Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

1. ECIS / Taxis elektrode Voorbereiding

1. Het goud oppervlak van de ECIS / taxi elektrode (bestaande uit 8 kamers per dia) wordt eerste gestabiliseerd door voorbehandeling met steriele 10 mM cysteine ​​in gedeïoniseerd water (DH ₂ O) gedurende 15 min bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden.
2. Zuig het cysteine ​​oplossing van elke elektrode kamer 3 keer spoelen met steriel dH ₂ O en vervangen door 250 ul volledig medium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES buffer).
3. Sluit de elektrode array pinnen op instrument array houder contact op te nemen elektrode controle uit te voeren.
4. Chambers die goed zijn aangesloten zullen worden gemarkeerd in het groen op het computerscherm. Als de kamers zijn rood gekleurd, zijn ze niet aangesloten en de elektrode moet opnieuw worden gepositioneerd in de array houder contacten voor alle kamers vast te stellen.
5. Als alle kamers zijn aangesloten, klikt u op de knop "controleren" in de software-controller te ontmoedigenMijn de eerste weerstand en capaciteit voor elke kamer. Weerstand waarden moeten tussen 1600 en 2000 ohm, en capaciteit waarden moeten tussen de 5 en 6 enkele nanofarad voor een 8 kamer array. Als een kamer is binnen deze aanvaardbare grenzen moeten de afzonderlijke kamer niet worden gebruikt om gegevens te verzamelen.
6. Maak de elektrode-array houder aan de individuele agarose kamers voor te bereiden. Zuig medium van de kamers en was elke kamer 3 keer met steriele dH ₂ O.

2. Voorbereiden Agarose Chambers

1. In een steriele 15 ml polypropyleen conische buis, meten 0,03 g Seakem GTG agarose en voeg 1 ml steriele PBS. Losjes Plaats dopje, en smelt de agarose in een autoclaaf gedurende een 2 min. vloeistof cyclus (het smelten in de magnetron is niet effectief voor deze test). Deze korte tijd zal niet smelten de conische buis. Voor minder veeleisende cellen die geen serum voor cultuur, (bijv. Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose kan in het geschikte medium en gesmolten in een magnetron. De autoclaaf dient voor cellen die nodig serum, zoals dit wordt gedenatureerd als gesmolten magnetron.
2. Voeg 5 ml volledig RPMI medium verwarmd in een waterbad (55 ° -60 ° C) rechtstreeks op het hete agarose, tot een eindconcentratie van 0,5% agarose en pipet en zachtjes te mengen.
3. Pipetteer 300 ul gesmolten agarose medium in elke kamer vervangen ECIS / taxi matrix deksel en laat gel bij kamertemperatuur.
4. Pipet resterende agarose in de limiet van 15 ml buis om agarose geleren te beoordelen. Deze overmaat agarose wordt ook gebruikt in deel 4: snijden putten in agarose.

3. Construeren en slijpen de canule goed Cutting Tool

1. Verscherpen twee 14 gauge stomp uiteinde canules met behulp van een 5/64 "bit. Draai de punt van de boor in elk canule opening met een lage snelheid boren, het maken van bepaalde de boor snijdt gehele interieur rand van elke canule opening een scherpe snijkanten (figuur 4A) vormen.
2. Twee gaten door een "x 2" x ¼ "plexiglas (figuur 4B-D) met een 5/64"-bit in een kolomboormachine. Plaats elke geslepen 14 gauge canule dus het steekt op gelijke afstand door elk plexiglas gat.

4. Snijden Wells in Agarose

1. Steriliseer de 14 meter canules door licht vlammende de tips. Voor het snijden putten in de ECIS kamer kan de canules afkoelen tot kamertemperatuur of koelen canules door op de agarose in het deksel van de buis van 15 ml. Als de temperatuur van canule te hoog is, zal de agarose smelten de kamer putten worden gesneden, waardoor de putjes misvormde en defect.
2. Lijn de canule paar boven de twee punten gold rond het doel elektrode in elke kamer (figuur 2c en 5). Plaats de canule verticaal, zonder enige horizontale beweging, stoppen dat bij lichte contact tussen de canule enhet elektrodemateriaal. Verwijder voorzichtig de canule, wederom zonder enige horizontale beweging. Plaatsing van extra putten voor verzet tegen hellingen is ook mogelijk met een herconfiguratie van de canule mal.
3. Zuig voorzichtig het agarose stekker achtergelaten door de canule, met behulp van een steriele 9 "Pasteur pipet, verbonden met laag vacuüm druk, met een stofzuiger val agarose afval op te vangen.
4. Voeg 300 ul volledig RPMI medium om het oppervlak van elke kamer bij 37 ° C, 2 min de agarose verzadigen en voorzichtig het medium uit het oppervlak en de putjes zuig zonder de agarose.

5. Het laden van de Wells

1. Elk goed kan met een volume van 7 pi. Om een ​​goed in elke kamer, voeg 7 pl van cellen schorsing. Voor Jurkat T-cellen gebruikt twee x10 ⁷ cellen / ml. Deze cellen reageren 7 pi van 200 ng / ml SDF-1α verdund in volledig RPMI dat ontbreekt serum. Gebruik alleen complete media als een negatieve contRol.
2. Na de putten worden geladen, bekijkt u elke kamer van de array met een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat alle putjes werden gesneden en naar behoren invullen. De cellen moeten in binnen de grenzen van de grens van de put. Als ze worden gezien in beide putten, of verspreiden buiten cel goed grens, dan is een kloof gevormd onder de agarose. Let op de onjuiste plaatsing putten, aangezien de gegevens niet betrouwbaar kan worden geïnterpreteerd van die kamers.

6. Data Collection

1. Plaats de elektrode in de array houder en de gouden pads op de elektrode-array opnieuw een verbinding met de veerbelaste pogo pennen van de houder en klik op "setup". De putten die goed zijn aangesloten zullen worden groen gemarkeerd. Indien de putten rode, niet aangesloten en de elektrode gepositioneerd worden in de array houder.
2. Selecteer "8WE1" (8 en een elektrode) uit het drop down menu in de software-paneel aan de array configuratie aan te geven.
3. Selecteer "check" in de software control paneel de eerste weerstand en kapaciteitswaarden bepalen elke wel. De weerstandswaarden moet tussen 1600 en 2000 Ohm, terwijl de kapaciteitswaarden tussen de 5 en 6 nanofarad.
4. Selecteer meerdere frequenties om de weerstand te meten op verschillende frequenties. Er is een keuze uit het aanpassen van de frequenties, of met behulp van een set van aanbevolen frequenties. De standaard van verschillende frequentie overname instellingen vastleggen van gegevens bij 11 vooraf ingestelde frequenties (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 en 64.000 Hz) met een snelheid van 8 wells / min. Het tijdsinterval tussen de metingen kunnen ook worden aangepast. Het verzamelen van verschillende frequentie gegevens kunnen voor analyse van de capaciteit, impedantie en weerstand. Het verzamelen van weerstandswaarden bij 4.000 Hz is meestal voldoende voor zoogdiercellen chemotaxis studies, maar de extra frequenties kunnen informatie te verstrekken in een andere context ^12,13.
5. Totale duur van het experiment kan worden ingesteld, aan de rechterkantpaneel, of het experiment kan handmatig worden gestopt, door te klikken op "finish" een keer cellen zijn geproduceerd weerstand die indicatief zijn voor aankomst op de elektrode. De tijd die cellen te komen tot de elektrode afhankelijk van de gebruikte celtype.
6. Klik op "Start" om het verzamelen van gegevens te starten.

7. Gegevensbeheer

1. Hoewel de gegevens kunnen worden geëxporteerd naar Excel, de ECIS 1600R software, die de ECISθ systeem begeleidt is de meest efficiënte methode om ECIS / Taxis gegevens te analyseren.
2. De software analyse tool balk bevat de keuzerondjes Z, R en C. Deze bepalen of impedantie, weerstand of capaciteit respectievelijk wordt uitgezet op de verticale as de x-as (verstreken tijd).
3. ECIS / Taxis data wordt zo efficiënt mogelijk weergegeven als weerstand na verloop van tijd bij 4.000 Hz. Snelle fluctuaties in resistentie of microtransients (figuur 1), wijzen op cellulaire beweging over de elektrode. Compileren, or binning de datapunten, zodat niet alle punten in een grafiek weergegeven, wordt niet aanbevolen voor ECIS / taxi's, omdat het gemiddelde microtransients uit van de gegevens.
4. Als de grafiek is gemaakt met de ECIS1600R software kan worden geëxporteerd door te kiezen voor "export grafiek" in het menu Bestand, en opgeslagen als een. Tif of. Jpg-bestand.

8. Representatieve resultaten

Cellulaire chemotaxis wordt door een toename van resistentie bij 4000 Hz. De komst van cellen op de trefplaat elektrode wordt ook aangegeven door het verschijnen van snelle fluctuaties in weerstand genoemd microtransients of microbewegingen zoals beschreven in Opp et. al. 2009 (figuur 1) ^14. Een negatief resultaat wordt door consistent of een lichte afname, weerstand bij 4000 Hz, gezien in rood in figuur 1. De afwezigheid van microtransients is ook een teken van het ontbreken van cel beweging aan de elektrode. De verhoogde weerstand direct progepasseerde nummer cellen die de elektrode ¹⁰ te steken. De toevoeging van monoklonaal antilichaam specifiek voor een of chemoattractant toxinen bekend interfereren met G-eiwit gekoppelde receptoren te blokkeren chemotaxis ^11.

Figuur 1. Chemotaxis Humane T Jurkat cellen in reactie op SDF1α. Human Jurkat T-cellen (2.0x10 ⁶ cellen / ml) werden blootgesteld aan een helling van SDF-1α (beginconcentratie 100 ng / ml) of RPMI 1640 als negatieve controle. De genormaliseerde weerstand bij 4000 Hz is opgenomen. Menselijke Jurkat T-cellen bewogen in reactie op SDF-1α, zoals blijkt uit de toename van de weerstand en microtransients, terwijl geen beweging waargenomen bij blootstelling aan RPMI 1640.

Figuur 2. Bovenaanzicht van een ECIS / Taxis Elektrode without agarose. Elke ECIS / Taxis elektrode bestaat uit 8 afzonderlijke ruimten. Elke kamer deelt grote elektrode (a) en bevat een individuele doelstelling elektrode (b). Elke kamer ook 2 goud cirkels (c) die worden gebruikt als richtlijn bij het snijden van de putten in de agarose met canules. Het goud vierkantjes (d) de contactvlakken die aansluiten op de pogo pennen om de wisselstroom toepassing op de elektrode. De individuele doel elektroden elk in circuit met grotere tegenelektrode (e).

Figuur 3. Twee Wells worden gesneden in elke agarose-gevulde kamer. Wanneer de chemoattractant wordt toegevoegd aan een goed verspreidt het om een gradiënt in de agarose te creëren, met de hoogste concentratie van chemoattract het dichtst bij de chemoattractant goed. De cellen reizen onder de agarose in de richting van hogere concentraties van chemoattractant en kan gaan over het doel elektrode. Alsde cellen steekt het doel elektrode, een toename van resistentie geregistreerd door de ECIS 1600R software.

Figuur 4. Het inbrengen van twee 14 gauge canules in plexiglas. A) een 5/64 "boor wordt gebruikt om de canule tip scherper te maken. B) Twee gaten worden geboord in plexiglas op de 14 meter canules geschikt volgens de lay-out opname. C) Gebruik een boor druk op om de gaten te garanderen zijn loodrecht aan de pleixglass oppervlak. D) Twee geslepen Canules worden ingebracht via ¼ "plexiglas, 2 mm van elkaar (gemeten vanaf de binnenranden). Deze geslepen canules worden zorgvuldig ingebracht in agarose aan de putjes te snijden.

Figuur 5. Het uitlijnen van canules met gouden stippen in ECIS / Taxi's kamer. Om putten te snijden, moet de geslepen canulesworden gebracht met het goud stippen flankerende het doel elektrode op de bodem van de ECIS / Taxis kamer. De catheter moeten verticaal ingebracht, zonder enige horizontale beweging en verwijderd op dezelfde wijze.

Nieuwe kenmerken van de ECIS / Taxis test zijn onder meer de mogelijkheid om het verzamelen van real-time data te automatiseren als cellen reageren op chemoattractant. Hoewel de meest voorkomende toepassing van deze technologie is het cellulaire reacties te meten aan de individuele chemotactische hellingen, of om hellingen bestaan ​​uit mengsels van chemotaxis agonisten en antagonisten van de ECIS / Taxi's benadering is ook vatbaar is voor variaties op deze configuraties die kunnen heel nuttig zijn bij de beoordeling van de cellulaire respons. Er zijn duidelijke aanwijzingen dat de overlappende of opeenvolgende hellingen kan cellulaire gedrag te beïnvloeden op nieuwe manieren. Bovendien is waarschijnlijk dat deze meer complexe verlopen de norm in situ ^{12, 13.}

De ECIS / Taxi's test kan mogelijk modelleren van deze verschillende gradiënt configuraties op een manier die niet mogelijk zijn met andere technologieën. Bijvoorbeeld door extra bronnen kan men verdelen de oriëntatie van de gradient (s) ten opzichte van de cel en en doel elektrode. Het is ook mogelijk om de analyse te configureren cellen plaatsen in een van de putten als bron van chemotactische factoren.

Bij het instellen van de assay, is het belangrijk om volledige hydratatie van de gel het doel en tegenelektroden in elke kamer overlapt behouden en de putjes de juiste ruimtelijke verhouding tot het doel elektrode te verbreken. Bovendien is de bodem van de cel moet zijn en grenzen aan de dunne film van vloeistof vormt in de agarose laag, is in deze film dat de cellen zullen bewegen in reactie op het bovenliggende gradiënt. Om dit te doen, moet men zuigen alle agarose plug zonder dat daarbij gel fragmenten achter. Het verwijderen van de plug agarose doorsnede in de canule kan een tunnel tussen de twee putten die het effect vervorming van de gradiënt en waarbij de cellen vrij over het doel elektrode. Het is van cruciaal belang dat de vacuüm-druk gebruikt om aspverbolgen de gel stekker laag is te voorkomen dat de agarose integriteit van de put.

Wij hebben gevonden dat variaties in het percentage agarose in de gel cellen die cytoskelet defecten drukken van wild-type cellen, suggereert dat deze bewerking kan worden gebruikt om de krachten die cellen kunnen uitoefenen op hun omgeving onderscheiden ondervragen. Als de gel uitdroogt tijdens het cultuur, zullen veranderingen optreden die van invloed zijn de experimentele resultaten, met inbegrip van een relatieve toename van de gel stijfheid die cel beweging en een toename van de opgeloste concentratie die totale systeem impedantie zou afnemen zou vertragen.

De test is compatibel met de meting van beweging van leukocyten en andere celtypen die stroom niet mogelijk door het cellichaam. Dit is geen algemene eigenschap van cellen: zenuwcellen en een epitheelcellen (bijvoorbeeld) kan zenden stroom door het cellichaam, en daardoor veel lagere weerstand waardevollees per individuele cel.

Hoewel deze benadering worden bepaald gedefinieerd cellulaire respons sporen chemotactische verlopen, is het gemakkelijk om de assay stellen soortgelijke wijze voor onderzoeken met metastase en de extracellulaire signalen metastatische cel beweging verbeteren. Bovendien zijn er extra array configuraties die gebruikt kunnen worden in andere cellen substraatinteractie studies.