Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle

1. Herstellung von Zellen

1. Wachsen Hypophyse AtT20-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Pferdeserum und aufrechtzuerhalten Kulturen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ ergänzt.
2. Pflegen Sie die Kultur durch Subkultivierung der Zellen alle 5 bis 7 Tage mit einem Standard-Verfahren Trypsinierung.
3. Die Vertiefungen von schwarzen, klaren unten, 96-well Platten mit 50 ul von Poly-L-Lysin. Die Vertiefungen für 30 Minuten in den Inkubator zu trocknen.
4. Tafel die Zellen in den Platten mit 96 Vertiefungen, enthaltend 200 ul Medium bei einer Dichte von 30.000 Zellen pro Vertiefung und Lagerung der Zellen in dem Inkubator für 3-4 Tage.
5. Verwenden eine Aspiration Setup, bestehend aus einem verschlossenen 4-Liter-Flasche mit einer Vakuumquelle an einem Ende und einem 200 ul Pipettenspitze an dem anderen Ende, langsam absaugen Kulturmedium aus der Zellmonolayer.
6. Waschen Sie die Zellen mit 200 ul normalen Pufferlösung (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 5 mM Dextrose, 5 mM HEPES, pH 7,4 mit NaOH).
7. Geben Sie 200 ul Puffer Lösung, die das Membranpotential-sensitiven Farbstoffs (MPD) DIBAC ₄ (3) oder HLB 021-152 (5 pM) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen für 40 min bei 37 ° C

2. Vorbereitung der Testverbindungen und Cell Treatment

1. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der Testverbindungen (Standard = 10 mM in DMSO) aus einer Verbindung Bibliothek (in 96-Well-Format) mit einer Versette (ThermoFisher) automatisierte Liquid-Handling-System.
2. Entfernen Sie die 96-Well Platte, welche die AtT20 Zellen aus dem Inkubator und damit die Platte an die Raumtemperatur anpassen. Absaugen der alte Puffer und durch frisches Pufferlösung, die die MPD an die Zellen.
3. Mit der Liquid-Handling-System anwenden verschiedenen Konzentrationen (10 nM bis 10 pM) der Testverbindungen (2 bis 20 ul) und Control-Lösungen (0,1% DMSO) (in Pufferlösung containing der MPD) an die 96-Well-Platte mit den Zellen.
4. Inkubieren der Zellen für 5 min mit Testverbindungen vor der Fluoreszenz-Messungen.

3. Die Aktivierung von GIRK Kanäle, Neonlicht Messung und Analyse

1. Legen Sie die 96-Well-Platte in eine Biotek Synergy2 fluoreszierenden Platte Leser und erhalten Sie die fluoreszierenden Hintergrund Signal an Anregungs-und Emissionswellenlänge von 520 und 560 nm auf.
2. Anwenden der GPCR-Liganden (Somatostatin = 200 nM oder Carbachol = 10 pM) oder Kontroll-Lösung (Puffer allein) (20 mL) in die Vertiefungen (Gesamtvolumen = 220 mL), um die Kanäle mit den GIRK Synergy2 Injektor zu aktivieren. Daten sammeln Punkte bei 10 s Intervallen über einen 300 s Abtastperiode bei Anregungs-und Emissionswellenlänge von 520 und 560 nm auf.
3. Besorgen Sie den zeitlichen Verlauf und Spitze-Amplitude des fluoreszierenden Änderung über Biotek Gen5 Software und exportieren Sie die Daten nach Excel zur weiteren Analyse. Berechnen Sie die Z'-Faktor, um die Zuverlässigkeit des Tests zu bestimmen. Platten für Z'-Faktor Bestimmung verwendet wurde, enthielt zwei Reihen von jeweils positiv (GPCR-Liganden) und negativen (Puffer allein) Kontrollen. Die Z'-Faktor ist definiert als: Z '= 1 - _(P + 3σ 3σ _N) / | μ _P - μ _N |, wobei μ μ _P & _N sind das Mittel der positive und negative Steuersignale und &sgr; _P & · _N sind die Standardabweichungen der positive und negative Steuersignale, bzw. ^6. Z'-Faktoren im Bereich von 0,5 bis 1,0 zeigen, dass die Qualität des Assays ausgezeichnete ⁶ ist. Platten mit Z'-Faktoren unter 0,5 werden aus der Analyse ausgeschlossen.
4. Verbindungen, die die Fluoreszenz-Signal modulieren, werden in Gegenwart von Ba ^{2 +} oder tertiapin-Q erneut getestet, um Einwärtsgleichrichter K ^+-Kanal Spezifität zu bestätigen.

4. Repräsentativer Ergebnisse

Ein Beispiel des Fluoreszenzsignals unter Verwendung des GIRK Kanal Assay wird in 2 gezeigt. Die Zugabe des GPCR-Liganden Somatostatin (200 nM), um den AtT20-Zellen verursachte eine schnelle, zeitabhängige Abnahme der HLB 021-152 Fluoreszenzsignal (2). Im Gegensatz dazu erzeugte Zugabe von Kontrolllösung eine kleine schnelle Anstieg in der Fluoreszenz, die mit der Zeit auf die Grundlinie zurück (Abb. 2). Vergleich der Spitzenwert Fluoreszenzwerte in 96-Well-Platten mit Steuerung und Somatostatin-Lösungen injiziert hat eine Z'-Faktoren im Bereich von 0,5 bis 0,7. Für weitere Quantifizierung wurde die Kontrolle Datensatz aus der Somatostatin-Rekord subtrahiert und der resultierende Somatostatin-und Kleinschreibung Signal analysiert (Abbildung 2).

Der Test stellt ein Verfahren zur schnellen Identifizierung Medikamente, die GIRK Kanäle modulieren. Zum Beispiel Medikamente, die Hemmung der GIRK channel sollte GPCR-Liganden-vermittelte Abnahme der Fluoreszenz, indem verhindert wird K ^+-Ausstrom aus den Zellen zu reduzieren. Wie in 3, der Behandlung der Zellen mit tertiapin-Q, ein Toxin gezeigt, dass Blöcke GIRK Kanäle ^7, die eine Hemmung der Somatostatin-vermittelte Fluoreszenz Änderung hergestellt. Propafenon, ein Antiarrhythmikum, dass die Blöcke GIRK Kanäle im Herzen ^8, inhibierte auch den fluoreszierenden Änderung (Abbildung 4). Der Assay kann auch nützlich sein zur Identifizierung von Aktivatoren der GIRK Kanal. Die Anwendung dieser Ethanol (100 & 200 mM), verursacht ein Aktivator des Kanals GIRK ^2,3, keine signifikante Veränderung des Fluoreszenzsignals im Vergleich zur Lösung (p> 0,5) zu steuern.

Abbildung 1. Experimentelle Gestaltung des GIRK Kanal Fluoreszenz-Assay. AtT20-Zellen werden in einem Puffer mit einer Membran inkubierte Potential Fluoreszenzfarbstoff (D). Die Farbstoffmoleküle geben Sie in die Zellen und werden nach der Bindung an intrazelluläre Proteine ​​(oben) fluoreszierend. Die Bindung von Somatostatin (SOM) in seine GPCR stimuliert die inhibitorische Protein G (G _i) bewirkt die Aktivierung des GIRK Kanal (unten). Die anschließende Efflux von K ⁺ aus der Zellen bewirkt, dass das Membranpotential weiter in den negativen und die Farbstoffmoleküle, um die Zellen zu verlassen. Als Ergebnis können die Fluoreszenzsignal abnimmt (unten).

Abbildung 2. Vertreter HLB 021-152 Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit in den AtT20 Zellen während der Zugabe von Somatostatin-oder Kontroll-Lösung gemessen. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität (F / F _O) wurde durch Teilen des Signals in Gegenwart (F) von Somatostatin (oder Kontroll-Lösung) von der Grundlinie Signal vor (F _O) gemessen wird, berechnet addition von Somatostatin (oder Control-Lösung). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE in 5-6 Vertiefungen erhalten. Somatostatin oder Kontrolle wurde zum Zeitpunkt Null (↓) zugegeben. Die Zugabe des Kontrolllösung führte zu einer geringen vorübergehender Anstieg des Fluoreszenzsignals. Dies resultiert aus einer Temperaturänderung durch Injektion der Lösung verursacht.

3. Behandlung der Zellen mit AtT20 tertiapin-Q (500 nM) hemmt die Somatostatin-vermittelte Abnahme der Fluoreszenz-Signal durch Bindung an und blockiert die GIRK Kanäle. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE in 4-6 Brunnen erhalten. Somatostatin wurde zum Zeitpunkt Null (↓) zugegeben.

Abbildung 4. Die Behandlung der Zellen mit AtT20 Propafenon (20 uM) hemmt auch die Somatostatin-vermittelten Abnahme derdas Fluoreszenzsignal. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SE in 5-6 Vertiefungen erhalten. Somatostatin wurde zum Zeitpunkt Null (↓) zugegeben.

Während Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe verwendet wurden, um Medikamente, die Ionenkanäle modulieren ^9,10 zu identifizieren, ist dies der erste Bericht über ihre Anwendung für die neuronale GIRK Channel Drug Discovery. Die GIRK Kanal Fluoreszenz-Assay hier vorgestellten bietet eine schnelle, zuverlässige und Echtzeit-Methode für das Screening von Liganden-gesteuerte K ^+-Kanäle. Der Assay kann zur Verwendung mit einer Vielzahl von Zellen, einschließlich immortalisierten Zelllinien (HEK293, CHO usw.) Exprimieren eines exogenen rekombinanten GIRK Kanal ¹¹ oder klonalen Zelllinien (AtT20, PC-12) Expression eines endogenen Kanal geändert werden. Darüber hinaus kann der Assay für Durchmusterung von Wirkstoffen in embryonalen Stammzellen und primären Zellkulturen angepasst werden. Wie bei den AtT20-Zellen verwendet, wobei der Assay auch die zusätzlichen Vorteil, dass die Studie von mehreren GPCR-Liganden (Somatostatin und Carbachol) auf der GIRK Kanal. Wie bei jedem Fluoreszenz-Assay, muss die Steuerung Experimente bis e durchgeführt werdenliminate Artefakte aufgrund von Autofluoreszenz verschlimmern und auf Fehler aufgrund direkte Wechselwirkungen der Verbindungen mit den Farbstoff-Moleküle zu identifizieren. Alternative Ansätze wie die Thallium Zustrom Assay ¹¹ und automatisierten Patch Clamp Verfahren ¹² sollte ebenfalls berücksichtigt werden.