L'utilisation de moyen d'expectoration artificielle pour tester l'efficacité des antibiotiques contre

Sebastian Kirchner¹, Joanne L Fothergill², Elli A. Wright¹, Chloe E. James¹, Eilidh Mowat¹, Craig Winstanley¹

¹Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, ²NIHR Biomedical Research Centre in Microbial Disease, University of Liverpool

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).

Il est de plus en plus préoccupés par la pertinence des tests in vitro de sensibilité aux antimicrobiens lorsqu'ils sont appliqués à des isolats de P. aeruginosa de fibrose kystique (FK) patients. Les méthodes existantes assurée par un seul ou de quelques isolats cultivés en aérobiose et en plancton. Prédéterminés seuils sont utilisés pour définir si les bactéries sont sensibles ou résistantes à un antibiotique donné ^1. Toutefois, au cours des infections pulmonaires chroniques dans les FC, P. populations aeruginosa existent dans des biofilms et il est évident que l'environnement est en grande partie microaérophile ^2. La différence marquée dans des conditions entre les bactéries dans les poumons et ceux lors de tests a remis en question la pertinence de fiabilité et même de ces ³ tests.

Moyennes expectoration artificielle (ASM) est un milieu de culture contenant les composants de l'expectoration patient atteint de mucoviscidose, y compris les acides aminés, et l'ADN de mucine libre. P aeruginosa </ Em> La croissance de la croissance au cours des infections imite ASM FC, avec la formation de biofilm structures d'auto-agrégation et ^4,5,6 divergence de la population. L'objectif de cette étude était de développer un test de microtitrage plaque d'étudier la sensibilité aux antimicrobiens de P. aeruginosa basé sur la croissance à l'ASM, qui est applicable aux deux conditions microaérophiles et aérobie.

Un test a été développé ASM dans un format microplaque. P. biofilms aeruginosa ont été autorisés à se développer pour 3 jours avant l'incubation avec des agents antimicrobiens à des concentrations différentes pour 24 heures. Après la perturbation du biofilm, la viabilité cellulaire a été mesurée par coloration avec la résazurine. Ce test a été utilisé pour déterminer la concentration minimale inhibitrice des cellules sessiles (SMIC) de la tobramycine pour 15 différents P. isolats aeruginosa dans des conditions aérobies et microaérophiles et les valeurs du SMIC ont été comparés à ceux obtenus avec la croissance de bouillon standard. Bien qu'il n'y aitcertains éléments de preuve pour les valeurs de CMI accrues pour les isolats cultivés dans ASM par rapport à leurs homologues planctoniques, les plus grandes différences ont été trouvées avec des bactéries testées dans des conditions microaérophiles, qui ont montré une résistance beaucoup plus porté à un> 128 fois, vers la tobramycine dans le système ASM lors par rapport à des tests réalisés dans des conditions aérobies.

L'absence d'association entre les méthodes actuelles de tests de sensibilité et le résultat clinique a mis en doute la validité des méthodes actuelles ^3. Plusieurs modèles in vitro ont déjà été utilisés pour étudier P. biofilms aeruginosa ^{7, 8.} Cependant, ces méthodes reposent sur ​​des biofilms de surface ci-jointes, tandis que les biofilms ASM ressemblent à ceux observés dans le poumon FC ^9. En outre, la concentration en oxygène réduite dans le mucus a été montré pour modifier le comportement de P. aeruginosa ² et affectent la sensibilité aux antibiotiques ^10. Par conséquent using ASM dans des conditions microaérophiles peuvent fournir un environnement plus réaliste dans lequel d'étudier la sensibilité aux antimicrobiens.

1. Préparation du milieu de crachats artificielle (ASM)

1. Ajouter 4 g d'ADN à partir de sperme de poisson à 250 ml d'eau stérile très lentement sur une période de plusieurs heures. L'ADN prend plusieurs heures pour dissoudre complètement et peut être agité pendant une nuit à température ambiante.
2. Ajouter 5 g mucine de porcins estomac (type II) lentement à 250 ml d'eau stérile jusqu'à ce que la mucine est complètement dissous. La solution peut être agité pendant une nuit à 4 ° C.
3. Dissoudre 0,25 g de chaque essentiels et non essentiels L-aminoacide, à l'exception de L-tyrosine et L-cystéine, dans 100 ml d'eau stérile. Dissoudre 0,25 g de L-cystéine dans 25 ml d'hydroxyde de potassium 0,5 M (M _r 56,11 g / mole) et 0,25 g de L-tyrosine dans 25 ml d'eau stérile.
4. Dissoudre 5,9 mg d'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA), 5 g de NaCl et 2,2 g de KCl dans 100 ml d'eau stérile.
5. Moissonneuse l'ADN, mucine, L-acides aminés, le DTPA, NaCl et KCl dans une bouteille 1 litre.
6. Ajouter 5 ml de jaune d'oeuf emulsion et de remplissage à environ 850 ml avec de l'eau stérile.
7. Ajuster le pH à 6,9 avec 1 M de Tris (pH 8,5, M _r 121.14) et porter le volume à 1 litre avec de l'eau stérile.
8. Stériliser l'ASM par filtration en utilisant une Vacuubrand ME 2 pompe à vide à membrane et Millipore unités Steritop filtre avec une taille de pores et le cou de 0,22 pm et 45 mm, respectivement. Chaque unité Steritop filtre peut être réutilisé immédiatement jusqu'à trois fois, cependant, les filtres doivent être rincés deux fois avec de l'eau stérile avant de les réutiliser. Le processus de filtration est lente et peut être réalisée sur 2 jours. D'autres versions de l'ASM ont été développés qui utilisent le plus d'antibiotiques au lieu de filtration ¹¹ Cependant, en raison des interactions médicamenteuses possibles, nous ne recommandons pas la méthode pour cette application particulière.
9. Non filtrée et filtrée ASM doivent être conservés à 4 ° C dans l'obscurité. Utilisation de frais ASM est toutefois recommandé, il peut être maintenu dans ces conditions pour une durée maximale d'un mois.

   2. Détermination de la planctoniques minimum cellule de concentration inhibitrice sessile métabolique (PSMIC)

   1. Pour déterminer la concentration minimale inhibitrice métabolique (PSMIC) des valeurs de 15 plancton cultivé P. isolats aeruginosa, la méthode de microdilution doit être effectuée, comme décrit dans les lignes directrices de la British Society for chimiothérapie antimicrobienne BSAC ^12. L'antibiotique de choix, dans ce sulfate de tobramycine cas, est dilué en série dans du milieu Luria-Bertani (LB) dans une plaque de microtitration à 96 puits pour fournir une gamme appropriée de concentrations d'antibiotiques.
   2. Diluer cultures d'une nuit de P. aeruginosa dans LB jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,05 (± 0,01) et ajouter 100 volumes ul dans les puits de la microplaque de 96 puits contenant 100 pi de l'antibiotique dilué en série. Dans ce cas, les concentrations finales de la tobramycine sulfate variait entre 512 à 0,5 pg / ml. Huit répétitions de chaque ANTIBconcentration iotic doit être effectuée.
   3. Puits témoin négatif pour chaque isolat doit être mis en place, dans lequel aucun antibiotique est ajouté. En outre, huit puits doit contenir LB uniquement pour une utilisation en tant que vierge lors de l'analyse en aval (section 2.6).
   4. Incuber les plaques à 96 puits de microtitration pour 1 - 2 jours à 37 ° C sans agitation dans des conditions aérobies ou microaérophiles (5% O _2, 10% de CO _2, et 85% N _2). Microaérophilie sont obtenus grâce aux modules de génération de gaz CampyGen dans de grandes jarres anaérobies.
   5. Après l'incubation, la croissance bactérienne est déterminée en mesurant l'absorbance de la culture bactérienne dans chaque puits à une longueur d'onde de 600 nm en utilisant un lecteur de microplaques Fluostar Omega et le logiciel d'analyse des données MARS.
   6. L'absorption à partir des cultures planctoniques antibiotiques traités (A _{cellules planctoniques antibiotiques traités)} et l'absorption des contrôles négatifs (un _{contrôle négatif)} doit être corrigée par soustractionion de l'absorbance de fond obtenu à partir de la LB puits ne contenant que (Un _blanc). Le pourcentage d'inhibition de la viabilité est ensuite calculé comme (moyenne ± _{cellules planctoniques antibiotiques traités} / moyenne Un _{contrôle négatif)} x 100%. Le PSMIC ₉₀ est défini comme la concentration en antibiotique provoquant une inhibition de la croissance 90% planctoniques bactérienne.
   7. Pour déterminer la viabilité bactérienne après traitement avec l'antibiotique de choix, 10 pl de 0,02% (v / v) résazurine (dilué dans de l'eau distillée) est ajouté à chaque puits et les plaques sont incubées dans des conditions aérobies pendant 1 - 2 h à 37 ° C, tout en agitant à 150 rpm. Les cellules viables permettra de réduire le colorant bleu résazurine à la forme résorufine rose fluo.
   8. Après incubation avec la résazurine, à surveiller la fluorescence de chaque puits en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 540 nm et une longueur d'onde d'émission de 590 nm dans un lecteur de microplaque Fluostar oméga. Les données doivent être analysées comme décrit êtrebas.

   3. Détermination du biofilm portable concentration inhibitrice minimale sessile (BSMIC)

   1. Cultures pendant la nuit de P. aeruginosa (dans ce cas, 15 isolats de P. aeruginosa sont utilisés) doivent être dilués dans du LB jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,05 (± 0,01), 1:100, puis diluée à l'ASM frais (volume total 1,8 ml).
   2. Les cultures dilué (1,8 ml) doit être ajouté à chaque puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissus traités. Trois puits doit contenir ASM uniquement pour une utilisation en tant que vierge lors de l'analyse en aval (section 3.9).
   3. Fixer les plaques à 24 puits avec de laboratoire parafilm et incuber pendant 3 jours dans des conditions aérobies ou microaérophiles à 37 ° C, tout en agitant à 75 rpm. Microaérophilie devrait être obtenue en utilisant CampyGen paquets de génération de gaz dans de grandes jarres anaérobies.
   4. Diluer l'antibiotique de choix, dans ce sulfate de tobramycine cas, de fournir une gamme de concentration appropriée en eau douceASM. Dans ce cas, les concentrations finales se situait entre 512 à 1 ug / ml. Ajouter à chaque concentration de l'antibiotique, dans des volumes de 200 pi, dans les puits appropriés des plaques à 24 puits. Quatre répétitions de chaque concentration d'antibiotique doit être effectuée. Les biofilms ne sont pas exposés à l'antibiotique de choix ont été utilisées comme contrôle négatif.
   5. Fixer les plaques à 24 puits avec de laboratoire parafilm et incuber dans des conditions aérobies ou microaérophiles pour encore 24 h à 37 ° C, tout en agitant à 75 rpm.
   6. Après une incubation en présence de l'antibiotique de choix, de perturber les biofilms bactériens en utilisant 100 pi de 100 mg / ml de cellulase (dilué dans tampon 0,05 M de citrate [9,6 g / l Citrate.H ₂ 0 dans l'eau et le pH à 4,6 avec NaOH] ) et incuber les plaques à 24 puits dans des conditions aérobies à 37 ° C, tout en agitant à 150 rpm pendant 1 h. Si nécessaire, les biofilms pourrait être perturbé par pipetage manuel à ce stade.
   7. Pour déterminer les activités métaboliquesdes cellules bactériennes libérées par les biofilms perturbé, 100 pi de 0,02% (v / v) résazurine (dilué dans de l'eau distillée) devraient être ajoutés à chaque puits des plaques à 24 puits et incubées pendant 1 à 2 h à 37 ° C , tout en agitant à 150 rpm.
   8. Après incubation avec la résazurine, mesurer la fluorescence de chaque puits en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 540 nm et une longueur d'onde d'émission de 590 nm dans un lecteur de microplaque Fluostar oméga et le logiciel d'analyse des données MARS.
   9. Fluorescence provenant des biofilms antibiotique F-imprégnées _{(antibiotique traités biofilms)} et de la fluorescence à partir des contrôles négatifs (F _{commande négative)} doit être corrigé par soustraction de la fluorescence de fond obtenu à partir des puits contenant l'ASM que (F _flan). Le pourcentage d'inhibition de la viabilité est ensuite calculé comme (moyenne de F _{antibiotiques biofilms traités} / F signifie un _{contrôle négatif)} x 100%. Le BSMIC ₉₀ est défini comme le antibioconcentration entraînant une inhibition tic 90% de l'activité métabolique.

   4. Les résultats représentatifs

   La formation de biofilm ASM est possible dans les petites (2 ml) volumes et les biofilms sont entièrement formées dans les 3 jours (figure 1A). Ceci peut être démontré en se conformant rigoureusement pipetage du biofilm, ce qui devrait être difficile à perturber. Les microcolonies sont comparables à celles qui sont cultivées dans de plus grands volumes ⁴ (figure 1B). La figure 2 montre des différences importantes entre les cellules cultivées plancton et dans un biofilm, tel que détecté par analyse d'image au microscope électronique. Cultures biofilms montrent clairement des niveaux considérables de la matrice extracellulaire qui entoure les cellules et les structures individuelles au sein du biofilm sont difficiles à identifier.

   Plusieurs études suggèrent que le mode de vie biofilm peut affecter la sensibilité aux antimicrobiens ^{13, 14.} Notre petite échelle dosage ASM peut être utilisé pour détérmine l'BSMIC de plusieurs antibiotiques des isolats multiples en même temps. Le flux de travail de l'essai est illustré à la figure 3. L'effet des antibiotiques sur la viabilité de la cellule bactérienne peut être mesurée à l'aide du test à la résazurine. Les antibiotiques, dans ce cas la tobramycine, peut être ajouté à la biofilm établi et mis à incuber pendant 24 h. Après ce biofilm est perturbé et la résazurine est ajouté.

   Cellules métaboliquement actives peuvent réduire le colorant résazurine résultant en un changement de couleur du bleu (résazurine) au rose (résorufine) ^15. La figure 4A montre un dosage exemple dans lequel P. aeruginosa a été incubées avec différentes concentrations de tobramycine avant la perturbation biofilm et l'ajout de résazurine dans une plaque de microtitration. Le bleu non fluorescent de couleur indique les cellules non viables, tandis que les cellules viables de réduire le colorant à la forme rose fluo, résorufine. Le SMIC peut alors être calculée en convertissant la fluorescence en pourcentagerestant la viabilité bactérienne. La figure 4B montre le changement de la viabilité% avec une concentration croissante de tobramycine. La viabilité de 10% a été choisi comme une coupure dans le but de calculer les années ₉₀ SMIC.

   Dans des conditions aérobies, les tobramycine SMIC ₉₀ valeurs sont plus élevées pour les cellules cultivées sous forme de biofilm que ceux des cultures planctoniques. Le tableau 1 montre la variation de PSMIC ₉₀ et ₉₀ pour BSMIC tous les isolats testés. Le tableau 2 montre que dans des conditions aérobies, une augmentation spectaculaire de la résistance à la tobramycine (2 à> 32 fois plus de SMIC) a été observée pour la plupart des isolats lorsqu'ils sont cultivés en ASM (biofilm mode) par rapport à LB (mode planctoniques). En outre, les biofilms cultivées dans des conditions exposées microaérophilie une SMIC augmenté comprise entre 2 et> 128 fois par rapport à biofilm cultivées dans des conditions aérobies.

   
   Figure1. La formation du biofilm de P. aeruginosa dans ASM P. PAO1 aeruginosa souche forme des touffes visibles macroscopiquement (microcolonies) lorsqu'elles sont cultivées à l'ASM. Une formation de biofilms, dans 30 ml cultures ASM (grande échelle) après une croissance de 7 jours à bouchon à vis en verre Duran flacons. B, la formation de biofilms dans les cultures de 2 ml ASM ( à petite échelle) après une croissance de 3 jours dans des plaques de polystyrène de 24 puits.

   
   Figure 2. Micrographies TEM des biofilms ASM A / C TEM micrographie (x; 27.000) de PAO1 grandi plancton et à l'ASM, respectivement, B / D TEM micrographie (x57, 000) de la planctoniques PAO1grown et à l'ASM, respectivement. Bactéries ont été cultivées plancton cultivées durant la nuit dans du bouillon LB. Les biofilms ont été cultivés pendant 7 jours dans les cultures ml 30 ASM. Les flèches noires référence à des cellules dans le biofilm et les étoiles se référer à des espaces extracellulaires. Barres d'échelle = 1um.

   
   Figure 3. Flux de travail de l'essai ASM biofilm sensibilité aux antimicrobiens.

   
   Figure 4. Utilisation de la résazurine pour la détermination de la sensibilité aux antibiotiques Les cellules bactériennes ont été incubées avec différentes concentrations de l'antibiotique et l'activité métabolique restant a été déterminée en utilisant la résazurine. A, Le bleu non fluorescent forme oxydée de la résazurine indique les cellules non viables et est réduite par métabolique cellules actives au rose fluorescent résorufine. B, l'intensité de fluorescence est converti en pourcentage de la viabilité bactérienne restante. La viabilité de 10% a été choisi comme seuil afin de calculer l'MSMIC90. Cliquez ici pour voir LARger la figure.

   Les souches	PSMIC 90 (pg / ml) 1		BSMIC 90 (pg / ml) 1
   	Aérobique	2 microaérophile	Aérobique	2 microaérophile
   PAO1	4	4	8	> 512
   Liverpool souche épidémique (ERP) isole
   LESB58 21	8	64	64	128
   LES400 22	32	128	8	256
   LESB25	16	32	256	512
   LESB55	16	64	64	> 512
   LESB64	16	64	> 512	> 512
   LES431 22	4	8	32	> 512
   LESB49	16	64	64	256
   LES109	32	128	32	> 512
   Non-ERP isolats
   49461	16	32	16	> 512
   59032	0.5	2	4	> 512
   59073	> 512	> 512	> 512	> 512
   59076	16	32	32	> 512 </ Td>
   27	8	16	4	> 512
   45	16	32	4	> 512

   Tableau 1. La sensibilité de P. aeruginosa à la tobramycine.

   ₁ Pour la détermination de PSMICs et BSMICs tobramycine a été utilisé dans 2-dilutions
   allant de 512 à 0,5 pg / ml (n = 8 pour chaque concentration) et de 512 à 1 ug / ml (n = 4 pour chaque
   la concentration), respectivement;; PSMICs sont déterminées en utilisant la norme
   ¹ Méthode microdilution.

   ₂ microaérophilie étaient de 5% ₂ O, 10% de CO _2, et 85% de N _2.

   Souche	PSMIC 90 / BSMIC une variation de 90 fois 1
   	PSMIC aérobie → PSMIC microaérophile	BSMIC aérobie → BSMIC microaérophile	PSMIC aérobie → BSMIC aérobie	PSMIC microaérophile → BSMIC microaérophile
   PAO1	0	> 64	2	128
   LES isole
   LESB58	8	2	8	2
   LES400	4	32	0,25	2
   LESB25	2	2	16	16
   LESB55	4	> 8 4	> 8
   LESB64	4	ND	> 32	> 8
   LES431	2	> 16	8	> 64
   LESB49	4	4	4	4
   LES109	4	16	0	> 4
   Non-ERP isolats
   49461	2	> 32	0	> 16
   59032	4	> 128	8	> 256
   59073	ND	ND	ND	ND
   59076	2	> 16 2	> 16
   27	2	> 128	0.5	> 32
   45	2	> 128	0,25	> 16

   Tableau 2. Changement Fold PSMICs et BSMICs à la tobramycine.

   ₁ ND = non déterminé, les valeurs en caractères gras indiquent les changements SMIC pli> 10.

Dans cette étude nous avons utilisé un modèle in vitro roman basé sur l'ASM à reproduire P. conditions biofilm aeruginosa dans les ⁴ poumon FC. Le modèle a été modifié avec succès à petite échelle, à haut débit des tests des agents antimicrobiens.

Les étapes critiques de ce test sont les suivants:

1. Conformément préparation des médias ASM et la stérilité maintien. Nous avons consacré de longues heures à l'optimisation de la manière dont chaque composant est ajouté à obtenir des résultats reproductibles à chaque fois. Filtration de l'ASM est lent mais il est préférable d'autoclavage, ce qui peut endommager le composant mucine. Nous ne conseillons pas l'addition d'antibiotiques, comme suggéré par d'autres ^11, car cela pourrait imposer considérables pressions sélectives, des mutations d'entraînement, induire la lyse prophage ¹⁶ et modifier de manière significative l'expression de plusieurs gènes bactériens.
2. Le test doit être optimisée en fonction de l'o du volumef ASM utilisé. Shaking vitesses sont augmentées pour les petits volumes et une plus courte biofilm du cycle de vie est observée.

Une application évidente du modèle à petite échelle biofilm ASM est la détermination plus réaliste de susceptibilités biofilm antimicrobiens (BSMIC _90). Niches anaérobies et microaérophiles sont présents dans le poumon des FC et il est évident que l'oxygène est limité au plus profond de maturité biofilms ^{2, 17.} Nous démontrons ici que 10/14 P. clinique isolats aeruginosa de patient atteint de mucoviscidose présentent une considérable crachats (4 - ≥ 128 fois) diminution de la sensibilité à la tobramycine dans des conditions microaérophiles en ASM. Les résultats de cette étude suggèrent que les antibiotiques, tels que la tobramycine, pourrait être moins efficace contre P. infections aeruginosa dans les poumons CF que ceux indiqués par les méthodes classiques de test de sensibilité. Ces résultats reflètent les études antérieures sur la sensibilité aux antimicrobiens des biofilms ^10. Petit-échelle des dosages ASM ainsi fournir une plate-forme simple, le débit élevé pour générer des données significatives de sensibilité aux antibiotiques afin de mieux éclairer les décisions thérapeutiques. Le test est limité dans la même manière que les tests de sensibilité aux antibiotiques classiques par le fait que des colonies isolées sont cueillies pour le dépistage qui peuvent ne pas être représentatif de la population dans son ensemble. Cependant, nous croyons qu'une approche (i) à l'aide non-surface de croissance biofilm fixé et (ii) applicable à des conditions microaérophiles, représente une alternative claire et un potentiel d'amélioration des méthodes existantes. Nous concluons que cet essai est un modèle approprié pour étudier P. populations biofilm aeruginosa. D'autres tests dans des contextes cliniques serait de vérifier si la sensibilité aux antibiotiques sur la base de biofilm développé P. aeruginosa pourrait conduire à des choix différents antibiotiques avec potentiellement de meilleurs résultats cliniques et microbiologiques. Des enquêtes similaires en utilisant des modèles classiques de biofilm ont montré que les valeurs BSMIC conduiredes recommandations différentes pour le traitement antibiotique ^5,17.

En plus des tests de l'efficacité des agents anti-infectieux, le système ASM représente un pas cher, alternative simple et reproductible pour des modèles animaux pour des études telles que celles visant à comprendre la diversification de P. populations aeruginosa. Nous avons observé une hétérogénéité importante dans les populations naturelles de P. aeruginosa récupéré de patient atteint de mucoviscidose crachats ^{18, 19.} Comme la diversification phénotypique et génotypique peut être observée au cours de la croissance à l'ASM ⁴ (et nos données non publiées), ce qui en fait un joli modèle in vitro des maladies pulmonaires FC. La relative simplicité du modèle ASM, il est facile de concevoir des expériences d'adaptation à long terme visant, par exemple, à surveiller les effets des antibiotiques ou autres facteurs de stress sur P. Population de divergence aeruginosa. En outre, d'autres bactéries pathogènes peuvent être cultivées dansASM. Par exemple, Fouhy et al. 2007 ont utilisé l'ASM pour étudier la formation de biofilm par S. maltophillia ^20.

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Nous reconnaissons l'appui de l'Institut national du Royaume-Uni pour la recherche en santé, le Dr Hadwen Trust pour la recherche humaine, le Royaume-Uni leader de financement de la recherche médicale charité exclusivement des techniques de recherche non-animale pour remplacer l'expérimentation animale, et le Wellcome Trust (Grant 089 215). Nous reconnaissons également Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (l'éducation sans restriction de subvention).

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