテストの幼虫を使用しています。光パワーは、テストする幼虫に周囲の熱を避けるために低い上になければなりません。
2. 平らな面を上にして耐熱皿に加熱ブロックを配置し、熱板上に置く顕微鏡ベース。 "高"の位置に熱板の電源をオンにし、温度は約15分安定させるため、95℃の表面温度を達成するために適宜調整
3. 蒸留水80μlを測定し、ピペットで60×15 mmのポリスチレンペトリ皿の真ん中に水滴を置きます。
4. 優しく水滴の中央にきれいなミッド第³齢幼虫を配置する鉗子を使用しています。できるだけ近くに、元の80μlに加熱されるドロップが留まるように水の最小可能なボリュームで幼虫を転送しよう。
5. 静かに熱板上に固体の加熱ブロックの上に水滴や幼虫を含むペトリ皿を置きます。全体の幼虫と一滴の水がビューになるように、すぐに皿の位置を調整します。 図3およびビデオ1-6を参照してください。
6. 現時点ではペトリ皿は、固体加熱用熱板のブロックおよびレコードの上に配置されているタイマーを起動します。各動作の開始の時間。必要に応じて、行動には、ビデオ記録することができます-それぞれの行動の代表的な例については、 ビデオ1-5を参照してください。ライカソフトウェアバージョン3.7は、ムービーを記録するために使用され、録音モードが "連続"でしたが、カメラの解像度は3メガピクセルであった（我々が計算された画像の解像度が10μm/画素であると0.63xズームを使用）とフレーム/秒は44.5であった。

5。代表的な結果

ローカルヒートプローブアッセイ：

サーマルプローブと接触すると、幼虫は通常、頭と尾を持ち上げての予備的な動作を示しています。一般的に頭の解除は、最初の尾を持ち上げるに続いて見られている。幼虫は通常、我々としてを参照している横方向にローリングを開始 "嫌悪撤退の動作。"この予備動作の後に数秒予備動作や撤退の動作が表示されるまでの時間は、温度またはGEによって異なる場合がありますnetic背景。私たちの初期の研究では、異なるプローブセットポイント温度で嫌悪撤退を示す幼虫の割合を測定し、48°Cは、すべての幼虫が（<5秒）の高速応答した最低温度であることがわかった。ここでは、幼虫の熱侵害受容応答（ 図4A）に天井があることを報告します。 100パーセント高速の応答は、52℃のプローブ温度まで観測されているしかし、54°C以上では、幼虫の90％以上は、連絡先の20秒後でも、応答に失敗する。これらの幼虫は、20のカットオフ以下の移動を続けないでください。

以前は¹で述べたように、各温度での撤退行動のカテゴリはプロットと統計的に比較することができます。これは行動アッセイであることを考えると幼虫から幼虫へと個々のユーザーの間にいくつかの変動があります。このことを考慮するために、我々は、通常試験条件あたり30幼虫の3セットを測定します。 wiの単純な分類に加えて我々が以前に報告されていることをthdrawal待ち時間は、我々は、振幅が（ロール状又は嫌悪撤退行動に費やした時間数）にも（ 図4を参照）を測定することができたので報告する。驚くべきことに、より低い温度は、ロールの数が多い（ 図4B）と嫌悪撤退（データは示さず）に費やされた多くの時間を引き起こすように見えるため、入力温度と応答のロバスト性の間に反比例の関係があるように表示されます。これは有害な温度への曝露期間は堅牢性の主要な決定因子であることを示している可能性があります。

熱プレートアッセイ：

五紋切り型の運動器官の挙動は、熱板上に水に浸漬幼虫の転送時に観察されています。これらは以下に説明し、水に非加熱幼虫の典型的な運動器官の動作と一緒にビデオに示されています。これらの行動が観察される平均待ち時間を図5に示されているとして、それぞれのレイテンシを測定した平均水滴の温度があります。最適なアッセイ条件はここで紹介するの下に時折ローリングとホイップ行動は、重複を省略する、またはその逆の順序で発生されていますが、それぞれ異なる挙動を示す幼虫の割合は77％から100％（ 図5B）であった。観察行動は、時系列順に、次のように記述されており、以下に示す時間にビデオで見ることができます。

1. 熱の非存在下での通常の動き：頭部の動きを探索することによって伴う蠕動運動。 6時27分からのビデオを参照してください。
2. ヘッドスラッシュ：幼虫の移動は、順方向または横方向の動きに素早く向かう。この動きは、水中では通常の運動（ ビデオ1を参照）と似ていますが、よりjerkilyと永続的に発生します。午前6時40分からのビデオを参照してください。
3. ロール：幼虫が横方向に少なくとも360°をロールバックします。 6時50分からのビデオを参照してください。これが発生する可能性があります変数の回数、時には不完全なロールが含まれます。行動得点の目的のために我々は唯一の完全な360°ロールをカウントします。この動作は、ヒートプローブのローカルアプリケーションで見られると最も類似している。
4. ホイップ：尾に近い非常に簡単に頭を持って前後軸に沿って幼虫の展示の急速な収縮リリースの動きを。 7時11分からのビデオを参照してください。鞭打ちは、多くの場合に立て続けにまたは圧延と同時に観察される。
5. 発作：幼虫は、前後軸に沿って伸び、曲げずに高周波全身揺れ動作を示します。 7時25分からのビデオを参照してください。
6. 麻痺：幼虫は動きを停止します。他の人がその低周波脈動の動きを示す一方、いくつかの幼虫では、これは永続的です。 7時36分からのビデオを参照してください。

これらのデータは示唆している5 charの発症までの水滴と遅延の温度幼虫/水ドロップ地球温暖化の際に観察acteristic動作は非常に相関している。

図1。幼虫の調製と分析のための実験手順の概要 。前のヒートプローブまたは熱板で痛覚を測定するには、特定の株式や遺伝的交雑から派生した幼虫を回収し、食品の洗浄されています。侵害感が（ベースライン痛覚とは対照的に）評価される場合には、収穫はエーテル麻酔（エーテルへの曝露）、マウント、UV照射、フライ食品の回収の期間が続いている。収穫または回復した幼虫は、どちらのヒートプローブ（ローカル）または熱板（グローバル）アッセイを用いて有害な試験温度にさらされます。数字が示すように、ステップ（s）を記述するメソッドのテキストのセクションを参照してください。

FigurE 2。実験は、局所的な熱プローブアッセイのために設定します。ヒートプローブは、プローブの温度を設定し、維持するために使用される熱制御ユニットによって制御されています。プローブは前後軸に垂直に保持され、水平方向に45°の角度で幼虫を刺激するために使用されています。に示すようにプローブの接触は、腹部のセグメントA4で具体的にされています。ユーザーが20秒カットオフまで、または、ローリング動作が始まるまでの穏やかな圧力まで、この接触を維持する必要があります。温度は有害と認識されている場合は、幼虫は、少なくとも一つ360°ロールによって特徴付け嫌悪撤退の動作が表示されます。ロールの数が（ 図4Bを参照してください）が、1つまたは複数にすることができます。

図3。実験的な熱プレートアッセイのためのセットアップ 。 （A）60×15ミリメートルのペトリ皿の水平方向のビューの漫画の内の1つの中旬第3 ^回を含む80μlの水滴のスター幼虫。 （B）の幼虫のトップビューの漫画は、顕微鏡を通して見た水滴の中央に配置されています。このアッセイのためにワークステーションの水平方向のビューの（C）写真。 （D）の幼虫の写真は、顕微鏡を通して見た。

図4。ヒートプローブアッセイを用いて行動反応の定量化。（）は、各カテゴリ（高速、低速、非レスポンダー）対温度に属する回答者のパーセントのプロット。 （B）それぞれの幼虫が増加して有害性の4つの異なる試験温度（42°C、44°C、46°C、48°C、50°C、52出展ロールの数に対する嫌悪撤退の動作に遅延のプロット°C）。

図5。熱プレートアッセイ：レイテンシーと温度対BEHavior。（）待ち時間と平均的な水は95°C（ホットプレートの表面温度）と水80μlのドロップ（N = 150）の最適な条件の下で各行動反応温度をドロップします。各動作は、特定の時間間隔内で観察されることに注意してください。水滴の温度は平均化された最上部または最下部のドロップ（各場所のためにはn = 10滴）、およびこれらの測定値のいずれかに挿入された熱電対を用いて測定した。 （B）の幼虫の割合は、最適なアッセイ条件下で、それぞれの行動反応を示す。ローリングとホイップそれぞれ77時間の80％を、観察している間、スラッシング押収し、麻痺は時間のほぼ100％を観察しています。低い表面温度のセットポイントの発作と麻痺でローリングとホイップスキップすることができ、または同時に発生する可能性があります200秒以内と高セットポイントで観測されていません。 N = 150。 （C）麻痺の動作は、次の開始を生き残る幼虫の割合。幼虫があるまで加熱した綿繰り麻痺し、回復するために、標準培養条件に削除されます。モック処理幼虫は熱への暴露を除いて同等の治療を受けた。蛹と実行可能な大人の形成は、日7-13定量した。 N = 120。

図6は、幼虫侵害受容感覚ニューロンの不活化は、行動の応答待ち時間を増加させます 。指定された遺伝子型の各動作に遅延のプロット^：1118ワット 、GAL4 ^109（2）80 = MD-GAL4 / +、UAS-Ork1.Δ-C / +、UAS-Ork1.Δ-NC / +、MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C、とmd-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC。 multidendritic末梢感覚神経のすべての4つのクラス内のUAS-規制の導入遺伝子のMD-Gal4のドライブ式、UAS-Ork1.Δ-C ^14は、シナプス伝達に必要なショウジョウバエオープン整流K +チャネルの修正バージョンを表し、U AS-Ork1.Δ-NC ^14はシナプス伝達を妨げることはありません、これと同じチャネルをさらに修正したバージョンを表しています。 MD-Gal4のドライバ⁶とUAS-Ork1.Δ-Cの導入遺伝子の両方が付いただけの幼虫は、5つの観測された行動（スラッシュ、ロール、発作、麻痺）の4つのために増加の待ち時間を表示してください。注意しても、そのため彼らはロールバックする前に、これらの動物の鞭を圧延に増加した待ち時間の。アスタリスクは、スチューデントのt検定によりp <0.05を示します。遺伝子型ごとにn = 30の幼虫。

補足ビデオは、1。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。

補足ビデオ2。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。

補足ビデオ3。"ターゲット=" _blank ">ビデオを見るにはここをクリックしてください。

補足ビデオ4。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。

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補足ビデオ6。 ビデオを見るにはここをクリックしてください 。

ここで説明したアッセイは、定性的かつ定量的に有害な熱刺激に対する反応性の異なる遺伝子型の幼虫を評価するために使用することができます。ヒートプローブアッセイの主な機能は、刺激が単一の遺伝子座でしか与えられていることです。これはおそらく、おそらく唯一の小さなプローブが接触セグメントのクラスIVニューロン-もののサブセットと、すぐに隣接するセグメント¹¹のものの発火につながる。ため局所的刺激により、ヒートプローブアッセイは、地域のような熱いストーブに接触する手など、特定の体に局在している有害な刺激を検出する一般的な感覚体験を模倣しています。ヒートプローブアッセイの欠点は、おそらく三つの要素に起因することができますいくつかのユーザ間のばらつきを持っているということです：私は）ユーザーがプローブⅱ）正確な位置、幼虫にプローブを適用すると圧力基本的な侵害受容ニューロン、および、iii）の正確なANGへの相対的な幼虫で幼虫の表面プローブ接点でル。

我々は以前に与えられた温度を¹に、非レスポンダー、遅い応答し、その撤退の待ち時間に基づいて、高速応答に分類幼虫の定量的な戦略を報告した。ここではさらに高い温度に幼虫の反応性について報告する。興味深いことに、我々は、幼虫の熱侵害受容応答に天井があることを見つけて、この上限は52と54との間にあることを℃にこれは52よりも高い温度でのゲーティングが可能な一過性受容体電位（TRP）チャネル℃を有していないその幼虫が示している可能性がありますまた、それが神経細胞や筋肉が彼らも嫌悪撤退で機能する前に、破損しモータの応答を開始または遂行するために使用されることを示唆している可能性があります。また、撤退の振幅の異なる分析応答を使用して応答の "堅牢性"の指標としてロールの番号のどちらかを報告します。単純に、1これらのパラメータは刺激の温度の上昇や時間の経過とともに増加することが期待されます。驚くべきことに、我々はこのようなケースではないことを見つける。有害な範囲の下限（42℃）の温度で長い時間刺激した幼虫は多くのロールと、より多くの時間は、幼虫がより高い温度（48から52°C）でプローブしたときよりも、ローリング過ごし表示されます。これは有害な温度のウィンドウ内では、主に応答の振幅を決定する露出の期間であることを示唆している。幼虫は非常に有害な温度にさらされているので（48から52°C）非常に迅速に平均的に反応するの幼虫などの多くのロールは時間の長い長さの少ない有害な温度にさらされるとして、彼らは示さない。ここで報告された応答振幅の分析は、異なる遺伝子型や環境の操作を比較することができるとともに、別の定量的な次元を追加します。

熱プレートアッセイの主な特徴は、それが有害にグローバルな露出を伴うことです。熱。このように、それは熱いストーブに触れてより加熱釜に座っている動物に似ています。幼虫は、野生でグローバルに侵害刺激が発生する可能性がありますときには明らかではないが、ラボではこのグローバル曝露に対する行動応答は局所刺激によって観察されたものよりも複雑です。また、他の³で述べた熱プレートアッセイの強さは、幼虫に触れると、プロトコルのコンポーネントではありませんので、それは少しユーザ間のばらつきがあるということです。唯一の実質的な差異は、各動作が開始し、これが繰り返される表示/親しみやすさを最小限に抑えることができたときに定義することであるように思われる。アッセイの間に興味深い相違点は、嫌悪行動が開始する温度である。これらは、ヒートプローブに比べて熱プレートアッセイではるかに低い。ヒートプローブ（ヘッドとテールの昇給）と接触幼虫によって示された予備的な動作は、°Cの熱プラットフォームで〜27で観測された頭のスラッシュの相関かもしれません電子アッセイ。それは、この応答は、 "痛み"よりも "不快感"を反映している可能性があります。我々は、高温下でも、発作を打つの相関、および麻痺が観察されていない（最大48°C）熱プローブアッセイの温度、それは身体の複数の領域から発射感覚ニューロンのクリティカルマスがあるのか​​もしれないこれらの行動にもたらすために必要としていました。そのグローバルな刺激は、ローカルでの動作をトリガするためには不十分であるニューロンの応答の加算含むことができることを示すヒートプローブで観察された侵害受容閾値の下端以下 - 興味深いことに、発作と麻痺の動作は、温度（37℃〜34）で観測されているヒートプローブのアプリケーション。これらの温度は、実際に幼虫に有害として認識されていることは、ほとんどのケースではありません麻痺の動作を開始し、続いてフライ食品に回復させ、幼虫が（図5C）生き残るという観察によってサポートされています。さらに熱PLという主張を支持する食べたアッセイは、侵害受容性応答を読んでいると知られている侵害受容性感覚ニューロンにシナプス伝達をブロックして観測された行動（図6）のほとんどのレイテンシを増加させるという事実である。高温度ホイップ動作のレイテンシの増加はありませんという観察は、MD-GAL4を発現しない他の感覚ニューロンは、この動作のために必要とされることを示唆している。

グローバルなアッセイで急速に加熱水滴のローカルアッセイと液浸の小さな金属製のプローブのホットチップ - 和では、両方のアッセイは、定義された温度の有害な熱刺激に個々の幼虫を露出伴う。遺伝的背景および/ ​​または環境条件（例えば、プラスまたはマイナスの組織の損傷のために）変化にさらされるの変化のショウジョウバエの幼虫の行動応答は、学び、これらのアッセイを用いて定量することができます。最終的に、これらのアッセイの結果から、私たちはより良いNOCを制御する遺伝子ネットワークを理解するのに役立ちますショウジョウバエや他の近縁種でiception。

我々は、開示することは何もありません。

私たちは、原稿の重要な読書のための熱プレートアッセイ、フライ株式のブルーミントンのショウジョウバエストックセンター、Galkoラボのメンバーを提案して幼虫のヒートプローブアッセイ、ショーン·スウィーニーを開発するための熱プローブ設計、ダニエル·バブコックのためにキリスト教のランドリーに感謝します。この作品は、MJG、研究キャリア（AVG）に少数派にアクセスするためのNIH MARC U-STARトレーニンググラント（ヒューストン - ダウンタウン学者アカデミーの大学へのT34GM079088）にNIH R01 NS069828によってサポートされていました。

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