シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け

1。背景

ビオチンは、単純な、3段階のプロセス（ 図1）を介してこれらのデバイスの表面に付着されています。まず、表面をきれいにし、酸素プラズマまたはピラニア溶液のいずれかにデバイスを公開することにより、ヒドロキシル基を移入します。第二に、私たちは加水分解および縮合反応によりヒドロキシル基に第一級アミンで終端シランカップリング剤を添付する蒸着を使用しています。第三に、我々はN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル化学を介して表面にビオチンを添付してください。我々は、これらの手法を選択するためのより多くのこれらの技術の開発に関する情報と同様に、私たちの動機の説明については、私たちの前の仕事に興味のある読者を指示します^。8

これらの反応の成功は、同様にビオチンを添加した後、第一級アミンを添加した後、光や蛍光顕微鏡法によって評価することができます。一方、光学メートルicroscopyは、表面機能化プロトコルは、ミクロスフェアの表面に損傷を生じ、あるいは汚染、蛍光顕微鏡は、品質と均一性ビオチン分子の表面被覆率のほか、ビオチンの機能上のを確認するために使用されているかどうかを判断するために使用することができ（ストレプト）アビジンと結合する表面。表面上のアミンのカバレッジを評価するために、我々はフェアに安定した、共有結合、チオ尿素結合を形成する第一級アミンと反応し、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）の蛍光色素を使用していました。アビジンにコンジュゲートされたテキサスレッド蛍光色素、ビオチン - アビジン相互作用を介して表面にビオチンのグループにラベルを付けるために使用されています。両方のケースでは、染料は表面上の官能基と（受容体 - リガンド相互作用または共有結合のいずれかを介して）相互作用することができる選ばれました。

ここでは、3脱離基と一つの官能基を持つシランカップリング剤は、ブリッジの賭けを提供しています無機表面と有機プローブ分子を予期する。第一級アミンの機能は、安定なアミド結合を形成するためにNHSエステルと定量的に反応します。この例では、我々は、その吉側鎖NHSエステル基で修飾されたビオチンプローブ分子を使用しています。現実的には、へのプローブ分子は、NHSエステル基は、以下のプロトコルを使用して表面に追加することができます。さらに、これらのプロトコルは一般的であり、ビオチンと任意のシリカデバイスの表面を官能化することができます。

これらのプロトコルを使用して、プライマリの課題は、化学自体ではなく、シリカ微小球の処理に実際にではありません。プロトコルを通じて、ミクロスフェアは、鋭い先端がピンセットで軽く、その茎をgrapsingによって処理されるべきである、ということに注意してください。これはよく離れてミクロスフェア自体からピンセットを保持し、ステップ間の容易な輸送を可能にします。以下のプロトコルには多くのステップが明確にこの事実に対処するために設計されていますまたは。

2。ミクロスフェア作製

1. ミクロスフェアのストレージ筐体を構築します。
   1. これは通常サイズのスライドガラスの上にテープを、その両端がロールを形成するために満たした上で、スコッチテープのセクションに1を添付する。exactoナイフを使用して、正方形でxで1に段ボールの厚切りの¼をカット、段ボールへ。
   2. これは、ミクロスフェアは、周囲の環境から上昇し、分離することができるプラットフォームを作成し、その表面への損傷を防ぐことができます。
2. はさみを使用して、光ファイバのスプールから光ファイバの3インチのセクションを切る。
3. 無ニックファイバストリッパを使用して、単にシリカコアを残して、繊維の切断片の終わりの最後の0.5インチから保護ポリマーコーティングを取り除きます。優しくキムワイプで光ファイバを拭いて、メタノールで湿らせたキムワイプで残っているポリマーの表面を清掃してください。
4. 目のように、裸ファイバカッタを使用して、ストリップの端をトリミングする除去繊維の約1ミリメートルでは、光ファイバの端に残っている。
5. 垂直に取り除かエンドがダウンして直面しているような繊維を揃えるように注意しながら、CO ₂レーザ光 ​​の経路に光ファイバの被覆をはがした端を置きます。
6. CO ₂レーザーの電源をオンにして、光ファイバの被覆をはがした端の表面にそれを指示します。レーザーは2秒で約3.5％​​の電力を使用して球体に光ファイバの被覆をはがした端を溶かします。
7. ピンセットを使用して、慎重にマイクロスフェアのステム（光ファイバの非最低限の部分）を把握する。フェアハウジングにテープロールにステムを取り付けます。スライドガラスは、ペトリ皿の中で自分自身を保存することができます。これはマイクロの安全な保管が可能になります。

3。ヒドロキシル基を有する表面を移入

1. ピラニア溶液を使用する：
   1. ヒンジキャップ付き60mLのポリプロピレンバイアル中で、H、発煙量で（70:30をピラニア溶液を調製4：H 2 O _2（30重量％））発煙硫酸の11.6 mLを、続いてバイアル瓶に過酸化水素5mlを追加します。注意：耐酸性手袋を着用してください。
   2. バイアルに、少なくとも1つのミクロスフェアを保持して、スライドガラスを転送します。ミクロスフェアは、液体に接触する必要がありますが、液体は段ボールに手を触れてはいけません。必要に応じて溶液の体積を調整します。
   3. 静かにバイアルからスライドガラスを削除し、DDI H _{2 O}を含む別のプラスチックバイアルに挿入しサンプルは5分のためのソリューションに座ってみましょう。
   4. 静かにバイアルからスライドガラスを削除し、80℃オーブン°表面を乾燥させるCで10分間置きます。
2. 酸素プラズマ処理を使用する：
   1. 酸素プラズマチャンバーに少なくとも一つのミクロスフェアを含有するガラススライドを転送します。
   2. 200ミリトールに酸素分圧、および120 Wの2マイルのために酸素プラズマにサンプルを公開するためのパワーを設定nutes。
   3. プラズマチャンバーからスライドガラスを削除します。

4。表面にシランカップリング剤を取り付ける

1. ヒュームフードの真空デシケーター内に、少なくとも一つのミクロスフェアを含む、スライドガラスを配置します。
2. また、ドラフトでは、シランカップリング剤のボトルを（この例では、アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）を使用した）を開き、デシケーター中で開かれたボトルを置きます。
3. 真空デシケータに蓋を交換し、アスピレーターまたは施設の真空ラインに出口ポートを接続します。
4. 家の掃除や水のラインをオンにし、真空デシケーターを避難させる。真空シールは蓋とベースの間に形成された後、反応のタイミングを開始します。これは、薄膜の表面にシランカップリング剤を入金します。
5. 15分後、真空をオフにし、ゆっくりとデシケータに空気をできるようにポートを開きます。このカップリング剤では、15分unifoを形成するのに十分です。表面上の単分子層のrm。他のカップリング剤は、時間を調整する必要があります。

5。表面にビオチンを取り付ける

1. 約1時間ビオチンを取り付ける前に、ヒンジキャップで60 mlのポリプロピレンバイアル中で無水ジメチルスルホキシド（DMSO）にN-hydroxylsuccinimideビオチン（NHS-ビオチン）の10 mM溶液を調製する。
   1. NHS-ビオチンを冷保存されている場合は、それをマス前に室温に平衡化することができます。
   2. 完全に溶媒中でNHS-ビオチン粉末を溶解するために1時間のためのソリューションを超音波処理してください。
2. 下部にミクロスフェアを、別のプラスチックバイアルにマイクロスフェアを含有するガラススライドを転送し、バイアルの上部に生じている。
3. スライドガラス（それはバイアルに追加されているようにソリューションがフェアに触れていない）の後ろに、バイアルの側面の下のプラスチックピペット、NHS-ビオチン溶液の適切なボリュームを使用して転送。 Aミクロスフェア表面を覆うようにDDに十分なソリューションを提供します。
4. それぞれ、5 rpmと5度での速度と傾斜の角度で、室温で30分間現在ロッキングインキュベーターにDMSO溶液中で微小球とNHS-ビオチンを含むバイアル（傾斜トレイ）を配置します。
5. 静かにバイアルからスライドガラスを削除し、穏やかにDDIのH _{2 O}で満たされた別のバイアルにスライドさせ前と同じ速度と傾斜角度で別の10分間の傾斜トレイにバイアルを置きます。新鮮な水で二回するたびにこの手順を繰り返します。これは、表面から余分なDMSOを除去することができ、表面に実際に移植しなかったすべての物理的に吸着ビオチンを削除します。
6. バイアルからスライドガラスを削除し、すべての水滴が表面から除去され℃で10分間まで、または80℃オーブンに入れてください。

6。アミン末端シリカの蛍光標識

1. treatm後に存在するアミン基にラベルを付けるにはAPTMSとENTは、1 mLの無水DMSOに1mgのFITCを溶解することにより暗い部屋でFITC溶液を調製。
2. 0.1 M炭酸水素ナトリウム緩衝液1 mLにFITC溶液50μLを加えることによって6.1のソリューションを希釈します。
3. ヒンジキャップで60 mLのポリプロピレンバイアルに溶液を置き、ゆっくりとバイアルにガラススライド上に再び収容されたアミン末端ミクロスフェアを、スライドさせます。
4. 氷浴中でバイアルを配置し、サンプルは暗闇の中で最低4時間のためにFITC溶液と反応してみましょう。
5. 炭酸ナトリウム緩衝液における微小球の2つ、10分のリンスを介して過剰なフルオロフォアを削除します。前と同じように、バッファを持つヒンジキャップで60 mLのポリプロピレンバイアルを入力し、穏やかに解決策が唯一のフェアではなく、段ボール住宅を対象としていることに注意しながら、溶液中にスライドガラスをスライドさせます。アルミホイルでバイアルをカバーし、前と同じように、5度、5 rpmに設定し、チルトトレイ上にバイアルを配置します。
6. 静かにバイアルからスライドガラスを削除し、穏やかにDDI H ₂ Oを充填し、アルミ箔で覆われた別のバイアルにスライドさせます。前と同じ速度と傾斜角度で別の10分間の傾斜トレイにバイアルを置きます。新鮮な水で二回するたびにこの手順を繰り返します。これは、表面から余分な染料を除去するのに役立ちます。
7. 静かにバイアルからスライドガラスを削除し、イメージングの前に10分間80℃で設定したオーブンで乾燥させます。

7。ビオチンで終わるシリカの蛍光標識

1. リン酸緩衝化生理食塩にテキサスレッドアビジンの10μg/ mLの溶液を調製します。
2. ヒンジキャップで60 mlのポリプロピレンバイアルに溶液を加え、ゆっくりとマイクロは、単にソリューションで覆われているように、溶液中にビオチンで終わるミクロスフェアを含有するガラススライドをスライドさせます。
3. 暗所で室温で30分間反応する。
4. 2を介して過剰なフルオロフォアを削除するには、10分には、すすぎPBS緩衝液中微小球のだ。
   1. 前と同じように、バッファを持つヒンジキャップで60 mLのポリプロピレンバイアルを入力し、穏やかに解決策が唯一のフェアではなく、段ボール住宅を対象としていることに注意しながら、溶液中にスライドガラスをスライドさせます。
   2. アルミホイルでバイアルをカバーし、前と同じように、5度、5 rpmに設定し、チルトトレイ上にバイアルを配置します。
5. 静かにバイアルからスライドガラスを削除し、穏やかにDDI H ₂ Oを充填し、アルミ箔で覆われた別のバイアルにスライドさせます。前と同じ速度と傾斜角度で別の10分間の傾斜トレイにバイアルを置きます。新鮮な水で二回するたびにこの手順を繰り返します。これは、表面から余分な染料を除去するのに役立ちます。
6. 穏やかに80℃で設定したオーブン°Cの撮像前に10分間でバイアルからスライドガラスを除去し、乾燥した。

8。代表的な結果

正しく官能フェアsは、光や蛍光顕微鏡を介して識別できます。表面機能化が正しく行われた場合の検出実験中に、その高感度を維持するために、官能基後の欠陥と汚染フリーのままとすれば、表面上のビオチン分子の均一緻密な取材と、表面になるはずです。光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡は、表面被覆の品質と均一性を調べることができますが、後者をプローブに使用することができます。 図2では、我々は正しく官能微小球の例を示します。これらの画像は、官能基（ 図2a）に起因しない表面の損傷や汚染がないことを示し、ミクロスフェア表面にアミン基（ 図2b）またはビオチン基（ 図2c）のいずれかの均一な、一貫性のある範囲を示すことが。

ミクロスフェアは、正しく光マイクロイメージwiを官能されていない場合表面汚染、凝集または不均一なカバレッジ、および表面亀裂のような面で明らかな欠陥を、（ 図3）を示すでしょう。ここでは、表面に試薬の凝集に起因する表面汚染の一般的な例を参照してください。

図1シリカミクロスフェアの表面にプローブ分子を取り付けるための3ステップの反応スキームは拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2シリカミクロスフェア。シリカ微小球の）光学顕微鏡写真は、酸素プラズマへの暴露を介してヒドロキシル基に移入し、b）シリカ微小球の蛍光顕微鏡写真は、一級アミン移入とFITC色素で標識された、シリカマイルのc）蛍光顕微鏡写真crosphereは、ビオチンが取り込まとテキサスレッド - アビジン複合体で標識された。 Soteropulos、CE、ハント、HK＆アルマーニから許可を得て転載、ウィスパリングギャラリーモードマイクロキャビティを用いた結合速度の測定です。APPL。 PHYS。 Lett 99、103703から103703（2011）。著作権2011年米国物理学会¹⁷

図3。不適切な官能球の光学顕微鏡写真。ここでは、右上の表面にほこりを参照してください。と同様に、汚染表面をオフに延長することができます。さらに、光マイクロの右側には、表面に小さな窪みを示しています。

プロトコルに記載されているように、我々はこれによって官能化プロセス全体を通して茎シリカミクロスフェアを輸送するためにハウジングのプラットフォームを作成しました。このハウジング·プラットフォームは、官能化プロセス全体で使用される様々な容器の壁に接触するミクロスフェアに起因する表面の汚染や損傷に対する解決策として作成されました。私たちは常に官能プロセス中に別の容器に個々の微小球を着脱から生じた主な難しさを実現しました。それは茎の上に保持することによりピンセットでそれぞれ個別に移動するときにオブジェクトに対してミクロスフェアをブラッシングを避けるために大変でした。スライドガラス上の各微小球の位置を安定化させることにより、我々は、単にスライドガラスではなく、微小球の幹細胞を処理することにより、別のコンテナの中と外微小球の数を移動することができました。このように、我々はこれらのdevの多くを官能化することができました同時に氷、私たちは無傷で、官能ミクロスフェアの作成〜90％の成功率で、その結果、不適切な取り扱いによって汚染や表面の損傷を排除した。

プロトコルで述べたように、我々は、これによってシリカ微小球をヒドロキシル基を導入する2つの方法を検討した。ピラニア溶液は、一般的にこのために使用されていますが、それは時間がかかること、および湿式化学を必要とすることができます。ミクロスフェアを使用する場合は、我々は、酸素プラズマ処理によりヒドロキシル化の優位性を指摘した。酸素プラズマ処理は、液体溶液との接触、無乾燥、シリカミクロスフェアのない処理を必要としません。さらに、ヒドロキシル基で表面を移入するにははるかに速いプロセスである。しかし、我々は、必ずしもすべての研究グループは、酸素プラズマ装置にアクセスする必要がありますことを認識し、したがって、必要なヒドロキシル官能基を​​形成するためにピラニア溶液を使用する必要があります。どちらを使用すると、上のヒドロキシル基の形成になります表面。

表面官能基の間に汚染の防止が大きな問題ですが、それはプロトコルに注意して遵守することで最小限に抑えることができます。汚染の可能性が最も高い原因は、官能基の間に貧しい処理と同様に、反応の各ステップ後の表面の不適切または非徹底的な洗浄があります。これは、特に表面は水酸基が移入された最初の反応工程、中のケースです。ピラニア溶液は、このメソッドのために選択されている場合は徹底的に表面から硫酸を除去するために、徹底的にフェアを乾燥させ、表面は現在、非常に親水性であるように、とリンスからの水の表面にしがみついて、注意を払わなければなりません。硫酸は、表面上に残っている場合は、マイクロスフェアは、 "スティッキー"になり、実験室環境からのダストがより容易に表面に収集します。さらに、表面に水滴がワットの領域に集まるようにシランカップリング剤を引き起こす蛍光顕微鏡で凝集と見られている高分子シリカのglobを形成するER滴、。表面の凝集が発生した場合、それがために、デバイスの感度が大きく低下により、検出実験で使用されているからフェアを防ぐことができます。一般的に、酸素プラズマ処理が使用されている場合、表面凝集と同様に、汚染が最小化されています。ただし、すべての研究室では、この装置へのアクセス権を持っていないので、ピラニア溶液を使用する必要があります。

最後に、我々はそれが完全にDMSOでNHS-ビオチンを溶解するために使用する前にNHS-ビオチン溶液を超音波処理する必要があった。このステップはスキップされたときに、NHS-ビオチンは、物理吸着ではなく、表面に共有結合を介した大きな塊の表面に堆積させるだろう。これらの大きな塊は、洗浄工程中に除去することが極めて困難であるが、最初の解散時に適切な散布によって防止することができます。一時間は、通常、この目的のために十分である;これらの手順はNHSエステル基で修飾された他のプローブ分子に拡張されている場合は、我々は完全な溶解を確実にするために動的光散乱を介してソリューションを評価することをお勧めします。

ここで詳述プロトコルは、表面被覆率とデバイスの接触面の品質はデバイスの最終的な使用のために等しく重要であり、三次元デバイスの平面シリカ表面の化学的性質の翻訳で一歩前進を表しています。これらのプロトコルが使用されている場合、完全に官能ミクロスフェアは、表面上の汚染がないか、凝集して、プローブ分子の均一緻密な取材を示した。この均一な表面被覆率は、これらのデバイスは検出実験で使用されている高感度の維持が可能になります。無機基板との生物学的プローブ分子間のブリッジとしてシランカップリング剤の使用は単純明快であり、特に（そして非常にCよく理解して、使用することができますommon）NHSエステルは、化学、様々な種類のプローブ分子と光バイオセンサー表面を移入する。