Collecte de sang pour analyse biochimique chez le poisson zèbre adulte

1. Texte du Protocole

1. Avant la collecte de sang le poisson-zèbre, il est nécessaire de préparer de l'eau anesthésiante. Verser ~ 200 ml d'eau de l'aquarium dans un récipient d'une capacité de 500 ml. Ajouter ~ 200 g de morceaux de glace. La température devrait être d'environ 4 ° C. Comme les morceaux de glace fondre, il sera nécessaire d'ajouter des morceaux de glace de plus pour maintenir une température constante de près de 4 ° C.
2. Lorsque l'eau anesthésiante est prêt, préparer le matériel nécessaire pour la collecte de sang. Mettre une pointe à faible rétention sur une pipette P20 et laisser la pipette où il peut être facilement accessible. Ne laissez pas la pointe de pipette à contacter toutes les sources de contamination.
3. Couvrir une boîte de Pétri avec un morceau de gaze sèche. Une lame en acier et un autre morceau de gaze doit être placé dans un endroit facilement accessible.
4. Une centrifugeuse adaptée pour tubes en matière plastique sera nécessaire.
5. Lorsque les matières mentionnées ci-dessus sont préparés, de capturer le poisson-zèbre premier à être anesthésié l'espritfilet de pêche ha et le libérer dans l'eau qui a été préparé pour l'anesthésie. Le poisson zèbre exigent 3-6 s dans l'eau glacée d'être anesthésié, selon le poisson. Gardez le poisson dans l'eau froide jusqu'à ce qu'elle ne répond plus aux stimuli externes.
6. Utilisation de la pêche au filet, placer le poisson anesthésié sur un morceau de gaze préparée, en laissant la queue hors de la gaze. Pliez la gaze sur la tête du poisson et du corps en laissant de côté que sa queue. Mettez le poisson recouvert de la toile sur la boîte de Pétri.
7. Utilisez la lame d'acier pour faire une incision en diagonale juste entre la nageoire anale et la nageoire caudale. Le sang va commencer à sortir. À ce stade, il est nécessaire de travailler rapidement.
8. Doucement aspirer le sang qui sort avec la pipette P20 (pré-chargé avec une pointe à faible rétention). La quantité de sang qui peuvent être recueillis dépend de la taille du poisson et dans quelle mesure qu'il a été anesthésié correctement. Il varie généralement de 5 à 20 pi. Lorsque le sang cesse de coming, doucement transférer le sang aspiré dans un tube.
9. Pour éviter l'hémolyse, il est essentiel que le tube de sang en elle être traitée avec beaucoup d'attention, sans aucun mouvement drastiques jusqu'à ce qu'il soit placé dans la centrifugeuse.
10. Pour éviter l'hémolyse, il est également important que l'échantillon de sang être fixé dans la centrifugeuse dans les 10 minutes suivant le prélèvement de sang.
11. Si nécessaire, il est possible de combiner le sang de plus d'un animal, ce qui rend une piscine. Les échantillons combinés fonctionnera bien tant que le délai entre la collecte de sang du premier poisson et la centrifugation ne dépasse pas 10 minutes.
12. Lorsque la collecte de sang est faite, centrifuger le sang pendant 10 minutes à 0,5 g (centrifugeuse Eppendorf 5415D).
13. Après centrifugation, le sérum est moins la couche supérieure du tube. Avec une pipette, aspirer le sérum, en veillant à obtenir simplement le sérum tout en gardant les deux couches bien divisé et stable.
14. Transférer le sérum dans un microtube nouvelle et ilest prêt à être utilisé dans des analyses biochimiques. Le sérum peut être conservé dans la glace alors qu'il hâte de commencer les analyses biochimiques.
15. Si le sérum ne sera pas utilisé immédiatement, il peut être congelé à -18 ° C jusqu'à environ 3 mois.

2. Les résultats représentatifs

Il était possible de collecter 5 à 20 ul de sang total de chaque poisson représente ce que le sang même 4 fois plus que les techniques décrites précédemment (tableau 2). L'analyse biochimique du cholestérol total, HDL-cholestérol, le LDL-cholestérol et les triglycérides ont été effectuées après la collecte de sang en utilisant cette technique. Deux groupes de deux poissons sexes ont jeûné pendant 24 heures avant la collecte du sang pour éviter les interférences apport alimentaire. Les analyses ont été effectuées avec les petits-échelle des tests colorimétriques (Labtest Diagnostica SA, Brésil) pour des analyses de cholestérol et de triglycérides totaux, 3 pl de sérum ont été utilisés. Pour le cholestérol LDL et HDL-cholestéroll'analyse, 4 pi et 10 pi de sérum ont été utilisés, respectivement. Ces analyses ont été effectuées sur des échantillons mis en commun de 10 poisson zèbre par échantillon.

Les taux sériques de lipidiques ont été comparés entre les poissons qui a accédé à leurs propres oeufs et ceux qui, dans un aquarium de fond recouvert, n'ont pas eu accès à leurs propres oeufs pour une durée expérimentale de 2 semaines. L'analyse du sérum a montré que les taux sériques de cholestérol total (avec des oeufs 362 ± 42 mg / dL et sans oeufs 357 ± 13 mg / dL), les taux de HDL-cholestérol (avec des oeufs 91,22 ± 1,79 mg / dL et sans oeufs 72,14 ± 2,89 mg / dL), et le LDL-cholestérol (avec des oeufs 55,68 ± 10,88 mg / dL et sans oeufs 44,18 ± 9,84 mg / dL) ne diffèrent pas significativement entre les groupes. Toutefois, le taux de triglycérides étaient significativement plus faibles dans le groupe expérimental (sans oeufs 292 ± 64 mg / dL) que dans le groupe de contrôle (avec des oeufs 457 ± 25 mg / dL, p = 0,03).

Tableau 1. Le cholestérol et les triglycérides sériques niveaux pour les deux groupes étudiés (avec accès aux œufs et sans accès aux œufs), exprimée en moyenne ± déviation standard.

* Statistiquement significatif (p = 0,03). Test t de Student.

Cet article présente une technique simple qui permet en outre de sang et l'analyse du sérum dans les expériences de poisson-zèbre. Cette technique a le potentiel de contribuer aux études de poisson zèbre futures hématologiques nécessitant des données de paramètres sanguins. Elle devrait également permettre de plus grandes applications du poisson zèbre comme modèle expérimental.

Cette technique ne nécessite pas de compétences particulières ou de mise en œuvre d'une technique précise. En outre, il permet de quitte ou double la quantité de sang à collecter par rapport à d'autres techniques, permettant ainsi l'utilisation de moins de poissons pour obtenir la quantité nécessaire de matériel biologique. La technique a une étape cruciale, qui est que les échantillons de sang être manipulés avec soin que le sang du poisson zèbre peut encourir une hémolyse très facilement. Le délai entre la collecte de sang et la centrifugation doit être strictement limitée. Une limite de 10 minutes devrait éviter l'hémolyse. La vitesse et la durée de centrifugation (0,5 g pour 10 minutes) should également être strictement suivies.

D'autres techniques de collecte de sang ont été tentées avant que cette technique a été développée. Toutefois, le nombre d'animaux utilisés a été de grandes quantités et les très petites de sang ont été prélevés sur chaque poisson. Cette nouvelle technique a permis l'utilisation de moins d'animaux, a été démontrée pour être réalisable à faible niveau de compétence des praticiens, et a donné de meilleurs résultats que d'autres techniques en termes de quantité de sang prélevé sur chaque poisson.