Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

1. ECIS / Taxis Preparação do eletrodo

1. A superfície de ouro do conjunto de eléctrodos ECIS / táxis (consistindo de 8 câmaras por lâmina) é primeiro estabilizada por pré-tratamento com cisteína 10 mM em água desionizada estéril _(dH2O) durante 15 min à temperatura ambiente sob condições estéreis.
2. Aspirar a solução de cisteína a partir de cada câmara de eléctrodo, lavar 3 vezes com _dH2O estéril, e substituir com 250 uL de meio completo (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampão HEPES).
3. Conecte o conjunto de eletrodos de entrar em contato com pinos titular matriz instrumento para realizar seleção de eletrodos.
4. Câmaras que estejam devidamente conectados será destacado em verde na tela do computador. Se as câmaras são destacadas em vermelho, eles não estão conectados eo eletrodo deve ser re-posicionado no porta-matriz para estabelecer contatos para todas as câmaras.
5. Uma vez que todas as câmaras estão conectados, clique no botão "Check" no controlador de software para impedirmina a resistência inicial e os valores de capacitância para cada câmara. Os valores de resistência deve ser entre 1600 e 2000 ohms, e os valores de capacitância deve ser entre 5 e 6 nanofarads para uma matriz de câmara 8. Se uma câmara não está dentro destes parâmetros aceitáveis, a câmara de indivíduo não deve ser usado para recolher dados.
6. Desligue o eléctrodo a partir do detentor matriz para preparar as câmaras individuais de agarose. Aspirar meio de câmaras e lave cada câmara de 3 vezes com estéril dH ₂ O.

2. Preparando Agarose Chambers

1. Em um tubo de polipropileno estéril 15 ml, g medida 0,03 de SeaKem GTG agarose e adicionar 1 ml de PBS estéril. Recoloque a tampa do tubo solto, e derreter a agarose em autoclave para um ciclo de 2 min líquido (fusão em um forno de microondas não é eficaz para este ensaio). Este curto período de tempo não vai derreter o tubo cônico. Para as células menos exigentes que não requerem soro para a cultura, (por exemplo, Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose pode ser feita no meio apropriado e fundido num forno de microondas. O autoclave é necessário para as células que requerem soro, como isso será desnaturada se derretido em microondas.
2. Adicionar 5 ml de meio RPMI completo aquecida num banho de água (55 ° -60 ° C) directamente à agarose quente, para uma concentração final de 0,5% de agarose e pipeta-se e suavemente para baixo para misturar.
3. Pipete 300 de meio de agarose derretido em cada câmara, substituir os ECIS / tampa matriz táxis e permitir ao gel à temperatura ambiente.
4. Pipetar restante de agarose em tampão de 15 ml para avaliar tubo de gelificação de agarose. Este excesso de agarose irá também ser utilizado, em parte, 4: Corte poços em agarose.

3. Construir e afiar a cânula Ferramenta Bem Cutting

1. Afiar duas calibre 14 cânulas extremidade romba, utilizando um 5/64 bits ". Rodar a ponta da broca de perfuração em cada abertura cânula com uma broca de velocidade lenta, certificando-se que a broca corta borda interior inteiro de cada op cânulaening para formar uma aresta de corte afiada (Figura 4A).
2. Faça dois furos com 1 "x 2" x ¼ "plexiglass (Figura 4B-D) com um 5/64" bits em uma imprensa de broca. Insira cada cânula afiada calibre 14 para que ele se projeta uma distância igual através de cada furo plexiglass.

4. Corte Wells em Agarose

1. Esterilizar as cânulas de calibre 14 levemente as pontas de fogo. Antes do corte poços na câmara de ECIS, permitir que a cânula a arrefecer até à temperatura ambiente, ou refrigerar o cânulas tocando a agarose na tampa do tubo de 15 ml. Se a temperatura da cânula é demasiado elevado, a agarose derreterá como os poços de câmara são cortadas, tornando os poços deformado e defeituoso.
2. Alinhar o par cânula acima os dois pontos de ouro em torno do eléctrodo alvo em cada câmara (Figura 2c e 5). Inserir o verticalmente cânula, sem qualquer movimento horizontal, parando em contacto suave entre a cânula eosuperfície do eletrodo. Cuidadosamente remover a cânula, novamente sem qualquer movimento horizontal. Colocação de poços adicionais para se opor gradientes também é possível com uma reconfiguração do gabarito cânula.
3. Aspirar cuidadosamente a ficha de agarose deixado pela cânula, utilizando uma agulha estéril 9 "pipeta de Pasteur, ligado a pressão de vácuo de baixa, com uma armadilha de vácuo pegar resíduos de agarose.
4. Adicionar 300 ul de meio completo RPMI para a superfície de cada câmara a 37 ° C, durante 2 min para saturar a agarose, e, em seguida, aspirar cuidadosamente os meios de comunicação a partir da superfície e os poços sem perturbar a agarose.

5. Carregando o Wells

1. Cada poço é capaz de manter um volume de 7 uL. Para um poço em cada câmara, adicionar 7 uL de suspensão de células. Para as células de Jurkat T, utilizar 2 x10 ⁷ células / ml. Estas células irá responder a 7 uL de 200 ng / ml SDF-1α diluído em meio RPMI incompleta, que carece de soro. Use a mídia completos sozinho como um cont negativorol.
2. Depois de as cavidades são carregados, ver cada câmara da matriz com um microscópio invertido para assegurar que todos os poços foram cortadas e encheu adequadamente. As células devem estar em dentro dos limites de fronteira do poço. Se eles são vistos em ambos os poços, ou estão se espalhando para além das fronteiras da célula bem, então uma lacuna se formou sob a agarose. Observe os poços indevidamente criadas, pois os dados não podem ser seguramente interpretadas a partir dessas câmaras.

6. Coleta de Dados

1. Coloque o eletrodo no suporte da matriz e re-conectar as pastilhas de ouro no conjunto de eletrodos para os pinos de mola pogo do titular e clique em "setup". Os poços que estão conectados corretamente será destacada em verde. Se os poços são vermelhos, eles não estão conectados eo eletrodo deve ser colocada no porta-matriz.
2. Selecione "8WE1" (8 eletrodo bem 1) a partir do menu drop-down no painel de software para indicar a configuração da matriz.
3. Selecione "verificar" no software contrpainel ol para determinar a resistência inicial e valores de capacitância para cada poço. Os valores de resistência deve ser entre 1600 e 2000 ohms, enquanto que os valores de capacitância deve ser entre 5 e 6 nanofarads.
4. Selecione múltiplas freqüências para medir a resistência em diversas freqüências. Há uma opção de personalização de freqüências, ou usando um conjunto de freqüências recomendadas. As configurações padrão de aquisição de múltiplas freqüências capturar dados em 11 freqüências predefinidas (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 e 64.000 Hz) a uma taxa de 8 poços / min. O intervalo de tempo entre as medidas também podem ser personalizados. Coleta de dados com múltiplas frequências permite a análise de capacitância, resistência, impedância e. Coleta de valores de resistência a 4.000 Hz é geralmente suficiente para estudos de quimiotaxia de células de mamífero, mas as freqüências adicionais podem fornecer informações em outros contextos ^12,13.
5. A duração da experiência total pode ser definido, na mão direitapainel, ou o experimento pode ser parado manualmente, clicando em "finish" uma vez que as células produziram resistência que são indicativos de chegada ao eletrodo. O tempo que leva para as células para se chegar ao eléctrodo depende do tipo de célula utilizada.
6. Clique em "Iniciar" para iniciar a coleta de dados.

7. Gerenciamento de Dados

1. Embora os dados podem ser exportados para o Excel, o software ECIS 1600R, que acompanha o sistema ECISθ é o método mais eficiente para analisar dados ECIS / táxis.
2. O software de dados barra de ferramentas de análise contém os botões Z, R e C. Estes determinar se a resistência de impedância, ou capacitância, respectivamente, é plotado no eixo vertical contra o eixo x (tempo decorrido).
3. ECIS / táxis de dados é apresentado de forma mais eficiente como a resistência ao longo do tempo a 4.000 Hz. Flutuações rápidas na resistência, ou microtransients (Figura 1), são a prova de movimento celular sobre o eléctrodo. Compilando, obinning r os pontos de dados de modo que nem todos os pontos são representados graficamente, não é recomendado para ECIS / Taxis, uma vez que irá microtransients média a partir dos dados.
4. Uma vez que o gráfico foi feito com o software ECIS1600R, pode ser exportado, escolhendo "gráfico de exportação" no menu arquivo e salva como um arquivo. Tif ou. Jpg.

8. Os resultados representativos

Cellular quimiotaxia é indicado por um aumento da resistência a 4.000 Hz. A chegada de células sobre o eléctrodo alvo também é indicada pelo aparecimento das flutuações rápidas na resistência chamados microtransients, ou micromovimento como descrito no Opp et. ai., 2009 (Figura 1) ^14. Um resultado negativo é indicado por consistente, ou uma ligeira diminuição, da resistência a 4.000 Hz, como se vê em vermelho na Figura 1. A ausência de microtransients é também um sinal de uma ausência de movimento célula para o eletrodo. O aumento da resistência é directamente próproporcional ao número de células que cruzam o eletrodo ^10. A adição de anticorpo monoclonal específico para um quimioatractor ou toxinas conhecidas para interferir com receptores acoplados à proteína G pode bloquear a quimiotaxia ^11.

Figura 1. Quimiotaxia de células Jurkat T humanos em resposta a SDF1α. Humanos células Jurkat T (2.0x10 células ⁶ / ml) foram expostos a um gradiente de SDF-1α (a partir de concentração de 100 ng / ml) ou RPMI 1640 como um controlo negativo. A resistência normalizada em 4000 Hz foi representado graficamente. As células Jurkat T humanos movido em resposta a SDF-1α, como evidenciado pelo aumento da resistência e microtransients, enquanto nenhum movimento foi observado com a exposição ao meio RPMI 1640.

Figura 2. Vista de cima de um ECIS / Táxis Eletrodo without de agarose. Cada eléctrodo ECIS / táxis é composta de 8 câmaras individuais. Cada câmara de partilha um eléctrodo grande (uma), e contém um eléctrodo de alvo individual (b). Cada câmara tem também 2 círculos de ouro (c), que são utilizados como um guia de corte, quando os poços no agarose com as cânulas. Os quadrados de ouro (d) são as almofadas de contacto que se ligam aos pinos pogo a fim de aplicar a corrente de CA para o eléctrodo. Os eléctrodos são, cada um alvo individuais no circuito com eléctrodo maior contador (e).

Figura 3. Dois poços são cortadas em cada câmara de agarose-preenchidos. Quando o quimioatraente é adicionado a uma bem ele difunde para criar um gradiente na agarose, com a maior concentração de chemoattract mais próximo do quimioatractor bem. As células viajar por baixo da agarose para concentrações mais elevadas de quimioatraente e pode passar sobre o eléctrodo de destino. Comoas células atravessar o eléctrodo de destino, um aumento de resistência é gravado pelo software ECIS 1600R.

Figura 4. A inserção de duas cânulas calibre 14 em plexiglass. A) A B 5/64 "broca é usada para afiar a ponta da cânula.) Dois furos devem ser perfurados em plexiglass para acomodar as cânulas de calibre 14 de acordo com o tiro layout. C) Use uma broca imprensa para garantir que os buracos são perpendiculares para a superfície pleixglass. D) duas cânulas afiada são inseridos através de ¼ "plexiglass, 2 mm de intervalo (medido a partir de arestas interiores). Estes cânulas afiada são cuidadosamente inserido agarose para cortar os poços.

Figura 5. Alinhando cânulas com pontos de ouro em ECIS / Taxis câmara. Para cortar poços, as cânulas afiada deveser alinhados com os pontos de ouro que flanqueiam o eléctrodo de destino no fundo da câmara de ECIS / táxis. A cânula deve ser inserida verticalmente, sem qualquer movimento horizontal, e removido do mesmo modo.

Novas características do ensaio ECIS / Taxis incluir a sua capacidade de automatizar a coleta de dados em tempo real como as células respondem ao chemoattractant. Embora a aplicação mais comum desta tecnologia consiste em medir as respostas celulares a gradientes quimiotáticos individuais, ou aos gradientes de compostos de misturas de agonistas e antagonistas de quimiotaxia, a abordagem ECIS / táxis é também susceptível às variações de a estas configurações que podem ser bastante útil no avaliação de capacidade de resposta celular. Há boas evidências de que a sobreposição ou gradientes seqüenciais podem influenciar comportamentos celulares de novas maneiras. Além disso, é provável que estes gradientes mais complexos são a norma in situ ^{12, 13.}

O ensaio ECIS / Taxis pode permitir a modelagem dessas configurações diferentes gradientes de maneiras que não são possíveis com outras tecnologias. Por exemplo, pela adição de poços adicionais, uma possível distribuir a orientação do gradient (s) em relação ao poço da célula e do eléctrodo de destino. Também é possível configurar o ensaio para colocar as células em um dos poços como a fonte de factores quimiotácticos.

Ao configurar o ensaio, é importante para manter a hidratação completa do gel que sobrepõe o alvo e os eléctrodos de contador em cada câmara, e para cortar poços que possuem a relação correcta espacial para o eléctrodo de destino. Além disso, a parte inferior da célula bem precisa de ser contíguos com a película fina de líquido, que forma sob a camada de agarose, é neste filme que as células vão mover em resposta ao gradiente de sobrejacente. Para fazer isso, deve-se aspirar toda a ficha de agarose sem sair fragmentos de gel para trás. A remoção do corte tomada de agarose pela cânula pode criar um túnel entre os dois poços, o que tem o efeito de deformação do gradiente e permitindo que as células a mover-se livremente através do eléctrodo de destino. É crucial que a pressão de vácuo usado para aspirado o plug gel é baixo para evitar comprometer a integridade do poço de agarose.

Nós descobrimos que as variações na percentagem de agarose usada no gel pode diferenciar células que expressam os defeitos do citoesqueleto de células do tipo selvagem, o que sugere que esta manipulação pode ser usado para interrogar as forças que as células podem exercer no seu ambiente. Se o gel desidrata durante a cultura, as alterações irão ocorrer que influenciam os resultados experimentais, incluindo um aumento relativo da rigidez gel que retarde o movimento célula e um aumento na concentração de soluto que iria diminuir a impedância total do sistema.

O ensaio é compatível com a medição do movimento por leucócitos e outros tipos celulares que não permitem o fluxo de corrente através do corpo da célula. Esta não é uma característica universal de células: as células nervosas e algumas células epiteliais (por exemplo) poderia transmitir corrente através do corpo da célula e produzindo, assim, muito mais baixa resistência values por célula individual.

Embora estas abordagens são especificamente definidos para detectar respostas celulares a gradientes quimiotáticos, é fácil de imaginar o ensaio como igualmente aplicável a estudos que envolvem a metástase e os sinais extracelulares que melhoram a movimentação das células metastático. Além disso, existem configurações de matriz adicionais que podem ser utilizados em outros estudos célula-substrato de interacção.