Yetişkin Zebra balığı Biyokimyasal Analiz için Kan Alma

1. Protokol Metni

1. Zebrafish kan toplama önce, anestezi su hazırlamak için gereklidir. 500 ml kapasiteli bir konteyner içine akvaryum su ~ 200 ml dökün. Buz yongaları ~ 200 g ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta yaklaşık olmalıdır Buz yongaları eriyik gibi, 4 ° C civarındaki sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek daha buz yongaları eklemek için gerekli olacaktır
2. Anestezi su hazır olduğunda, kan toplama için gerekli malzemeleri hazırlar. Bir P20 pipet düşük tutma ucu koyun ve kolayca erişilebilir pipet bırakın. Pipet bulaşma kaynakları temasa izin vermeyin.
3. Kuru gazlı bez parçası ile Petri örtün. Bir çelik bıçak ve gazlı bez başka bir parça kolay erişilebilen bir yere konulmalıdır.
4. Plastik borular için uyarlanmış bir santrifüj gerekli olacaktır.
5. Söz konusu malzeme hazırlandığı zaman, anestetize wit olarak birinci zebrafish yakalamakha balık ağı ve anestezi için hazırlanmış olan suya bırakın. Zebrafish soğutulmuş su içinde 3-6 s balık bağlı olarak anestezi uygulanmış olması gerekir. Artık dış uyaranlara yanıt verene kadar soğuk suda balık tutun.
6. Balık ağı kullanarak, tül kuyruk dışı bırakarak, gazlı bez hazırlanmış bir parçası üzerinde anestezi balığı yerleştirin. Sadece kuyruğunu dışarıda bırakarak balığın baş ve vücut üzerinde gazlı bez katlayın. Petri tabağına gazlı bez ile kaplı balık koyun.
7. Sadece anal yüzgeç ve kuyruk yüzgeci arasında çapraz bir kesi yapmak için çelik bıçak kullanın. Kan dışarı çıkmaya başlayacaktır. Bu noktada, hızlı bir şekilde çalışması için gereklidir.
8. Yavaşça P20 pipet (düşük tutma ucu ile ön yüklü) ile çıkan kanın talip. Toplanabilir kan miktarı balık boyutuna ve ne doğru anestetize olduğu ölçüde değişir. Bu, genellikle 5 ile 20 ul kadar değişir. Kan c dururdışarı oming, yavaşça bir tüp içine aspire kan aktarın.
9. Hemoliz önlemek için, bunun santrifüj yerleştirilir kadar kan ile tüp herhangi bir sert hareketler yapmadan, çok dikkatle ele alınması önemlidir.
10. Hemoliz önlemek için, kan örneği kan toplama 10 dakika içinde santrifüj temin edilmesi de önemlidir.
11. Eğer gerekirse, bunun bir havuz verme, birden fazla hayvandan kan birleştirmek mümkündür. Pooled örnekleri ilk balık ve santrifüj kan toplama arasındaki gecikme 10 dakika aşmadığı sürece iyi çalışır.
12. Kan toplama yapıldığında, 0.5 g (Eppendorf Santrifüj 5415D) 10 dakika boyunca kan santrifüjlenir.
13. Santrifüjleme takiben, serum borusunun üst tabaka yer almaktadır. Bir pipet ile, her iki katmana da bölünmüştür ve istikrarlı tutarken sadece serum almak için emin, serum aspire.
14. Yeni bir mikrotüp içine serum transferi ve bubiyokimyasal analizlerde kullanılmak üzere hazırdır. Bu biyokimyasal analizler başlamak için beklerken serum buz saklanabilir.
15. Serum hemen kullanılmayacak ise, yaklaşık 3 ay -18 ° C kadar dondurulabilir.

2. Temsilcisi Sonuçlar

Daha önce açıklanan teknikler (Tablo 2) bile 4 kat daha fazla kan neyi temsil ettiğini her balıktan tam kan 5 ila 20 ul toplamak mümkün olmuştur. Total kolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol ve trigliserid biyokimyasal analizler bu tekniği kullanarak kan alımından sonra yapıldı. Kan toplama gıda alımı girişimi önlemek için önce her iki cinsiyette balık iki grup 24 saat aç bırakıldı. Analizleri total kolesterol ve trigliserid analizleri için küçük ölçekli kolorimetrik testler (Labtest Diagnostica SA, Brezilya) ile yapıldı, serum 3 ul kullanılmıştır. LDL-kolesterol ve HDL-kolesterol içinanalizi, 4 ul ve 10 ul serum sırasıyla kullanılmıştır. Bu analizler, örnek başına 10 zebrabalıkları havuzlanmış örnekleri üzerinde yapılmıştır.

Serum lipidik düzeyleri kendi yumurta ve bir alt kapalı akvaryum, 2 haftalık bir deneme süresi için kendi yumurtalarını erişimi olmadığını, bu erişilebilir balıklar arasında karşılaştırıldı. Serum analizleri, serum total kolesterol düzeyleri (yumurta 362 ± 42 mg / dL ve yumurta 357 olmadan ± 13 mg / dL), HDL-kolesterol (yumurta 91,22 ± 1.79 mg / dL ve yumurta 72.14 olmadan ± 2.89 mg / dL) ve (yumurta 55,68 ± 10.88 mg / dL ve yumurta 44.18 ± 9.84 mg / dL olmadan) LDL-kolesterol gruplar arasında anlamlı farklılık yoktu. Ancak, trigliserid düzeyleri (p = 0.03 yumurta 457 ± 25 mg / dL) ile kontrol grubuna göre (yumurta 292 ± 64 mg / dL olmadan) deney grubunda anlamlı olarak daha düşüktü.

Tablo 1. Her iki çalışma grupları için kolesterol ve trigliserid düzeyleri Seric (yumurta erişimi olan ve yumurta erişim olmadan) ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir.

* Istatistiksel olarak anlamlı (p = 0.03). Student t testi.

Bu kağıt zebrabalıkları deneylerde daha fazla kan ve serum analiz sağlayan basit bir teknik sunuyor. Bu teknik, kan parametre veri gerektiren gelecekte zebrabalıkları hematolojik çalışmalara katkıda bulunma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, bir deneysel model olarak zebrafish daha fazla uygulamalar için izin vermek gerekir.

Bu teknik, özel bir beceri ya da kesin bir tekniğin uygulanmasını gerektirmez. Dahası, bu sayede, biyolojik malzemenin gerekli miktarda elde etmek için daha az balık kullanılmasına imkan verir, çift kadar diğer tekniklere göre alınacak kan miktarı sağlar. Teknik zebrabalıkları kan çok kolayca hemoliz tahakkuk gibi kan örnekleri dikkatle ele alınması olduğunu bir kritik adım vardır. Kan toplama ve santrifüj arasındaki zaman gecikmesi sıkı bir şekilde sınırlı tutulmalıdır. 10 dakikalık bir sınırı hemoliz önlemelidir. Santrifüjleme ile hızı ve süresi (10 dakika boyunca 0.5 g) should de kesinlikle takip edilmesi.

Bu tekniği geliştirildi önce Diğer kan toplama teknikleri denendi. Bununla birlikte, kullanılan hayvan sayısı kan büyük ve çok küçük miktarlarda her balığın toplandı idi. Daha az sayıda hayvan kullanımına izin verilen bu yeni teknik, düşük beceri düzeyi uygulayıcılar ile mümkün olduğu gösterilmiştir ve her balık toplanan kan miktarı açısından diğer tekniklere göre daha iyi sonuçlar verdi.