Забор крови для биохимического анализа у взрослых данио рерио

1. Текст протокола

1. Перед сбором данио крови, необходимо подготовить обезболивающим воды. Налейте ~ 200 мл аквариумной воды в емкость с 500 мл. Добавить ~ 200 г кусочки льда. Температура должна быть около 4 ° C. Как кусочки льда растает, нужно будет добавить больше фишек льда для поддержания постоянной температуры около 4 ° C.
2. Когда обезболивающее воды готова, подготовить материалы, необходимые для сбора крови. Положите низким сохранение отзыв на P20 пипетки и оставить пипетки, где она может быть легко доступны. Не допускайте, пипетки, чтобы связаться с любых источников загрязнения.
3. Накройте чашку Петри с куском сухой марли. Стальным лезвием, а другой кусок марли должен быть помещен в легко доступном месте.
4. Центрифуга адаптированы для пластиковых труб будет необходимо.
5. Когда вышеупомянутые материалы готовы, захватить первый данио, чтобы быть под наркозом остроумиега рыболовную сеть и отпустить его в воду, которая была подготовлена ​​для анестезии. Данио рерио требуется 3-6 с в охлажденную воду, чтобы быть под наркозом, в зависимости от рыбы. Хранить рыбу в холодной воде, пока она не реагирует на внешние раздражители.
6. С помощью рыболовной сети, поместите под наркозом рыбу на подготовленный кусок марли, оставляя хвост прочь марлю. Сложите марлю над головой рыбы и тела, оставляя только хвост ее. Положите рыбу покрытые марлей на чашке Петри.
7. Используйте стальным лезвием, чтобы диагональ разрез только между анальным плавником и хвостовым плавником. Кровь начнет выходить. В этот момент необходимо работать быстро.
8. Осторожно стремятся кровь, которая выходит с пипетки P20 (предварительно загружены с низким кончик удержание). Количество крови, которые могут быть собраны в зависимости от размера рыбы и в какой степени, что под наркозом правильно. Это обычно колеблется от 5 до 20 мкл. Когда кровь останавливается сoming из, мягко передать стремился кровь в пробирку.
9. Для того чтобы избежать гемолиза, очень важно, чтобы трубка с кровью в ней обращаться очень осторожно, без резких движений, пока она не помещается в центрифугу.
10. Для того чтобы избежать гемолиза, также важно, что пробы крови были закреплены в центрифуге в течение 10 минут для сбора крови.
11. При необходимости можно объединить кровь из более чем одного животного, что делает бассейн. Объединенные образцы будут работать нормально до тех пор, как задержка между забора крови из первых рыб и центрифугирования, не превышает 10 минут.
12. Когда сбор крови не будет сделано, центрифуги крови в течение 10 минут в 0,5 г (центрифуга Eppendorf 5415D).
13. После центрифугирования сыворотки на верхний слой трубы. С помощью пипетки, аспирации в сыворотке крови, следя, чтобы получить только в сыворотке крови, сохраняя при этом оба слоя хорошо разделены и стабильной.
14. Трансфер в сыворотке крови в новый микропробирок иготов для использования в биохимических анализах. Сыворотка может храниться во льду при его ждать, чтобы начать биохимических анализов.
15. Если сыворотка не будет использоваться сразу, могут быть заморожены при температуре -18 ° C до примерно 3 месяца.

2. Представитель Результаты

Можно было собрать от 5 до 20 мкл цельной крови из каждой рыбы, что представляет даже в 4 раза больше крови, чем ранее описанные методы (табл. 2). Биохимический анализ общего холестерина, холестерина ЛПВП, ЛПНП-холестерина и триглицеридов были проведены после забора крови с помощью этой техники. Две группы, как рыба полов не кормили в течение 24 часов до забора крови, чтобы избежать помех приема пищи. Анализы были проведены с мелкомасштабных колориметрических тестов (Labtest Диагностика SA, Бразилия) Для полного анализа холестерина и триглицеридов, 3 мкл сыворотки были использованы. Для LDL-холестерина и ЛПВП-холестеринаанализ, 4 мкл и 10 мкл сыворотки были использованы, соответственно. Эти исследования проводились на объединенных пробах из 10 данио в образце.

Сыворотка липидный уровней по сравнению с рыбой, что доступ к их собственные яйца, и те, что в нижней покрыта аквариум, не имеют доступа к своим яйца для экспериментального продолжительностью 2 недели. Сыворотка анализ показал, что в сыворотке крови уровня общего холестерина (с яйцами 362 ± 42 мг / дл и без яиц 357 ± 13 мг / дл), HDL-холестерина (с яйцами 91,22 ± 1,79 мг / дл и без яиц 72,14 ± 2,89 мг / дл) и LDL-холестерина (с яйцами 55,68 ± 10,88 мг / дл и без яиц 44,18 ± 9,84 мг / дл) существенно не различались между группами. Тем не менее, уровни триглицеридов были значительно ниже в экспериментальной группе (без яиц 292 ± 64 мг / дл), чем в контрольной группе (с яйцами 457 ± 25 мг / дл, p = 0,03).

Таблица 1. Холестерин и триглицериды Серик уровни для обеих исследованных группах (с выходом на яйца и без доступа к яйца), выраженная в среднее ± стандартное отклонение.

* Статистически значимое (р = 0,03). Тест Стьюдента.

Эта статья представляет собой простой способ, который позволяет еще больше крови и сыворотки анализ рыбок данио экспериментов. Эта технология имеет потенциал внести свой вклад в будущее данио гематологические исследования требуют данных параметров крови. Необходимо также обеспечить большую применения данио качестве экспериментальной модели.

Этот метод не требует специальных навыков или осуществления точной техникой. Кроме того, он обеспечивает до двойного количества крови, которые должны быть собраны по сравнению с другими методами, тем самым позволяя использовать меньшее число рыб для получения необходимого количества биологического материала. Техника имеет один важный шаг, который является то, что образцы крови обращаться осторожно, как данио крови может нести гемолиза очень легко. Задержка между сбором крови и центрифугирование должно быть строго ограничено. 10-минутный лимит должен предотвратить гемолиз. Скорость и продолжительность центрифугирования (0,5 г в течение 10 минут) шоуД. также должны строго соблюдаться.

Другие методы сбора крови были попытки, прежде чем этот метод был разработан. Тем не менее, число животных, используемых была большая и очень небольшое количество крови были взяты у каждой рыбы. Этот новый метод позволяет использовать меньшее число животных, было доказано, что возможно с низким уровнем квалификации практикующих, и дала лучшие результаты, чем другие методы, с точки зрения количества крови, взятой из каждой рыбы.