Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

1. Achtergrond

De biotine aan het oppervlak van deze apparaten via een slechts drie stappen (figuur 1). Eerst schoongemaakt het oppervlak en vullen met hydroxylgroepen door blootstelling van de apparaten een zuurstofplasma of piranha oplossing. Tweede we opdampen de silaan afgesloten met een primaire amine om de hydroxylgroepen door hydrolyse en condensatie reactie bevestigen. Derde hechten wij biotine aan het oppervlak via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester chemie. We sturen de geïnteresseerde lezer naar onze eerdere werk voor meer informatie over de ontwikkeling van deze technieken, evenals een uitleg van onze motivatie voor het kiezen van deze technieken. ⁸

Het succes van deze reacties kunnen worden geëvalueerd door optische microscopie en fluorescentie na de toevoeging van het primaire amine, en na de toevoeging van de biotine. Daar waar optische microscopy kan worden gebruikt om te bepalen of het oppervlak functionalisering protocollen gevolg schade aan de microsfeer oppervlak of verontreiniging wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de kwaliteit en uniformiteit van oppervlaktebedekking van de biotinemolecuul verifiëren alsmede het vermogen van de biotine op het oppervlak binden (strept) avidine. Om het bereik van aminen evalueren op het oppervlak gebruikten we fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) fluorescerende kleurstof, dat reageert met primaire aminen aan stabiele covalente binding te vormen thioureum de microsfeer. Texas fluorescerende kleurstof is geconjugeerd avidine wordt gebruikt om de biotine groepen aan het oppervlak label door het biotine-avidine interactie. In beide gevallen werden kleurstoffen gekozen dat (via een receptor-ligand interacties of covalente binding) samenwerken met de functionele groepen aan het oppervlak.

Hier Het silaan koppelingsreagens, die drie vertrekkende groepen en een functionele groep bepaalt de brug betsen de anorganische en organische oppervlak probe molecule. De primaire aminefunctionaliteit reageert kwantitatief met NHS esters vormen stabiele amidebindingen. In dit geval gebruik gemaakt van een biotine probe molecuul waarvan valeriaanzuur zijketen is gemodificeerd met NHS estergroep. Realistisch een probe molecule waaraan een NHS estergroep kunnen worden toegevoegd aan het oppervlak met de volgende protocollen. Bovendien deze protocollen algemeen en kan worden gebruikt om silica inrichting oppervlak te functionaliseren met biotine.

De belangrijkste uitdaging met deze protocollen is niet echt in de chemie zelf, maar eerder in de behandeling van de silica microsferen. Houd er rekening mee dat gedurende de protocollen, de microsferen dienen te worden behandeld door grapsing hun stengels licht met scherpe-tip pincet. Dit houdt de pincet uit de buurt van de microsferen zelf, en zorgt voor een gemakkelijk transport tussen de stappen. Veel stappen in het protocol hieronder zijn specifiek ontworpen om dit feit aan te pakkenof.

2. Microsphere Fabrication

1. Bouw de opslag behuizing voor de microsferen.
   1. Met behulp van een Exacto mes, sneed een ¼ in dik stuk karton in een 1 cm x 1 in vierkante, deze tape op een normale grootte glasplaatje, en bevestig een 1 in rubriek van Scotch-tape, met de uiteinden aan om een ​​rol te vormen , het karton.
   2. Hierdoor ontstaat een platform waarop de microsfeer kan worden verhoogd en geïsoleerd van de omgeving en voorkomt schade aan het oppervlak.
2. Met behulp van schaar, knipte een 3 inch doorsnede van optische vezel uit een spoel van glasvezel.
3. Met behulp van een No-Nik fiber-stripper, strip de beschermende polymère bekleding van de laatste 0,5 cm van het einde van het losse stuk van vezels, waardoor alleen de silica kern. Reinig het oppervlak van de resterende polymeer met een Kimwipe bevochtigd met methanol door voorzichtig af te vegen de vezel met de Kimwipe.
4. Met behulp van een kale glasvezel hakmes, trim het gestripte uiteinde zo eslechts ongeveer 1 mm, gestripte vezel blijft het einde van de vezel.
5. Leg het gestripte uiteinde van de optische vezel in de baan van een CO ₂ laser, zorg ervoor dat verticaal uitlijnen van de vezel zodanig dat de gestripte uiteinde naar beneden is gericht.
6. Zet de CO ₂ laser, en leidt het oppervlak van het gestripte uiteinde van de optische vezel. De laser smelt het gestripte einde van de vezel in een bol met ongeveer 3,5% vermogen van 2 seconden.
7. Behulp van een pincet, pakt voorzichtig de stam (de niet-gestripte deel van de optische vezel) van de microsfeer. Bevestig de steel aan de tape rol op de microsfeer behuizing. De glasplaatje kunnen worden opgeslagen zich in een petrischaal. Hierdoor veilige opslag van de microsfeer.

3. Bevolken het oppervlak met hydroxylgroepen

1. Met piranha oplossing:
   1. In een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierende kap, bereiden een piranha-oplossing (70:30 volume rokend H 4: H ₂ O ₂ (30 gew%)) door toevoeging van 5 ml van waterstofperoxide de flacon, gevolgd door 11,6 ml rokend zwavelzuur. LET OP: draag zuurbestendige handschoenen.
   2. Breng het glasplaatje, die ten minste een microsfeer, aan de injectieflacon. De microsfeer dient in contact met de vloeistof, maar de vloeistof niet raken karton. Pas het volume van de oplossing indien nodig.
   3. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon en plaats deze in een ander plastic flacon met DDI H ₂ O. Laat de monsters zitten in de oplossing 5 minuten.
   4. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, en plaats deze een oven op 80 ° C gedurende 10 minuten aan het oppervlak drogen.
2. Met zuurstof plasmabehandeling:
   1. Breng het objectglaasje met ten minste een microsfeer de zuurstofplasma kamer.
   2. Stel de zuurstofdruk tot 200 mTorr, en de kracht tot 120 W. het monster bloot te stellen aan de zuurstof plasma voor 2 miMINUTEN.
   3. Verwijder de glazen dia uit het plasma kamer.

4. Bevestiging van silaan koppelingsmiddelen aan de Surface

1. Plaats het glasplaatje, die tenminste een microsfeer, in een vacuümexsiccator in een zuurkast.
2. Ook in de zuurkast, opent u het silaan fles (in dit geval, aminopropyltrimethoxysilaan (APTMS) werd gebruikt), en plaats de geopende fles in de exsiccator.
3. Plaats het deksel op de vacuüm exsiccator, en bevestig het uiteinde aan een aspirator of huis vacuüm lijn.
4. Zet het huis vacuüm of de waterleiding, en evacueren het vacuüm exsiccator. Wanneer een vacuüm afdichting wordt gevormd tussen het deksel en de basis, de tijdsduur van de reactie. Dit deponeren silaan op het oppervlak als een dunne film.
5. Na 15 minuten, schakelt u het vacuüm, en langzaam opent de poort om lucht te laten in de exsiccator. Voor dit hechtmiddel 15 minuten is voldoende om een ​​vorming uniform monolaag op het oppervlak. Voor andere koppelaars, kan de tijd moeten worden aangepast.

5. Bevestigen van biotine aan de Surface

1. Ongeveer een uur voor het bevestigen van de biotine, stelt een 10 mM oplossing van N-hydroxylsuccinimide biotine (NHS-biotine) in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) in een 60 ml flesje polypropyleen met een scharnierende kap.
   1. Als de NHS-biotine is opgeslagen koude, laat het dan op kamertemperatuur evenwicht voordat Massing het uit.
   2. Sonificeer de oplossing gedurende 1 uur de NHS-biotine poeder volledig oplossen in het oplosmiddel.
2. Breng het objectglaasje met de microsfeer in een plastic flesje met de microsferen op de bodem, en stengels aan de bovenkant van de flacon.
3. Transfer, met behulp van een plastic pipet, een zodanige hoeveelheid van het NHS-biotine-oplossing langs de zijkant van de flacon, achter de glazen dia (dus de oplossing niet raakt de microsfeer als het wordt toegevoegd aan de flacon). Eendd voldoende oplossing van het microbolletje oppervlak.
4. Plaats de vaatjes nu met de microsferen en NHS-biotine in DMSO-oplossing op een schommelende incubator (kantelblad) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, de snelheid en hellingshoek bij 5 opm en 5 graden, respectievelijk.
5. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H ₂ O. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige DMSO van het oppervlak, en verwijdert alle fysisch-geadsorbeerde biotine die niet echt graft aan de oppervlakte.
6. Verwijder het glaasje van de flacon en plaatst deze in een oven bij 80 ° C gedurende 10 minuten tot alle waterdruppels van het oppervlak verwijderd.

6. TL-etikettering van amine-beëindigde silica

1. Om de aminegroepen aanwezig na treatm labelENT met APTMS, de voorbereiding van de FITC oplossing in een donkere kamer door het oplossen van 1 mg FITC in 1 ml watervrij DMSO.
2. Verder verdund in 6,1 door toevoeging van 50 pi van de FITC oplossing 1 ml 0,1 M natrium bicarbonaat buffer.
3. Plaats de oplossing in een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierende kap en voorzichtig de amine-beëindigde microsferen, weer gehuisvest op het glasplaatje, schuift u in de flacon.
4. Plaats de flacon in een ijsbad en laat het monster reageren met de FITC oplossing ten minste 4 uur in het donker.
5. Verwijder overtollig fluorofoor door middel van twee, tien minuten spoelingen van de microsferen in natriumcarbonaat buffer. Net als voorheen, vul een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierend deksel met de buffer, en schuif het glaasje in de oplossing, zorg dat de oplossing alleen de microsferen, en niet de kartonnen deksels. Bedek de flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op een tilt-tray vastgesteld op 5 graden en 5 toeren per minuut, zoals voorheen.
6. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H ₂ O en bedekt met aluminiumfolie. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige kleurstof van het oppervlak.
7. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, en droog in een oven op 80 C gedurende 10 minuten voor de beeldvorming.

7. TL-etikettering van biotine-beëindigde silica

1. Bereid een 10 pg / ml oplossing van Texas-rood avidine in fosfaat gebufferde zoutoplossing.
2. Voeg de oplossing 60 ml flesje polypropyleen met een scharnierend deksel, en schuif het objectglaasje met een biotine-getermineerde microsfeer in de oplossing, zodat de microsfeer net onder de oplossing.
3. 30 minuten reageren bij kamertemperatuur in het donker.
4. Verwijder overtollig fluorofoor door middel van twee, tien minuten spoels van de microsferen in PBS buffer.
   1. Net als voorheen, vul een 60 ml polypropyleen flacon met een scharnierend deksel met de buffer, en schuif het glaasje in de oplossing, zorg dat de oplossing alleen de microsferen, en niet de kartonnen deksels.
   2. Bedek de flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op een tilt-tray vastgesteld op 5 graden en 5 toeren per minuut, zoals voorheen.
5. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon, voorzichtig en schuif in een ander flesje gevuld met DDI H ₂ O en bedekt met aluminiumfolie. Plaats de flacon op de kantelblad nog 10 minuten bij dezelfde snelheid en de hellingshoek als tevoren. Twee keer Herhaal deze stap met vers water per keer. Dit helpt bij het verwijderen overtollige kleurstof van het oppervlak.
6. Verwijder voorzichtig het glaasje van de flacon en droog in de oven, ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten voor de beeldvorming.

8. Representatieve resultaten

Correct gefunctionaliseerde microsfeers kunnen worden geïdentificeerd door middel van optische en fluorescentie microscopie. Als het oppervlak functionalisering is juist, zal dit resulteren in een gelijkmatig dekkend van biotine moleculen op het oppervlak en het oppervlak te defect en verontreinigingen vrij blijft nadat functionalisering om hun hoge gevoeligheid te behouden tijdens detectie experimenten. Optische microscopie kan worden gebruikt om deze probe, terwijl fluorescentiemicroscopie de kwaliteit en uniformiteit van dekvlak sonde. In figuur 2 wordt tonen voorbeelden van gefunctionaliseerde kunnen microsferen. Deze beelden tonen dat er geen beschadiging van het oppervlak of besmetting door functionalisering (Fig. 2a) en dat de microsferen een uniforme, uniforme bedekking van beide aminogroepen (Fig. 2b) of biotine groepen (Fig. 2c) waarvan het oppervlak .

Indien de microsferen niet correct gefunctionaliseerd de optische microsfeer beelden wizal vertonen besmetting van het oppervlak, samenklontering of niet-uniforme dekking, en duidelijke gebreken in het oppervlak, zoals het oppervlak scheuren (figuur 3). Hier zien we een bekend voorbeeld van besmetting van het oppervlak, als gevolg van samenklontering van de reagentia aan de oppervlakte.

Figuur 1. Drie stappen reactieschema voor bevestiging probe moleculen op het oppervlak van silica microsferen. klik hier grotere figuur zien .

Figuur 2. Silica microsferen. a) Optische microfoto van silica microsfeer gevuld met hydroxylgroepen via blootstelling aan zuurstofplasma b) TL microfoto van silica microsfeer gevuld met primaire aminen en voorzien FITC kleurstof c) TL microfoto van silica microsphere bevolkt met biotine en gelabeld met Texas Red-avidine conjugaat. Overgenomen met toestemming van Soteropulos, CE, Hunt, HK & Armani, AM Bepaling van bindingskinetiek gebruik van Whispering Gallery-modus microcavities. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703 tot 103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics. ¹⁷

Figuur 3. Optische microscoop foto van onjuist gefunctionaliseerde bol. Hier ziet u stof op het rechts boven het oppervlak, maar ook als verontreiniging uitbreiding van het oppervlak. Bovendien is de rechterzijde van de optische microsfeer toont een graszode op het oppervlak.

Zoals beschreven in de protocollen we een behuizing platform waarop de silica microsferen transporteren naar hun stelen in de functionalisering proces. Deze behuizing platform is gemaakt als een oplossing aan het oppervlak vervuiling en beschadiging dat het gevolg is van het microbolletje in aanraking met de wanden van de verschillende houders gebruikt in de functionalisering proces. We realiseerden ons dat het grootste probleem is ontstaan ​​uit voortdurend bevestigen en verwijderen individuele microsferen naar verschillende containers tijdens de functionalisering proces. Het was moeilijk om te voorkomen dat het poetsen van de microsfeer tegen een object bij het verplaatsen van elk afzonderlijk met een pincet door het bedrijf op de stengels. Door het stabiliseren van de positie van elk microsfeer op het glaasje konden we een aantal microsferen eenvoudig in en uit de verschillende houders door behandeling van het glasplaatje, en niet de steel van de microsfeer. Op deze manier konden we veel van deze dev functionaliserenijs op hetzelfde moment, en we geëlimineerd vervuiling en beschadigingen van het oppervlak gevolg van ondeskundig gebruik, wat resulteert in een ~ 90% kans op succes van het creëren van onbeschadigd, gefunctionaliseerde microsferen.

Zoals vermeld in de protocollen, hebben we onderzocht twee methoden waarmee de silica microsferen hydroxylate. Hoewel piranha oplossing wordt dit meestal kan het tijdrovend en vereist natchemische. Bij het werken met microbolletjes, hebben we kennis genomen van de superioriteit van hydroxylering door zuurstof plasma behandeling. Zuurstofplasma behandeling vereist geen contact met vloeibare oplossingen, zonder drogen en geen behandeling van de silica microsferen. Bovendien is een veel sneller proces op het oppervlak vullen met hydroxylgroepen. Echter, we erkennen dat niet elk lectoraat zal de toegang tot zuurstof plasma-apparatuur, en daarom kan nodig zijn om piranha oplossing te gebruiken om de vereiste hydroxylfunctionaliteit te vormen. Het gebruik van een resulteert in de vorming van hydroxylgroepen ophet oppervlak.

Het voorkomen van verontreiniging tijdens het oppervlak functionalisering is een groot probleem, maar het kan geminimaliseerd worden door een zorgvuldige naleving van de protocollen. De meest waarschijnlijke oorzaak van verontreiniging arm behandeling gedurende functionalisering alsmede onjuist of niet grondig wassen van het oppervlak na elk van de reactiestappen. Dit is vooral het geval bij de eerste reactiestap, waarbij het oppervlak wordt gevuld met hydroxylgroepen. Als de piranha oplossing wordt gekozen voor deze werkwijze dient men elke zwavelzuur volledig verwijderen van het oppervlak en grondig drogen microsfeer, omdat het oppervlak is nu zeer hydrofiele en water uit de spoelen vast aan het oppervlak. Als zwavelzuur blijft op het oppervlak, de microsfeer wordt "sticky" en stof van het laboratorium verzamelt op het oppervlak beter. Bovendien waterdruppels op het oppervlak veroorzaken silaan samenkomen in het gebied van de watre druppels, die een polymeer silica glob, die als klonteren de fluorescerende microfoto. Als oppervlakte klontering optreedt is, voorkomt de microsfeer wordt gebruikt in detectie experimenten vanwege een grote daling van de gevoeligheid van de inrichting. Gewoonlijk wanneer zuurstof plasmabehandeling wordt gebruikt, wordt het oppervlak klontering, en verontreiniging geminimaliseerd. Echter, niet elk laboratorium heeft toegang tot deze apparatuur, zodat het gebruik van de piranha oplossing kan zijn een noodzaak.

Tot slot vonden we het nodig was om de NHS-biotine-oplossing voor ultrasone trillingen om te gebruiken om volledig tot ontbinding van de NHS-biotine in DMSO. Bij deze stap overgeslagen, zou de NHS-biotine neer op het oppervlak in grote klonten via fysische adsorptie plaats covalent binden aan het oppervlak. Deze grote klonten zijn zeer moeilijk te verwijderen tijdens de wasstappen, maar kan worden voorkomen door juiste dispersie tijdens de eerste oplossing. Een uur is voldoende voor dit doel;Echter, als deze procedures worden uitgebreid tot andere probe-moleculen gemodificeerd met NHS estergroepen, raden wij aan het evalueren van de oplossing met behulp van dynamische lichtverstrooiing tot volledige ontbinding te garanderen.

De protocollen die hier worden beschreven zijn een stap voorwaarts in de vertaling van vlakke silica oppervlakchemie tot drie-dimensionale apparaten, waar de kwaliteit van de bedekking van het oppervlak en het apparaat oppervlak even belangrijk zijn voor het uiteindelijke gebruik van de apparaten. Wanneer deze protocollen gebruikt, volledig gefunctionaliseerde microsferen vertoonden gelijkmatig dekkend van de sonde molecule, zonder verontreiniging of klonteren op het oppervlak. Deze uniforme bedekking van het oppervlak zorgt voor de handhaving van hoge gevoeligheden wanneer deze apparaten worden gebruikt in detectie experimenten. Het gebruik van silaan koppelingsmiddelen een brug tussen de anorganisch substraat en de biologische probe molecule is eenvoudig en kan worden gebruikt, met name de goed begrepen (zeer cEMEENSCHAPPELIJKE) NHS ester chemie, optische biosensor oppervlakken vullen met probe-moleculen van verschillende typen.