La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

1. ECIS / taxis Preparación de electrodos

1. La superficie de oro de la matriz de electrodos ECIS / taxis (que consta de 8 cámaras por diapositiva) se estabiliza por primera pre-tratamiento con cisteína estéril 10 mM en agua desionizada (dH ₂ O) durante 15 min a temperatura ambiente bajo condiciones estériles.
2. Aspirar la solución de cisteína de cada cámara de electrodo, enjuagar 3 veces con agua estéril O dH _2, y reemplazar con 250 l de medio completo (RPMI 1640, FBS al 10%, 25 mM de tampón HEPES).
3. Conecte el conjunto de electrodos en contacto con alfileres en tenedor del instrumento matriz para realizar la comprobación de los electrodos.
4. Cámaras que estén debidamente conectadas se resaltan en verde en la pantalla del ordenador. Si las cámaras se resaltan en rojo, no están conectados y los electrodos se deben volver a colocar en el titular de la matriz para establecer contactos para todas las cámaras.
5. Una vez que todas las cámaras están conectadas, haga clic en el botón "Check" en el controlador de software para disuadir a losminar la resistencia inicial y los valores de capacitancia para cada cámara. Los valores de resistencia debe ser de entre 1600 y 2000 ohmios, y los valores de capacitancia debe ser de entre 5 y 6 nanofaradios para una matriz de la cámara 8. Si una cámara no está dentro de estos parámetros aceptables, la cámara individual no debe ser utilizado para recoger datos.
6. Desconecte el electrodo de soporte de serie para preparar las cámaras individuales de agarosa. Aspirar el medio de las cámaras y lave cada cámara de 3 veces con agua estéril dH ₂ O.

2. Preparar agarosa Cámaras

1. En un tubo de polipropileno estéril de 15 ml cónico, medida de 0,03 g de Seakem GTG agarosa y se añade 1 ml de PBS estéril. Colocar la tapa del tubo sin apretar, y fundir la agarosa en autoclave durante un ciclo de 2 minutos líquido (punto de fusión en un horno de microondas no es eficaz para este ensayo). Este breve periodo de tiempo no se derrita el tubo cónico. Para las células menos exigentes que no requieren suero para el cultivo, (por ejemplo Dictyostelium discoideum) 0,5%agarosa se puede hacer en el medio apropiado y se fundió en un horno de microondas. El autoclave es necesario para las células que requieren suero, ya que esto se desnaturalizó si fundió en horno de microondas.
2. Añadir 5 ml de medio RPMI completo calentó en un baño de agua (55 ° -60 ° C) directamente a la agarosa caliente, a una concentración final de 0,5% de agarosa y pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar.
3. Pipetear 300 l de medio de agarosa derretida en cada cámara, vuelva a colocar los ECIS / cobertura amplia taxis y permita que el gel a la temperatura ambiente.
4. Pipetee restante de agarosa en la tapa del tubo de 15 ml para evaluar gelificante agarosa. Este exceso de agarosa se utilizará también en la parte 4: Cortar en los pozos de agarosa.

3. La construcción y afilado de la cánula de herramientas de corte bien

1. Afilar dos cánulas de calibre 14 extremo romo, utilizando un 5/64 "bits. Girar la punta de la broca en cada abertura de la cánula con un taladro de velocidad lenta, asegurándose de que la broca corta borde entero interior de cada op cánuladatorio formar un borde de corte afilado (Figura 4A).
2. Haga dos agujeros a través de 1 "x 2" x ¼ "de plexiglás (Figura 4B-D) con un 5/64" en una prensa de taladro. Inserte cada afilado cánula de calibre 14 por lo que sobresale a la misma distancia a través de cada agujero de plexiglás.

4. Corte de Wells en agarosa

1. Esterilizar las cánulas de calibre 14 por la ligera llama de la punta. Antes de cortar los pozos en la cámara de ECIS, permitir que la cánula se enfríe a temperatura ambiente, o enfriar las cánulas tocando la agarosa en el tapón del tubo de 15 ml. Si la temperatura de la cánula es demasiado alta, la agarosa se derretirá como los pozos de cámara se cortan, haciendo que los pozos deforme y defectuoso.
2. Alinear el par cánula por encima de los dos puntos de oro que rodean el electrodo de destino en cada cámara (Figura 2c y 5). Insertar la cánula verticalmente, sin ningún tipo de movimiento horizontal, deteniéndose en contacto suave entre la cánula yla superficie del electrodo. Retire con cuidado la cánula, de nuevo sin ningún tipo de movimiento horizontal. La colocación de pozos adicionales para oponerse a gradientes también es posible con una reconfiguración de la plantilla cánula.
3. Suavemente aspirar el tapón de agarosa dejado por la cánula, utilizando un estéril 9 "pipeta Pasteur, conectado a presión bajo vacío, con una trampa de vacío atrapar los residuos de agarosa.
4. Añadir 300 l de medio RPMI completo a la superficie de cada cámara a 37 ° C, durante 2 minutos para saturar la agarosa, y luego suavemente aspirar los medios de comunicación desde la superficie y los pozos sin perturbar la agarosa.

5. Carga de la Wells

1. Cada bien es capaz de contener un volumen de 7 l. Para un pozo en cada cámara, añadir 7 l de suspensión de células. Para células Jurkat T, use 2 x 10 ⁷ células / ml. Estas células responden a 7 l de 200 ng / ml SDF-1α diluida en RPMI incompleto, que carece de suero. Utilice los medios de comunicación completos solo como un cont negativorol.
2. Después de que los pozos se cargan, ver cada cámara de la matriz con un microscopio invertido para asegurar que todos los pocillos se cortaron y se llena apropiadamente. Las células deben estar en dentro de los confines de los límites del pozo. Si se ven tanto en los pozos, o se están extendiendo más allá del borde de la celda y, a continuación, una brecha se ha formado bajo la agarosa. Tenga en cuenta los pozos mal configurada, ya que los datos no pueden ser interpretados de forma fiable a partir de esas cámaras.

6. Recopilación de datos

1. Coloque el electrodo en el soporte de la matriz y volver a conectar los electrodos de oro en la matriz de electrodos a los pines pogo resorte del titular y haga clic en "Configuración". Los pozos que estén debidamente conectadas se resaltan en color verde. Si los pozos son de color rojo, que no están conectados y el electrodo debe ser recolocado en el soporte de matriz.
2. Seleccione "8WE1" (8 y 1 electrodo) desde el menú desplegable en el panel de software para indicar la configuración de la matriz.
3. Seleccione "Buscar" en el software de contrPanel ol para determinar la resistencia inicial y los valores de capacitancia para cada pocillo. Los valores de resistencia debe estar entre 1600 y 2000 ohmios, mientras que los valores de capacidad debe ser de entre 5 y 6 nanofarads.
4. Seleccione múltiples frecuencias para medir la resistencia a distintas frecuencias. Hay una opción de personalización de frecuencias, o utilizando un conjunto de frecuencias recomendadas. Los valores estándar de múltiples frecuencias de adquisición de la captura de datos en 11 frecuencias preestablecidas (52.5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 y 64.000 Hz) a una velocidad de 8 pozos por minuto. El intervalo de tiempo entre las mediciones también se pueden personalizar. La recopilación de datos de múltiples frecuencias permite el análisis de la capacitancia, impedancia y resistencia. Recopilación de los valores de resistencia a 4.000 Hz suele ser suficiente para los estudios de células de mamíferos quimiotaxis, pero las frecuencias adicionales puede proporcionar información en otros contextos ^12,13.
5. Duración de la prueba total se puede establecer, en la mano derechapanel, o el experimento se puede detener manualmente, haciendo clic en "Finalizar" una vez que las células han desarrollado cierta resistencia que son indicativos de la llegada al electrodo. El tiempo que tarda para que las células llegan a la electrodo depende del tipo de célula utilizado.
6. Haga clic en "Inicio" para iniciar la recolección de datos.

7. Gestión de Datos

1. Aunque los datos pueden ser exportados a Excel, el software de ECIS 1600R, que acompaña al sistema de ECISθ es el método más eficiente para analizar los datos de ECIS / taxis.
2. Los datos de software de análisis de barra de herramientas contiene los botones de radio Z, R y C. Se trata de determinar si la impedancia, la resistencia o capacitancia, respectivamente, se representa en el eje vertical contra el eje x (tiempo transcurrido).
3. ECIS / taxis de datos es más eficiente se demuestra como resistencia en el tiempo a 4.000 Hz. Las fluctuaciones rápidas de la resistencia, o microtransients (Figura 1), son una muestra del movimiento celular sobre el electrodo. Compilar, ohurgar en la basura r los puntos de datos a fin de que no todos los puntos se grafican, no se recomienda para ECIS / taxis, ya que microtransients promedio de los datos.
4. Una vez que el gráfico ha sido realizado con el software ECIS1600R, que pueden ser exportados por la elección de "gráfico de exportación" en el menú archivo, y se guarda como un archivo. Tif o. Jpg.

8. Los resultados representativos

Cellular quimiotaxis es indicado por un aumento en la resistencia a 4.000 Hz. La llegada de las células en el electrodo de destino también está indicada por la aparición de fluctuaciones rápidas en la resistencia llamados microtransients o micromovimiento como se describe en Opp et. al., 2009 (Figura 1) ^14. Un resultado negativo se indica por coherente, o un ligero descenso, en la resistencia a 4.000 Hz, como se ve en rojo en la Figura 1. La ausencia de microtransients es también un signo de una ausencia de movimiento de las células hacia el electrodo. El aumento de la resistencia es directamenteproporcional al número de las células que atraviesan el electrodo ^10. La adición de anticuerpo monoclonal específico para un quimioatrayente o toxinas conocidas para interferir con los receptores acoplados a proteínas G pueden bloquear la quimiotaxis ^11.

Figura 1. La quimiotaxis de células Jurkat T humanos en respuesta a SDF1α. Las células Jurkat T (2.0x10 ⁶ células / ml) fueron expuestos a un gradiente de SDF-1α (a partir de la concentración de 100 ng / ml) o medio RPMI 1640 como un control negativo. La resistencia normalizada a 4000 Hz se graficó. Humanos células Jurkat T movido en respuesta a SDF-1α, como lo demuestra el aumento de la resistencia y microtransients, mientras que ningún movimiento se observó con la exposición a RPMI 1640.

Figura 2. Vista superior de un electrodo ECIS / taxis without agarosa. Cada electrodo ECIS / taxis está formado por 8 cámaras individuales. Cada cámara comparte un electrodo grande (una), y contiene un electrodo objetivo individual (b). Cada cámara también cuenta con 2 círculos de oro (c), que se utilizan como guía para cortar los pozos de la agarosa con las cánulas. Los cuadrados de oro (d) son las superficies de contacto que se conectan a los pasadores pogo con el fin de aplicar la corriente alterna al electrodo. Los electrodos objetivo individuales son cada uno en circuito con el electrodo contador mayor (e).

Figura 3. Dos pocillos se corta en cada cámara de agarosa-llenado. Cuando el quimioatrayente se añade a un bien se difunde para crear un gradiente en la agarosa, con la mayor concentración de chemoattract más cercano al quimioatrayente bien. Las células se desplazan por debajo de la agarosa hacia mayores concentraciones de quimioatrayente y puede pasar sobre el electrodo de destino. Comolas células cruzar el electrodo de destino, un aumento de la resistencia es registrado por el software ECIS 1600R.

Figura 4. La inserción de dos cánulas de calibre 14 en plexiglás. A) A, B 5/64 "broca se utiliza para afilar la punta de la cánula.) Dos agujeros deben ser perforados en metacrilato para dar cabida a las cánulas de calibre 14 de acuerdo con el disparo de diseño. C) Use un taladro para asegurar que los agujeros son perpendiculares a la superficie pleixglass. D) Dos cánulas afilado se insertan a través de ¼ "de plexiglás, 2 mm de distancia (medida desde el borde interior). Estas cánulas afilado son cuidadosamente insertado en agarosa para cortar los pozos.

Figura 5. Alineación de cánulas con puntos de oro en el ECIS / taxis de la cámara. Para cortar los pozos, la cánula debe afiladoestar alineados con los puntos de oro que flanquean el electrodo de destino en el fondo de la cámara ECIS / taxis. La cánula se debe insertar verticalmente, sin ningún tipo de movimiento horizontal, y se retira de la misma manera.

Nuevas características de la prueba de ECIS / taxis incluyen su capacidad de automatizar la recopilación de datos en tiempo real, como las células responden a quimioatrayente. Aunque la aplicación más común de esta tecnología consiste en medir la respuesta celular a los gradientes quimiotácticos individuales, o de los gradientes de compuestos de mezclas de agonistas y antagonistas de la quimiotaxis, el enfoque de ECIS / taxis también es susceptible a las modificaciones de estas configuraciones que pueden ser muy útiles en el evaluación de la capacidad de respuesta celular. Hay buena evidencia de que la superposición o gradientes secuenciales pueden influir en el comportamiento celular en formas novedosas. Además, es probable que estos gradientes más complejos son la norma in situ ^{12, 13.}

El ensayo de ECIS / taxis se pueden permitir el modelado de estas configuraciones diferentes gradientes de maneras que no son posibles con otras tecnologías. Por ejemplo, mediante la adición de pozos adicionales, uno puede distribuir la orientación de la gRadient (s) en relación con el pozo de células y el electrodo de destino. También es posible configurar el ensayo para colocar las células en uno de los pozos como fuente de factores quimiotácticos.

Al configurar el ensayo, es importante para mantener la hidratación completa del gel que se superpone a la diana y los electrodos de contador en cada cámara, y para cortar los pozos que tienen la relación espacial correcta para el electrodo de destino. Además, el fondo de la célula así tiene que ser contigua a la delgada película de líquido que se forma bajo la capa de agarosa, es en esta película que las células se mueven en respuesta al gradiente suprayacente. Para ello, hay que aspirar todos los plug agarosa sin dejar fragmentos de gel de atrás. La eliminación del corte enchufe de agarosa por la cánula puede crear un túnel entre los dos pozos, lo cual tiene el efecto de deformar el gradiente y permitiendo que las células para moverse libremente a través del electrodo de destino. Es esencial que la presión de vacío utilizado para aspfurioso el tapón de gel es baja para evitar poner en peligro la integridad del pozo de agarosa.

Hemos encontrado que las variaciones en el porcentaje de agarosa utilizado en el gel puede diferenciar las células que expresan defectos citoesqueleto de células de tipo salvaje, lo que sugiere que esta manipulación puede ser utilizado para interrogar a las fuerzas que las células pueden ejercer sobre su entorno. Si el gel se deshidrata durante el cultivo, se producirán cambios que la influencia de los resultados experimentales, incluyendo un aumento relativo en la rigidez de gel que ralentizar el movimiento celular y un aumento en la concentración de soluto que disminuiría la impedancia total del sistema.

El ensayo es compatible con la medición de la circulación por los leucocitos y otros tipos de células que no permiten el flujo de corriente a través del cuerpo de la célula. Esto no es una característica universal de las células: las células nerviosas y algunas células epiteliales (por ejemplo) puede transmitir corriente a través del cuerpo de la célula, produciendo así una menor resistencia a la medida valiosaes por célula individual.

Aunque estos enfoques se define específicamente para detectar las respuestas celulares a los gradientes quimiotácticos, es fácil imaginar el ensayo como igualmente aplicable a estudios con metástasis y las señales extracelulares que mejoran el movimiento celular metastásico. Además, existen otras configuraciones de matriz que pueden ser utilizados en otros estudios de interacción célula-sustrato.