Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente

Wessam Abdel Hady¹, Arnold S. Bayer^1,2, Yan Q. Xiong^1,2

¹Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center, ²Geffen School of Medicine at UCLA

1. Voorbereiden van de MRSA-stammen voor Infectie

1. Inoculeer een entoog met bacterie MRSA cultuur van een voorraad buis bij -80 ° C tot een schaap bloed trypticasesoja-agar (TSA) plaat (zie tabel van specifieke reagentia en apparatuur), en incuberen bij 37 ° C voor de overnachting.
2. Controleer de zuiverheid van de cultuur op het bloed agar plaat (vergelijkbaar kolonie fenotypes) om ervoor te zorgen is er geen besmetting.
3. Kies een kolonie van de schapen bloed TSA plaat en inoculeren de kolonie in 5 ml trypticasesoja bouillon (TSB) in een 15 ml snap-buisje.
4. Incuberen bij 37 ° C geroerd onder schudden bij 200 rpm.

2. Voorbereiding operatie Katheters

Snijd polyethyleen buis (PE10;. Becton Dickinson, bestelnr 427401) tot 10 cm lengte, en smelt het ene uiteinde door te drukken op de punt met een steriele pincet. Het doel van de sluiting een uiteinde van de katheter om bloedingen vermijden tijdens katheterisatie.

3. Pre-surgery Voorbereiding en Anesthesie

1. Plaats Sprague-Dawley ratten (Harlan, Indianapolis, Ind vrouw, 250-300 gram) in een kamer met isofluorane-zuurstof-gasmengsel (50%: 50%) tot de verdoving van kracht wordt (bijvoorbeeld de spieren ontspannen zijn en de pedalen zijn afwezig ) en handhaven dieren in een verdoofde staat tijdens de operatie met het gasmengsel.
2. Maak de nek van kin tot net onder het borstbeen met Betadine en 70% ethanol.

4. Chirurgische procedure

1. Gebruik steriele techniek in de operatie. Maak een insnijding (1-1,5 cm) verticaal door alleen de huid laag van de nek boven het borstbeen.
2. Met behulp van stompe dissectie, scheid de fascia aan de rechter halsslagader met behulp van 2 paar gebogen getande tang bloot te leggen.
3. Trek de slagader op uit de nek holte, en plaats twee 10 cm lengte van de zijden hechtdraad in de slagader en uit de slagader te binden aan het blootgesteld cephalica einde, plaats een clip op de artery om bloedingen te voorkomen.
4. Maak een klein gaatje in de bovenkant van de slagader met behulp van een katheter introducer (Becton Dickinson, bestelnr. 406999), een katheter met een pincet door het gat in de slagader, verwijdert u de clip en duw de katheter naar het hart tot u weerstand wordt voldaan.
5. Bind de losse hechting rond het caudale einde van de slagader en zet de katheter op zijn plaats met de zijden hechtdraad wanneer de katheter op zijn plaats wordt bepaald door: i) de lengte van de katheter ingebracht (4-5 cm), ii) de weerstand tegen verdere vooruitgang en iii) het pulseren van de katheter met de hartslag. Laat de katheter voor de rest van het experiment.
6. Snijd overtollig hechtingen en katheter eindigt, en zorg ervoor dat er geen bloeding van de katheter. Stop de losse uiteinden onder de huid van de nek en sluit de huid met de huid clips.
7. Zet de rat in de kooi op een warme plaats totdat hersteld van de narcose, en zorgen voor voedsel en water. Controleer regelmatig de rat tijdens enna herstel van de anesthesie.
8. Deze operatie is een "Categorie E"-procedure. De procedures geproduceerd pijn is niet verlicht door pijnstillers, omdat MRSA-infecties bij leed van de dieren.

5. MRSA-infectie

1. Infectie kan worden uitgevoerd tussen 1 en 7 dagen na de operatie, maar houd consistent zijn in experimenten.
2. Schoon rattenstaart met 70% ethanol, en injecteer 0,5 ml MRSA op een gewenste cellen ⁽¹⁰ april-10 juni cfu / dier de S. aureus stammen). Met 27 G 1/2 inch naald intraveneus de staartader Let : MRSA-cultuur behoort tot bioveiligheid niveau 2 (BSL2) en heeft een matige mogelijke gevaar voor het personeel en het milieu.
3. Houd de druk op de site tot hemostase optreedt alvorens terug te keren de rat naar de kooi.

6. Offer Ratten en cultuur doelweefsels

1. Offer ratten door ip injectie van natrium-pentobarbital (200 mg/ Kg) na 1-6 dagen na infectie.
2. Plaats de rat op haar rug en veeg de borst met 70% ethanol.
3. Maak een V-vormige incisie in de borst onder het borstbeen, en snijd het kraakbeen van de ribben aan elke kant van het borstbeen naar het hart bloot te leggen.
4. Trek het hart zachtjes omhoog en clip door het hart weefsel in de buurt van de aorta en ontleden tot het hart vrij te maken.
5. Plaats het hart op een steriele petrischaal met 4x4 inch gaas naar binnen, maken een snede door de linker ventrikel binnenwand en open de linkszijdige kamer.
6. Controleer visueel voor de plaatsing van de katheter. Onderzoek en verwijder vegetaties van de klep met een schaar en tang.
7. Weeg en homogeniseren van de vegetaties, en maak seriële verdunningen met PBS voor kwantitatieve cultuur.

7. Representatieve resultaten

Direct na het inbrengen van de katheter in de slagader en naar beneden te duwen de katheter ongeveer 4-5 cm in de richting van het hart, zal een weerstand zijn experienced. Indien geen weerstand wordt gedetecteerd, kan de katheter niet goed zijn opgenomen in linkerkant van de hartkamer, die de plaatsing van de katheter beïnvloeden. Een juiste katheter eerder gepubliceerd ⁹ is getoond in figuur 1.

Een deel van MRSA-infectie monsters moeten kwantitatieve gekweekte de zorg ervoor dat de exacte levensvatbare bacteriële telling voor de infectie en de zuiverheid van de infectie monster. Bovendien moet de organismen zich uit vegetaties dezelfde zijn als die van het entmateriaal.

Tabel 1 geeft een voorbeeld van virulentie van een S. aureus stam in de rat endocarditis model dat werd eerder gepubliceerd ^9. Alle dieren uitgedaagd met inocula van 10 ⁵ en 10 ⁶ kve en offerde tussen de 3 tot 6 dagen na infecties ontwikkeld endocardits met hoge S. aureus dichtheden in cardiale vegetaties en nieren en milt (

Figuur 1. Catheter is een juiste plaats (linkerkant van hartkamer) en talrijke vegetaties zichtbaar in de aortaklep ^9.

^een SD, standaarddeviatie. p <0,001 met betrekking tot 10 ⁵ of 10 ⁶ CFU-uitgedaagd dieren.

Tabel 1. S. aureus dichtheid in het hart vegetaties met verschillende inocula in de rat endocarditis model ^9.

De rat endocarditis een belangrijke en gekarakteriseerd diermodel voor in vivo studies bij de Pathogenese en antimicrobiële middelen bij de behandeling van bacteriële infecties ^9-11. Daarnaast, rat endocarditis model is een samenstelling van acute en sub-acute infecties, en nauw bootst de menselijke tegenhanger en menselijke inheemse klep endocarditis. Bovendien, vergezeld van een in de woning katheter, het vertegenwoordigt een klassiek biofilm-geassocieerde infectie, een veel voorkomende en lastige kwestie in klinische settings ^12. Het belangrijkste is dat de resultaten gegenereerd met de rat endocarditis model zijn zeer reproduceerbaar.

De pathogeniciteit van S. aureus in de rat endocarditis model andere diermodellen is afhankelijk van een aantal parameters, waaronder inoculum dosis bacteriegroei fase (log tegen stationaire), leeftijd van, en dierlijke genetische achtergrond ^{9, 13.} Chirurgische slagingspercentages zijn highly afhankelijk van de technische expertise en chirurgische vaardigheden van de onderzoeker. Succes de operatie kan worden gemeten door: 1) het aantal dieren dat herstellen van de operatie, 2) katheter in een juiste plaats op het moment van opoffering en 3) vegetaties aanwezig hartkleppen.

Kortom, de rat endocarditis is een uitvoerbaar, reproduceerbaar en belangrijk model dat de klinische situatie nabootst op de voet. Daarom is het geschikt voor alle gebieden van sepsis onderzoek, met inbegrip van microbiële pathogenese en de werkzaamheid van antimicrobiële middelen bij de behandeling van experimentele endocarditis syndromen.