En fluoriserende Screening Assay for å identifisere modulatorer av GIRK kanaler

1. Utarbeidelse av celler

1. Grow hypofysen AtT20 celler i Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% hest serum og vedlikeholde kulturer ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO _2.
2. Opprettholde kulturen ved subculturing cellene hver 5 til 7 dager ved hjelp av en standard trypsinization prosedyre.
3. Smør brønner av svart, klar bunn, 96-og tallerkener med 50 mL av poly-L-lysin. La brønnene tørke i 30 min i kuvøse.
4. Plate cellene i 96-brønners plater som inneholder 200 mL media på tetthet av 30.000 celler per brønn og lagre cellene i kuvøse for 3-4 dager.
5. Bruk en aspirasjon oppsett, som består av en korket 4 liter jar koblet til en vakuum i den ene enden og en 200 mL pipette tips i den andre enden, for å sakte aspirer kulturen medium fra cellen monolayer.
6. Vask cellene med 200 mL av normal bufferløsning (132 mM NaCl, 5 mm KCl, 1 mM ₂ CaCl, 1 mM MgCl _2, 5 mm druesukker, 5 mm HEPES, pH 7,4 med NaOH).
7. Tilsett 200 mL buffer løsning som inneholder membranpotensiale-sensitive fargestoff (MPD) DiBAC ₄ (3) eller HLB 021-152 (5 mikrometer) til hver brønn og Inkuber cellene for 40 min ved 37 ° C.

2. Utarbeidelse av Test forbindelser og Cell Treatment

1. Forbered en seriell fortynning av test forbindelser (lager = 10 mm i DMSO) fra et sammensatt bibliotek (i 96-brønnen format) med en Versette (ThermoFisher) automatisert væske håndteringssystem.
2. Fjern 96-brønnen plate, som inneholder AtT20 cellene, fra inkubator og la platen å komme tilbake til romtemperatur. Aspirer av gamle buffer og gjelder fersk bufferløsning som inneholder MPD til cellene.
3. Bruke flytende håndteringssystem anvende ulike konsentrasjoner (10 nm til 10 mm) av testen forbindelser (2-20 mL) and Control Solutions (0,1% DMSO) (i buffer løsning containing MPD) til 96-brønnen plate som inneholder cellene.
4. Inkuber cellene i 5 min med test forbindelser før de fluorescerende målingene.

3. Aktivering av GIRK kanaler, fluoriserende Måling og analyse

1. Sett 96-brønnen plate inn i en BioTek Synergy2 fluorescerende plateavleseren og få den fluorescerende bakgrunn signal ved eksitasjon og emisjon bølgelengder av 520 og 560 nm, henholdsvis.
2. Påfør GPCR ligander (somatostatin = 200 nM eller carbachol = 10 mm) eller kontrolløsning (buffer alene) (20 mL) til brønnene (totalt volum = 220 mL) for å aktivere GIRK kanal med Synergy2 injektoren systemet. Samle data poeng på 10 s intervaller over en 300 s prøvetaking periode på eksitasjon og emisjon bølgelengder av 520 og 560 nm, henholdsvis.
3. Skaff deg tid kurset og peak amplitude av fluorescerende endring med BioTek Gen5 programvare og eksportere data til Excel for videre analyse. Beregn Z'-faktor for å bestemme påliteligheten av analysen. Plater som brukes til Z'-faktor bestemmelse inneholdt 2 rader hver av positiv (GPCR ligand) og negativ (buffer alene) kontroller. Den Z'-faktoren er definert som: Z '= 1 - (3σ _P + 3σ _N) / | μ _P - μ _N |, der μ _P & μ _N er midlene til den positive kontrollen og negative styresignaler, og σ _P & σ _N er standardavvikene på den positive kontrollen og negative kontroll-signaler, henholdsvis ^6. Z'-faktorer i området 0,5 til 1,0 viser at kvaliteten på analysen er utmerket ^6. Plater med Z'-faktorer nedenfor 0.5 er ekskludert fra analysen.
4. Forbindelser som modulerer den fluorescerende signal er retested i nærvær av Ba ^{2 +} eller tertiapin-Q for å bekrefte innover likeretter K ⁺ kanal spesifisitet.

4. Representative Resultater

Et eksempel på fluorescens signalet målt med GIRK kanalen analysen er vist i figur 2. Tilsetning av GPCR ligand somatostatin (200 nm) til de AtT20 cellene forårsaket en rask, tidsavhengig nedgang i HLB 021-152 fluorescerende signal (figur 2). I kontrast, produserte tillegg av kontroll løsning en liten umiddelbar økning i fluorescens som med tiden tilbake til baseline (figur 2). Sammenligning av topp fluorescerende verdier i 96-brønners plater injisert med kontroll og somatostatin løsninger gav noen Z'-faktorer i området på 0,5 til 0,7. For ytterligere kvantifisering, ble kontrollen rekord trekkes fra somatostatin posten og den resulterende somatostatin-sensitive signal analyseres (figur 2).

Analysen gir en metode for raskt å identifisere medikamenter som modulerer GIRK kanaler. For eksempel legemidler som hemmer GIRK channel bør redusere GPCR ligand-mediert reduksjon i fluorescens ved å hindre K ⁺ utstrømming fra cellene. Som vist i figur 3, behandling av cellene med tertiapin-Q, et giftstoff som blokkerer GIRK kanaler ^7, produsert en hemming av somatostatin-mediert fluorescerende endring. Propafenon, en antiarytmiske stoff som blokkerer GIRK kanaler i hjertet ^8, også hemmet fluorescerende endring (figur 4). Den analysen kan også være nyttig for å identifisere aktivatorer av GIRK kanalen. Men bruk av etanol (100 & 200 mm), forårsaket en aktivator av GIRK ^2,3 kanalen, ingen vesentlig endring i fluorescerende signal i forhold til å kontrollere løsning (p> 0,5).

Figur 1. Eksperimentell design av GIRK kanalen fluorescerende analysen. AtT20 celler inkubert i buffer som inneholder en membrane potensial-sensitive fluorescerende fargestoff (D). De fargestoffer inn i cellene og blir fluoriserende ved å binde seg til intracellulære proteiner (øverste panel). Binding av somatostatin (Som) til GPCR sin stimulerer G hemmende protein (G _i) forårsaker aktivering av GIRK kanalen (nederst panel). Den påfølgende effluks av ^K + ut av cellene fører til at membranen potensial til å bli mer negativ og fargestoffer for å gå ut av cellene. Som et resultat av fluorescerende signal avtar (nedre panelet).

Figur 2. Representant HLB 021-152 fluorescerende signal måles over tid i de AtT20 celler under tilsetning av somatostatin eller kontroll løsning. Forholdet mellom det fluorescerende intensitet (F / F _O) ble beregnet ved å dividere signal i nærvær (F) av somatostatin (eller kontroll løsning) ved baseline signal måles før (F _O) addition av somatostatin (eller kontroll løsning). Hvert punkt representerer middelverdien ± SE innhentet i 5-6 brønner. Somatostatin, eller kontroll-løsning ble lagt på gangen null (↓). Tilsetting av kontrollen løsning forårsaket en liten forbigående økning i fluorescerende signal. Dette resulterte i en temperaturendring som følge av injeksjon av løsningen.

Figur 3. Behandling av AtT20 cellene med tertiapin-Q (500 nM) hemmer somatostatin-mediert reduksjon i fluorescerende signal ved å binde seg til og blokkerer GIRK kanaler. Hvert punkt representerer middelverdien ± SE innhentet i 4-6 brønner. Somatostatin ble lagt på gangen null (↓).

Figur 4. Behandling av AtT20 celler med propafenon (20 mm) hemmer også somatostatin-mediert reduksjon iden fluorescerende signal. Hvert punkt representerer middelverdien ± SE innhentet i 5-6 brønner. Somatostatin ble lagt på gangen null (↓).

Mens membranpotensiale-sensitive fluorescerende fargestoffer blitt brukt til å identifisere stoffer som modulerer ionekanaler ^9,10, er dette den første rapporten om deres søknad om nevronale GIRK kanal legemiddelforskning. Den GIRK kanalen fluorescerende analysen presenteres her gir en rask, pålitelig og real-time metode for screening av ligand-gated K ^+-kanaler. Analysen kan modifiseres for bruk med et bredt spekter av celler, inkludert udødeliggjorde celler linjer (HEK293, CHO, etc.) som uttrykker en eksogen rekombinant GIRK kanal ¹¹ eller klonal cellelinjer (AtT20, PC-12) som uttrykker en endogen kanal. I tillegg kan analysen være tilrettelagt for screening narkotika i embryonale stamceller og primære cellekulturer. Som brukes med AtT20 cellene, gir analysen også den ekstra fordelen av å la studiet av flere GPCR ligander (somatostatin og carbachol) på GIRK kanalen. Som med alle fluorescent analysen, må kontrollere eksperimenter utføres til eliminate gjenstander på grunn av sammensatte auto-fluorescens og å identifisere feil som følge av direkte interaksjoner av forbindelsene med fargestoffer. Alternative tilnærminger som thallium tilstrømningen analysen ¹¹ og automatisert patch clamp prosedyre ¹² bør også vurderes.