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 JoVE Immunology and Infection

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

1, 1,2, 1,2

1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center, 2Geffen School of Medicine at UCLA

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Cite this Article: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

Hady, W. A., Bayer, A. S., Xiong, Y. Q. Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat. J. Vis. Exp. (64), e3863, doi:10.3791/3863 (2012).

Abstract: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

心内膜炎を含む血管内感染症は、生命を脅かす感染症症候群は1-3である。 黄色ブドウ球菌でも、適切な抗菌剤の治療4-6容認できないほど高い罹患率と死亡率とそのような症候群の最も一般的なワールドワイドな原因となっています。メチシリン耐性S.による感染の増加黄色ブドウ球菌 （MRSA）は、バンコマイシンの臨床治療の障害とリネゾリドおよびダプトマイシン抵抗の増大の問題率の高さは、このような感染症患者のそれ以降のすべての複雑な管理を持っており、高い医療費の7、8に導いた。さらに、それは抗生物質による治療の成果と最新の研究が臨床現場で基づいているため、よく患者への患者から様々な宿主因子によって影響を受ける可能性があることが強調されるべきである。したがって、宿主因子は、動物から動物から類似しているでは血管内感染症の適切な動物モデルは、より多くのです。微生物の病原性と同様に、新規の抗菌剤の有効性を検討することが重要。ラットにおける心内膜炎は、密接に人間の自然弁心内膜炎を近似する十分に確立された実験動物モデルである。このモデルは、特定のブドウ球菌病原性因子の役割とブドウ球菌性心内膜炎のため抗生物質の治療レジメンの有効性を調べるために使用されています。本稿では、細菌の病原性と抗生物質治療に対する反応を調査するために使用することができる。MRSAによる実験的心内膜炎モデルを説明します。

Protocol: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

1。感染のMRSA菌株を準備する

  1. 大豆寒天（TSA）平板トリプチケースヒツジ血液（特定の試薬や機器の表を参照）、-80の在庫管からのMRSAの文化の白金耳°Cを接種し、37℃で一晩インキュベートします。
  2. 全く汚染がないことを確認する血液寒天プレート（同じようなコロニー表現型）に文化の純度を確認してください。
  3. ヒツジ血液TSAプレートから1コロニーを採取し、15ミリリットルスナップキャップチューブに5ミリリットルトリプチケースソイブロス（TSB）にコロニーを接種する。
  4. 200 rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートします。

2。手術カテーテルの準備

10cmの長さに、滅菌鉗子で先端を押すことによって、一方の端を溶かし、ポリエチレンチューブ（Becton Dickinson社製、注文番号427401。PE10）を切り取ります。カテーテルの一端を封止する目的は、カテーテル検査中に出血を避けるためです。

3。事前のurgeryの準備と麻酔

  1. イソフルランと酸素の混合ガス（50％：50％）を含むチャンバー内で行われたSprague-Dawleyラット（ハーラン、インディアナポリス、インディアナ州の女性、250〜300グラム）は、麻酔薬が有効になるまで（例えば、筋肉が緩和され、ペダルの反射は存在しない）、およびガス混合物と、手術中に麻酔状態の動物を維持します。
  2. 顎からちょうどBetadine、70％エタノールで胸骨下の首のエリアを清掃してください。

4。外科的処置

  1. 手術中無菌テクニックを使用しています。胸骨上に首だけの皮膚層を介して垂直に切開（1〜1.5 cm）を確認します。
  2. 鈍的切開を使用して、湾曲した歯鉗子の2ペアを使用して、右頸動脈を露出させる筋膜を分離します。
  3. そっと首キャビティの動脈をプルアップ、シルク縫合糸の代わりに2つの10センチの長さ動脈の下に、露出した頭部の端に動脈を縛る、アルテにクリップを配置出血を防ぐために、RY。
  4. カテーテルイントロデューサー（Becton Dickinson社製、注文番号406999）を使用して、動脈の上部に小さな穴を作り、動脈の穴から鉗子でカテーテルを挿入し、クリップを削除し、心臓に向かってカテーテルをプッシュダウンするまでの抵抗満たされている。
  5. 動脈の尾側端周りに緩い縫合糸を結ぶとによって決定されるカテーテルが所定の位置にあるときに絹縫合糸で固定カテーテルを固定します。i）カテーテルの長さ（4-5センチ）を挿入し、ⅱ）更なる発展への抵抗及びiii）のハートビートとカテーテルの脈動。実験の残りの場所にカテーテルを残す。
  6. 過剰な縫合糸、カテーテルの端をカットし、カテーテルからの出血がないことを確認してください。首の皮膚の下に緩い端を押し込むと皮膚のクリップで皮膚を閉じます。
  7. 麻酔から回復するまで暖かい場所にケージにラットを入れ、食料や水を提供しています。中に頻繁にラットをチェックして、後、麻酔からの回復。
  8. この手術は "カテゴリE"の手順です。痛みを生成手順は、動物に苦痛を伴うMRSA感染以来、鎮痛薬によって単調です。

5。 MRSA感染

  1. 感染症は、1と7日後に手術との間で行われるが、実験内での一貫性を保つことができます。
  2. クリーンラットの70％エタノールで尾、所望の細胞数（4月 10日から6月 10日までCFUほとんどの黄色ブドウ球菌株のために/動物）で0.5ミリリットルMRSAを注入します。尾静脈から静注し27 G 1/2インチの針で注意：MRSA培養はバイオセーフティーレベル2（BSL2）に属しており、人員や環境への適度な潜在的な危険を持っています。
  3. 止血は、ケージにラットを返す前に発生するまで、サイトでの圧力を保持します。

6。ラットおよび文化標的組織を生け贄に捧げる

  1. ペントバルビタールナトリウム（200 mgの腹腔内注射によってラットを犠牲にする/ kg）を1から6日後に感染後。
  2. 彼女の背中にラットを置き、70％エタノールで胸を拭いてください。
  3. 胸骨下の胸のV字型の切開を行い、心臓を露出させる胸骨の両側に肋骨の軟骨を切った。
  4. 優しく心をプルアップし、心臓組織を介してクリップに近い大動脈へと心を解放するまで解剖する。
  5. 4x4のインチガーゼ内部に滅菌ペトリ皿に心を置き、左心室内壁カットスルーを行い、左サイド室を開きます。
  6. カテーテル留置のために視覚的に確認してください。調べ、ハサミとピンセットでバルブから植生を削除します。
  7. 重さと均質化植生し、定量培養のためにPBSで段階希釈を行います。

7。代表的な結果

すぐに動脈にカテーテルを挿入し、心臓に向かって4〜5センチメートル約カテーテルを押し下げた後、抵抗値がexperienになりますCED。全く抵抗が検出されていない場合は、カテーテルが正常にカテーテルの配置に影響を与える可能性が心腔の左側に挿入されていない可能性があります。以前に9を公開し、適切なカテーテル留置は、 図1に示されています。

MRSA感染のサンプルの一部は、感染サンプルの感染率と純度の正確な生菌数を確認して定量的に培養する必要があります。さらに、植生から回収された生物は、接種で使用されているものと同じである必要があります。

表1は、Sの病原性の例を示し9以前に発行されたラットの心内膜炎モデルにおける黄色ブドウ球菌株 。感染症は、高Sでendocarditsを開発した後、すべての動物は10 5 10 6 CFUの接種で挑戦して3から6日の間に犠牲に心臓の疣贅と同様に、腎臓および脾臓における黄色ブドウ球菌の密度（

図1
図1。カテーテルは正しい場所（心腔の左側）にあり、多数の疣贅は、大動脈弁9の周りに表示されます。

接種（アニマス数） 組織の10 CFU / gをログに記録平均値±SDで：
植生 腎臓 脾臓
10 6 CFU /動物（9） 10.36±0.85 7.30±0.64 6.70±0.57
10 5 CFU /動物（8） 9.93±0.53 7.14±0.53 6.44±0.63
10 4 CFU /動物（7） 3.46±0.50 * 1.81±0.74 * 1.58±0.59 *

SD、標準偏差、P <0.001 10 5 10 6 CFU-挑戦の動物に関して。

表1。S.ラットの心内膜炎モデル9の異なる接種と心臓の植生における黄色ブドウ球菌の密度。

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Discussion: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

ラットの心内膜炎は、細菌感染症9-11の治療における病態と抗菌薬のin vivo試験のために重要で、十分に特徴付けられた動物モデルである。さらに、ラットの心内膜炎モデルでは、急性および亜急性感染症の複合を表しており、密接に人間相手と人間の自然弁心内膜炎に似ています。また、住居内のカテーテルを伴って、それは古典的なバイオ関連感染症、臨床12一般的で困難な問題を表しています。最も重要なのは、ラットの心内膜炎モデルで生成された結果は高い再現性があります。

S.の病原性ラットの心内膜炎モデルにおける黄色ブドウ球菌は 、他の動物モデルとして、接種量、細菌の増殖期（ログ対固定）、動物の年齢、および動物の遺伝的背景9、13を含むパラメータの数によって異なります。手術の成功率は、Hです。研究者の技術的な専門知識と手術のスキルに依存ighly依存しています。手術の成功はによって測定することができる：1）手術から回復する動物の数、2）犠牲の時に正しい場所にカテーテル、3）植生心臓弁上に存在する。

要約すると、ラットの心内膜炎は密接に臨床的な状況を模した、実用的な再現性が重要なモデルです。したがって、実験的心内膜炎症候群の治療における抗菌剤の微生物病因性と有効性を含む敗血症研究のすべてのフィールドに適しています。

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Disclosures: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgements: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

この作品は、アメリカの心臓協会[助成金SDG 0630219NとAID 09GRNT2180065にYQX] [ASBに助成R01AI-39108]米国国立衛生研究所によってサポートされていました。

Materials: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) Hardy Diagnostics A10BX
Trypticase Soy broth (TSB) BD Biosciences 211825
Shaking incubator Labnet International I5311-DS
Polyethylene tubing BD Biosciences 427401
Catheter introducer BD Biosciences 6999
Isofluorance Western Medical Suppy, Inc 2147 Follow safety and handling information
Surgical Instruments Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. Find the instruments from the two companies for your needs

References: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル

  1. Petti, C.A. & Fowler, V.G., Jr. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-33, vii (2003).
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