Bifoga Biologiska sönder för att Silica optiska biosensorer med användning av silan Koppling ombud

1. Bakgrund

Biotin är fäst till ytan av dessa anordningar genom en enkel, trestegsprocess (figur 1). Först rengör vi ytan och fylla den med hydroxylgrupper genom att exponera enheter antingen syre plasma eller Piranha lösning. Andra använder vi ångavsättning för att fästa silankopplingsmedel terminerad med en primär amin till hydroxylgrupperna genom hydrolys och kondensation reaktion. Det tredje fäster vi biotin till ytan via N-hydroxisuccinimid (NHS)-ester kemi. Vi riktar den intresserade läsaren till vårt tidigare arbete för mer information om utvecklingen av dessa tekniker, samt en förklaring av vår motivation för att välja dessa tekniker. ⁸

Framgången för dessa reaktioner kan utvärderas genom optisk och fluorescensmikroskopi efter tillsatsen av den primära aminen, såväl som efter tillsats av biotin. Medan optisk microscopy kan användas för att bestämma om de ytfunktionalisering protokoll ledde till skada på mikrosfärens yta, eller till och med kontaminering, är fluorescens-mikroskopi användes för att kontrollera kvaliteten och likformigheten av yttäckning av biotin-molekylen, såväl som förmågan hos biotin för ytan för att binda med (strept) avidin. För att utvärdera omfattningen av aminer på ytan, använde vi fluoresceinisotiocyanat (FITC) fluorescerande färgämne, som reagerar med primära aminer för att bilda stabila, kovalenta tioureabindning till mikrosfären. Texas Red fluorescerande färgämne som har konjugerats till avidin används för att märka biotingrupper på ytan genom biotin-avidin-interaktionen. I båda fallen färgämnen valdes som kan interagera (genom antingen receptor-ligand interaktioner eller kovalent bindning) med funktionella grupper på ytan.

Här tillhandahåller silankopplingsmedel, som har tre lämnande grupper och en funktionell grupp, bron insatsenlan den oorganiska ytan och organiska probmolekyl. Den primära aminens funktionalitet reagerar kvantitativt med NHS-estrar för att bilda stabila amidbindningar. I det här fallet använder vi en biotinproben molekyl vars valeriansyra sidokedjan har modifierats med en NHS-ester grupp. Realistiskt, en NHS-ester-grupp valfri sond-molekyl till vilken kan sättas till ytan med hjälp av följande protokoll. Dessutom är dessa protokoll är generellt och kan användas för att funktionalisera en yta kiseldioxid anordning med biotin.

Den främsta utmaningen med dessa protokoll är faktiskt inte i kemin sig, utan snarare i hanteringen av kiseldioxid mikrosfärer. Observera att hela protokollen bör mikrosfärer hanteras av grapsing sina stjälkar lätt med skarp spets pincett. Detta håller pincetten borta från mikrosfärer själva, och tillåter enkel transport mellan stegen. Många steg i protokollet nedan är speciellt utformade för detta faktumeller.

2. Mikrosfär Fabrication

1. Bygga lagring huset för mikrosfärerna.
   1. Med en Exacto kniv, skär ett ¼ i tjock bit kartong i en 1 x 1 i kvadrat, band här på en vanlig storlek glasskiva, och bifoga en 1 i avsnitt av Scotch tejp, med sina ändar samlas för att bilda en rulle , vid kartongbiten.
   2. Detta skapar en plattform på vilken mikrosfären kan höjas och isoleras från den omgivande miljön, och förhindrar skada på sin yta.
2. Hjälp av en sax skär en 3 tum sektion av optisk fiber från en spole av optisk fiber.
3. Med hjälp av en No-Nik fiber-stripper, skala den skyddande polymerbeläggningen från de senaste 0,5 inches från slutet av den avskurna delen av fiber, vilket bara kiseldioxid kärnan. Rengör ytan eventuellt kvarvarande polymer med en Kimwipe fuktad med metanol genom att försiktigt torka fibern med Kimwipe.
4. Med hjälp av en ren fiber köttyxa, trimma den skalade änden så etill endast ungefär 1 millimeter strippades fibern blir kvar på änden av fibern.
5. Placera den skalade änden av den optiska fibern in i banan av en CO ₂ laser, var noga med att vertikalt anpassa fibern så att dess avskalade änden är vänd nedåt.
6. Slå på _CO2-laser, och styra den till ytan av den avskalade änden av den optiska fibern. Lasern kommer att smälta den avskalade änden av fibern in i en sfär med användning av ca 3,5% effekt i 2 sekunder.
7. Med en pincett, noggrant gripa skaftet (den icke-avskalade delen av den optiska fibern) av mikrosfären. Fästa skaftet till tejprullen på mikrosfären höljet. Glasskivan kan själv lagras i en petriskål. Detta tillåter säker lagring av mikrosfären.

3. Fylla den yta med hydroxylgrupper

1. Med Piranha lösning:
   1. I en 60 ml polypropylen injektionsflaska med ett ledat lock, bereda en piraya-lösning (70:30 volym rykande H 4: H ₂ O ₂ (30 vikt-%)) genom att tillsätta 5 ml väteperoxid till flaskan, följt av 11,6 ml av rykande svavelsyra. VARNING: Använd syra-handskar.
   2. Överför glasskiva, hålla minst 1 mikrosfär till flaskan. Mikrosfärens bör vara i kontakt med vätskan, men vätskan bör inte komma i kontakt kartong. Justera volymen av lösningen om så erfordras.
   3. Ta försiktigt bort glasskiva från flaskan och sätt in den i en annan plast flaskan med DDI H ₂ O. Låt proverna sitta i lösningen under 5 minuter.
   4. Försiktigt bort glasskiva från flaskan, och placera den en ugn vid 80 ° C under 10 minuter för att torka ytan.
2. Användning behandling syreplasma:
   1. Överföra glasskiva som innehåller åtminstone en mikrosfär för syreplasma kammaren.
   2. Ställ syretrycket till 200 mTorr, och makten till 120 W. Exponera provet syre plasma för 2 milnutes.
   3. Avlägsna glasskiva från plasmakammaren.

4. Fästa Silane Coupling Agents till ytan

1. Placera objektglaset, som innehåller åtminstone en mikrosfär, i en vakuumexsickator i ett dragskåp.
2. Även i dragskåp, öppna silan flaskan kopplingsmedlet (i detta fall aminopropyltrimetoxisilan (APTMS) som används), och placera den öppnade flaskan i exsickator.
3. Sätt tillbaka locket på vakuumexsickator och fäst utloppet till en aspirator eller hus vakuumledningen.
4. Slå på husvakuum eller vattenlinjen, och evakuera vakuumexsickator. Gång en vakuumtätning bildas mellan locket och basen, börja tidstyrande av reaktionen. Detta kommer att deponera silankopplingsmedel på ytan som en tunn film.
5. Efter 15 minuter, stäng av vakuum och långsamt öppnar porten för att släppa in luft i exsickator. För detta kopplingsmedel, är 15 minuter tillräcklig för att bilda en uniform monoskikt på ytan. För andra kopplingsmedel, kan tiden behöva justeras.

5. Fästa Biotin till ytan

1. Cirka en timme innan fastsättning av biotin, framställa en 10 mM lösning av N-hydroxylsuccinimide biotin (NHS-biotin) i vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) i en 60 ml polypropen ampull med en ledad kåpa.
   1. Om NHS-biotin har lagrats kallt, låt det utjämna till rumstemperatur innan anhopning det.
   2. Sonikera lösningen under 1 timme för att fullständigt upplösa den NHS-biotin pulver i lösningsmedlet.
2. Överföra glasskiva som innehåller mikrosfärer in i en annan plastflaska, med mikrosfärerna vid botten, och beror på den övre delen av flaskan.
3. Överföring, med användning av en plastpipett, en lämplig volym av NHS-biotin-lösning nedför sidan av flaskan, bakom glasskiva (så att lösningen inte vidrör mikrosfären när den tillsätts till flaskan). Endd räcker lösning för att täcka mikrosfärytan.
4. Placera rören nu innehållande mikrosfärer och NHS-biotin i DMSO-lösning på ett vaggande inkubator (tipptråget) under 30 minuter vid rumstemperatur, med hastigheten och lutningsvinkeln vid 5 varv per minut och 5 grader respektive.
5. Ta försiktigt bort glasskiva från flaskan, och försiktigt dra den i en annan flaska fylld med DDI H ₂ O. Placera flaskan i tipptråget under ytterligare 10 minuter vid samma hastighet och lutningsvinkel som tidigare. Upprepa detta steg två gånger med färskt vatten varje gång. Detta hjälper till att avlägsna överskott DMSO från ytan, och avlägsnar eventuella fysiskt adsorberade biotin som inte faktiskt transplantat till ytan.
6. Avlägsna glasskiva från flaskan, och placera den i en ugn vid 80 ° C under 10 minuter, eller tills dropparna avlägsnas från ytan.

6. Fluorescensmärkning av amin-terminerad kiseldioxid

1. Att märka amingrupperna närvarande efter Treatment med APTMS, förbereda FITC lösningen i ett mörklagt rum genom upplösning av 1 mg FITC i 1 ml vattenfri DMSO.
2. Späd ut lösningen i 6,1 genom tillsats av 50 pl av FITC-lösning till 1 ml av 0,1 M natriumbikarbonat-buffert.
3. Placera lösning i en 60 ml polypropen ampull med en ledad kåpa, och försiktigt skjuta aminterminerad mikrosfärer, inrymt på nytt på objektglas, in i flaskan.
4. Placera flaskan i ett isbad, och låt provet reagera med FITC-lösning under minst 4 timmar i mörker.
5. Avlägsna överskott av fluoroforen genom två, 10 minuters sköljningar av mikrosfärerna i natriumkarbonatbuffert. Såsom tidigare, fyller en 60 ml polypropen ampull med en ledad kåpa med bufferten, och försiktigt ut det glasskiva i lösningen, varvid försiktighet att lösningen endast omfattar mikrosfären, och inte kartong höljet. Täcka kärlet med aluminiumfolie och placera flaskan på ett bricktippnings inställd på 5 grader och 5 rpm, såsom tidigare.
6. Ta försiktigt bort glasskiva från flaskan, och försiktigt dra den i en annan flaska fylld med DDI H ₂ O och täckt med aluminiumfolie. Placera flaskan i tipptråget under ytterligare 10 minuter vid samma hastighet och lutningsvinkel som tidigare. Upprepa detta steg två gånger med färskt vatten varje gång. Detta hjälper till att avlägsna överskott av färgämne från ytan.
7. Ta försiktigt bort glasskiva från flaskan och torka i en ugn inställd på 80 ° C i 10 minuter innan avbildning.

7. Fluorescensmärkning av biotin-terminerad kiseldioxid

1. Framställ en 10 | ig / ml lösning av Texas-Red avidin i fosfatbuffrad saltlösning.
2. Tillsätta lösningen till en 60 ml polypropen ampull med en ledad kåpa, och försiktigt skjuta glasskiva som innehåller en biotin-terminerad mikrosfär i lösningen, så att mikrosfären bara täcks av lösningen.
3. Reagera under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
4. Ta bort överflödigt fluoroforen genom två, 10 minuters sköljar av mikrosfärerna i PBS-buffert.
   1. Såsom tidigare, fyller en 60 ml polypropen ampull med en ledad kåpa med bufferten, och försiktigt ut det glasskiva i lösningen, varvid försiktighet att lösningen endast omfattar mikrosfären, och inte kartong höljet.
   2. Täcka kärlet med aluminiumfolie och placera flaskan på ett bricktippnings inställd på 5 grader och 5 rpm, såsom tidigare.
5. Ta försiktigt bort glasskiva från flaskan, och försiktigt dra den i en annan flaska fylld med DDI H ₂ O och täckt med aluminiumfolie. Placera flaskan i tipptråget under ytterligare 10 minuter vid samma hastighet och lutningsvinkel som tidigare. Upprepa detta steg två gånger med färskt vatten varje gång. Detta hjälper till att avlägsna överskott av färgämne från ytan.
6. Försiktigt bort glasskiva från flaskan, och torka i en ugn inställd på 80 ° C under 10 minuter före avbildning.

8. Representativa resultat

Korrekt funktionaliserad mikrosfärs kan identifieras genom optisk och fluorescensmikroskopi. Om ytan funktionaliseringen görs korrekt bör det resultera i en enhetlig tät täckning av biotin molekyler på ytan, och ytan bör vara defekt-och föroreningar-fri efter funktionalisering för att upprätthålla sina höga känslighet under upptäckt experiment. Optisk mikroskopi kan användas för att sondera det senare, medan fluorescensmikroskopi kan sondera kvalitet och enhetlighet yttäckning. I figur 2, visar vi exempel på riktigt funktionaliserad mikrosfärer. Dessa bilder visar att det inte finns någon yta skada eller kontaminering på grund av funktionalisering (fig. 2a), och att mikrosfärerna visar en enhetlig, jämn täckning av antingen amingrupper (Fig. 2b) eller biotingrupper (Fig. 2c) på ytan .

Om mikrosfärerna inte har funktionaliserats korrekt, den optiska mikrosfär bilder will uppvisar ytföroreningar, hopklumpning eller icke-likformig täckning och uppenbara defekter i ytan, såsom sprickor i ytan (figur 3). Här ser vi ett vanligt exempel på ytkontamination, till följd av klumpar av reagenser på ytan.

Figur 1. 3-stegs reaktionsschemat för att fästa sonden molekyler till ytan av kiseldioxid mikrosfärer. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Kiseldioxid-mikrosfärer. a) Optisk mikroskop av kiseldioxid mikrosfär befolkade med hydroxylgrupper via exponering för syre plasma, b) Fluorescerande mikroskop av kiseldioxid mikrosfär befolkade med primära aminer och märkta med FITC färgämne, c) Fluorescerande mikroskop av kiseldioxid microsphere befolkade med biotin och märkt med Texas Red-avidin konjugat. Omtryckt med tillstånd från Soteropulos, CE, Hunt, HK & Armani, AM Fastställande av bindningskinetik med viskande mikrokaviteter galleri läge. Appl. Phvs. Lett. 99, 103.703-103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics ^17.

Figur 3. Optisk mikroskop av felaktigt funktionaliserad sfär. Här kan du se damm på den övre högra ytan, liksom smitta utvidga från ytan. Dessutom visar den högra sidan av den optiska mikrosfär en liten torva på ytan.

Som beskrivs i protokollen, skapade vi ett hus plattform genom för att genom sina stammar transportera kiseldioxidmikrosfärer hela funktionalisering processen. Detta hölje plattform skapades som en lösning till ytan nedsmutsning och skada som en följd av mikrosfären som kommer i kontakt med väggarna i de olika behållarna som används i hela funktionalisering processen. Vi insåg det största problemet uppstod från att ständigt fästa och ta bort enskilda mikrosfärer till olika behållare under funktionalisering processen. Det var svårt att undvika att borsta mikrosfären mot ett objekt när du flyttar individuellt med pincett genom att hålla på stjälkarna. Genom att stabilisera läget av varje mikrosfär i den glasskiva, kunde vi helt enkelt flytta en rad av mikrosfärer i och ut ur olika behållare genom att hantera glasskiva, och inte skaftet av mikrosfären. På detta sätt kunde vi functionalize många av dessa devter samtidigt, och vi eliminerat förorening och ytan skador orsakade av felaktig hantering, vilket resulterade i en ~ 90% framgång med att skapa oskadade, funktionaliserade mikrosfärer.

Såsom anges i de protokoll har vi undersökt två metoder genom vilka till hydroxylera kiseldioxid-mikrosfärer. Medan Piranha lösning vanligen används för detta, kan det vara tidskrävande och kräver våta kemi. När du arbetar med mikrosfärer, noterade vi överlägsenhet hydroxylering genom syrgasplasma behandling. Syreplasmabehandling kräver ingen kontakt med flytande lösningar, ingen torkning och ingen hantering av kiseldioxid-mikrosfärer. Dessutom är det en mycket snabbare förfarande för att fylla på ytan med hydroxylgrupper. Men vi inser att inte alla forskargrupp kommer att ha tillgång till syre plasma utrustning och därför kan behöva använda piraya lösning för att bilda den nödvändiga hydroxylfunktionalitet. Användning av antingen kommer att resultera i bildning av hydroxylgrupper påytan.

Förebyggande av kontamination under ytan funktionalisering är en viktig fråga, men den kan minimeras genom noggrann efterlevnad av protokoll. De mest sannolika orsakerna till kontaminering är dålig hantering under funktionalisering, såväl som felaktig eller icke-noggrann tvättning av ytan efter var och en av de reaktionssteg. Detta är särskilt fallet vid det första reaktionssteget, där ytan är försett med hydroxylgrupper. Om Piranha-lösning väljs för denna metod, måste försiktighet iakttas för att grundligt avlägsna eventuellt svavelsyra från ytan, och att torka den mikrosfär, eftersom ytan är nu mycket hydrofil och sköljvatten fastnar på ytan. Om svavelsyra blir kvar på ytan, blir mikrosfär "klibbiga" och damm från laboratoriemiljö samlas på ytan lättare. Dessutom vattendroppar på ytan orsaka silankopplingsmedlet att samlas i området för den watEr droppar, som bildar en polymer kiseldioxid glob, som ses som klumpning i de fluorescerande mikrografer. Om ytan hopklumpning inträffar förhindrar den mikrosfären från att användas i detektion experiment på grund av en stor nedgång i känslighet enheten. Typiskt, när syre plasmabehandling används, är ytan klumpning, såväl som förorening, minimeras. Men inte varje laboratorium har tillgång till denna utrustning, så använder Piranha lösningen kan vara en nödvändighet.

Slutligen fann vi att det var nödvändigt att sonikera NHS-biotin-lösning före användning för att fullständigt upplösa den NHS-biotin i DMSO. När detta steg var hoppas över, skulle den NHS-biotin avsättas på ytan i stora klumpar via fysisk adsorption, snarare än kovalent bindning till ytan. Dessa stora klumpar är utomordentligt svårt att avlägsna under tvättningsstegen, men kan förhindras genom lämplig dispergering under den initiala upplösningsprofilen. En timme är vanligen tillräckligt för detta ändamål;Men om dessa förfaranden utvidgas till andra sondmolekyler modifierade med NHS estergrupper, rekommenderar vi att utvärdera den lösning via dynamisk ljusspridning att säkerställa full upplösning.

Protokollen som beskrivs här utgör ett steg framåt i översättningen av plana kemiska kiseldioxidyta till tre-dimensionella enheter, där kvaliteten på yttäckning och enheten ytan är lika viktiga för den slutliga användningen av enheterna. När dessa protokoll används visade fullständigt funktionaliserade mikrosfärerna likformigt tät täckning av probe-molekylen, utan förorening eller hopklumpning på ytan. Denna enhetlig yttäckning medger upprätthållande av hög känslighet när dessa anordningar används vid detektering experiment. Användningen av silankopplingsmedel som en bro mellan den oorganiska substrat och den biologiska probmolekyl är enkelt och okomplicerat, och kan användas, särskilt med väl förstått-(och mycket CEMENSAM) NHS-ester kemi, för att fylla optisk biosensor ytor med sondmolekyler av olika typer.