Collegamento sonde biologiche ai biosensori ottici che utilizza silice agenti di accoppiamento silanici

1. Fondo

La biotina è attaccata alla superficie di questi dispositivi tramite un semplice processo in tre fasi (Figura 1). Per prima cosa, pulire la superficie e popolarlo con gruppi ossidrilici esponendo i dispositivi a uno plasma di ossigeno o di una soluzione piranha. In secondo luogo, usiamo deposizione di vapore per collegare l'agente di accoppiamento di silano terminati con un'ammina primaria ai gruppi ossidrilici mediante idrolisi e reazione di condensazione. In terzo luogo, ci attacchiamo biotina in superficie attraverso N-idrossisuccinimide (NHS) chimica estere. Noi indirizzare il lettore interessato al nostro lavoro precedente per ulteriori informazioni sullo sviluppo di queste tecniche, così come una spiegazione della nostra motivazione per la scelta di queste tecniche. ⁸

Il successo di queste reazioni può essere valutata mediante microscopia ottica e fluorescenza dopo l'aggiunta di ammina primaria, così come dopo l'aggiunta della biotina. Mentre m otticaicroscopy può essere utilizzato per determinare se i protocolli superficie funzionalizzazione provoca un danno alla superficie microsfere, o contaminazione, la microscopia a fluorescenza viene utilizzato per verificare la qualità ed uniformità di copertura della superficie della molecola biotina, come pure la capacità della biotina sulla la superficie di legarsi con (strept) avidina. Per valutare la copertura di ammine sulla superficie, abbiamo usato isotiocianato di fluoresceina (FITC) colorante fluorescente, che reagisce con ammine primarie per formare stabile, legame covalente tiourea al microsfere. Texas Red colorante fluorescente che è stato coniugato ad avidina viene utilizzato per etichettare i gruppi biotina sulla superficie attraverso l'interazione biotina-avidina. In entrambi i casi, sono stati scelti coloranti che possono interagire (attraverso sia recettore-ligando interazioni o legame covalente) con i gruppi funzionali sulla superficie.

Qui, l'agente di accoppiamento silanico, che ha tre gruppi uscenti e un gruppo funzionale, fornisce la scommessa ponteWeen la superficie inorganica e sonda molecola organica. La funzionalità ammina primaria reagisce quantitativamente con gli esteri NHS di formare legami ammidici stabili. In questo caso, si utilizza una molecola sonda biotina cui catena laterale valerico è stato modificato con un gruppo estere NHS. Realisticamente, qualsiasi molecola sonda alla quale un gruppo estere NHS può essere aggiunto alla superficie mediante i seguenti protocolli. Inoltre, questi protocolli sono generale, e può essere utilizzato per funzionalizzare qualsiasi superficie periferica silice con biotina.

Il problema principale con questi protocolli non è effettivamente nella stessa chimica, ma piuttosto nella gestione di microsfere di silice. Si prega di notare che, nel corso dei protocolli, le microsfere devono essere gestiti da grapsing loro steli leggermente con acuminati pinzette. Ciò mantiene le pinzette ben lontano dagli stessi microsfere, e consente un facile trasporto tra i passaggi. Molti passi nel protocollo di seguito sono specificamente progettate per affrontare questo fattoo.

2. Microsfera Fabrication

1. Costruire l'alloggiamento di archiviazione per le microsfere.
   1. Utilizzando un coltello exacto, tagliare un ¼ in grosso pezzo di cartone in un 1 in x 1 in piazza, su un nastro di questo di dimensioni regolari vetrino, e allegare un 1 nella sezione di nastro adesivo, con le sue estremità incontrano per formare un rotolo , al cartone.
   2. Questo crea una piattaforma su cui il microsfere può essere elevata e isolato dall'ambiente circostante, e previene i danni alla loro superficie.
2. Utilizzando forbici, tagliare una sezione 3 pollici di fibra ottica da una bobina di fibra ottica.
3. Utilizzo di un n-Nik fibra-stripper, spelare il rivestimento protettivo polimerico dagli ultimi 0,5 pollici dalla fine del pezzo tagliato di fibra, lasciando solo il nucleo di silice. Pulire la superficie di un polimero rimanente con un Kimwipe inumidito con metanolo strofinando delicatamente la fibra con il Kimwipe.
4. Utilizzando una fibra nuda mannaia, tagliare l'estremità in modo spogliato °a solo circa 1 millimetro di fibra spogliato rimane sulla estremità della fibra.
5. Posizionare l'estremità scoperta della fibra ottica nel percorso di un laser CO _2, avendo cura di allineare verticalmente la fibra in modo tale che la sua fine così estratto è rivolto verso il basso.
6. Accendere il laser CO _2, e indirizzarla verso la superficie della estremità scoperta della fibra ottica. Il laser si scioglierà alla fine spogliato della fibra in una sfera con circa il 3,5% di potenza in 2 secondi.
7. Con una pinzetta, accuratamente afferrare lo stelo (non-spoglia porzione della fibra ottica) della microsfera. Fissare lo stelo al rotolo di nastro sul corpo microsfere. Il vetrino può essere essa stessa immagazzinata in una capsula di Petri. Questo permette di memorizzare sicurezza della microsfera.

3. Popolare la superficie con gruppi idrossilici

1. Con la soluzione di piranha:
   1. In un flacone in polipropilene da 60 ml con tappo a cerniera, preparare una soluzione piranha (70:30 in volume fumante H 4: H ₂ O ₂ (30% in peso)) aggiungendo 5 ml di perossido di idrogeno al flacone, seguiti da 11,6 mL di acido solforico fumante. ATTENZIONE: indossare guanti resistenti agli acidi.
   2. Trasferire il vetrino, tenendo almeno 1 microsfere, nella fiala. La microsfera deve essere in contatto con il liquido, ma il liquido non deve toccare il cartone. Regolare il volume della soluzione, se necessario.
   3. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e inserirlo in un altro flacone di plastica contenente DDI H ₂ O. Sia i campioni siedono nella soluzione per 5 minuti.
   4. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e posizionarlo un forno a 80 ° C per 10 minuti per asciugare la superficie.
2. Utilizzando il trattamento di plasma di ossigeno:
   1. Trasferire il vetrino contenente almeno un microsfere alla camera di plasma di ossigeno.
   2. Impostare la pressione di ossigeno di 200 mTorr, e la potenza di 120 W. esporre il campione al plasma di ossigeno per 2 minuti.
   3. Rimuovere il vetrino dalla camera di plasma.

4. Collegamento agenti di accoppiamento di silano alla superficie

1. Posizionare il vetrino, contenente almeno un microsfere, in un essiccatore a vuoto in una cappa aspirante.
2. Anche nella cappa, aprire il flacone agente di accoppiamento silano (in questo caso, amminopropiltrimetossisilano (APTMS) è stato utilizzato), e posizionare la bottiglia aperta in un essiccatore.
3. Sostituire il coperchio sulla essiccatore a vuoto, e collegare la porta di uscita ad un aspiratore o sottovuoto linea di casa.
4. Accendere il vuoto casa o la linea di galleggiamento, e evacuare la essiccatore sotto vuoto. Una volta che una tenuta a vuoto è formata tra il coperchio e la base, la reazione inizia temporizzazione. Ciò depositare l'agente di accoppiamento di silano sulla superficie come una pellicola sottile.
5. Dopo 15 minuti, spegnere il vuoto, e lentamente aprire la porta per far entrare aria in un essiccatore. Per questo agente di accoppiamento, 15 minuti è sufficiente per formare una uniform monostrato sulla superficie. Per gli altri agenti di accoppiamento, il tempo può essere necessario regolare.

5. Collegamento Biotin alla superficie

1. Circa un'ora prima di attaccare la biotina, preparare una soluzione 10 mM di N-hydroxylsuccinimide biotina (NHS-biotina) in dimetilsolfossido anidro (DMSO) in una fiala polipropilene 60 mL con un coperchio incernierato.
   1. Se l'NHS-biotina è stato memorizzato bassa temperatura, lasciarla a temperatura ambiente prima di volumetrie fuori.
   2. Sonicare la soluzione per 1 ora per dissolvere completamente il NHS-biotina polvere con il solvente.
2. Trasferire il vetrino contenente microsfere in un'altra fiala di plastica, con le microsfere in basso, e deriva in parte superiore del flacone.
3. Trasferimento, usando una pipetta di plastica, un volume appropriato di NHS-biotina soluzione lungo il lato del flacone, dietro il vetrino (quindi la soluzione non tocchi la microsfera mentre viene aggiunto alla fiala). Add soluzione sufficiente a coprire la superficie delle microsfere.
4. Posizionare le fiale contenenti ora le microsfere e NHS-biotina in soluzione di DMSO in un incubatore a dondolo (vassoio oscillante) per 30 minuti a temperatura ambiente, con la velocità e l'angolo di inclinazione a 5 rpm e 5 gradi, rispettivamente.
5. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e dolcemente scivolare in un altro flacone pieno di DDI H ₂ O. Posizionare il flaconcino sul vassoio oscillante per altri 10 minuti alla stessa velocità e angolo di inclinazione come prima. Ripetere questa operazione due volte con acqua fresca ogni volta. Questo aiuta a rimuovere il DMSO in eccesso dalla superficie, e rimuove qualsiasi fisicamente adsorbito biotina che non ha in realtà innesto alla superficie.
6. Rimuovere il vetrino dalla fiala, e posizionarlo in un forno a 80 ° C per 10 minuti, o fino a quando tutte le goccioline d'acqua vengono rimosse dalla superficie.

6. Marcatura fluorescente di ammino-terminato silice

1. Per etichettare i gruppi amminici presenti dopo il trattament con APTMS, preparare la soluzione FITC in una stanza buia, sciogliendo FITC 1 mg in 1 ml di DMSO anidro.
2. Diluire la soluzione in 6,1 aggiungendo 50 pl della soluzione FITC ad 1 ml di tampone bicarbonato di sodio 0,1 M.
3. Posizionare la soluzione in un flacone polipropilene 60 mL con un tappo incernierato, e far scorrere il ammino-terminato microsfere, alloggiato nuovamente sul vetrino, nel flacone.
4. Porre la fiala in un bagno di ghiaccio, e lasciare che il campione di reagire con la soluzione di FITC per un minimo di 4 ore al buio.
5. Rimuovere fluoroforo eccesso attraverso due risciacqui, 10 minuti di microsfere in tampone carbonato di sodio. Come prima, una cuvetta 60 mL di polipropilene con un tappo incernierato con il tampone, e far scorrere il vetrino nella soluzione, avendo cura che la soluzione copre solo il microsfere, e non l'alloggiamento cartone. Coprire la fiala con un foglio di alluminio, e posizionare il flaconcino su un vassoio tilt fissato a 5 gradi e 5 giri, come prima.
6. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e dolcemente scivolare in un altro flacone pieno di DDI H ₂ O e coperto con un foglio di alluminio. Posizionare il flaconcino sul vassoio oscillante per altri 10 minuti alla stessa velocità e angolo di inclinazione come prima. Ripetere questa operazione due volte con acqua fresca ogni volta. Questo aiuta a rimuovere il colorante in eccesso dalla superficie.
7. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e secco in un forno a 80 ° C per 10 minuti prima di imaging.

7. Marcatura fluorescente di biotina-terminato silice

1. Preparare un 10 pg / mL di soluzione Texas Red-avidina in salina tamponata con fosfato.
2. Aggiungere la soluzione ad una fiala di polipropilene da 60 ml con un tappo incernierato, e far scorrere il vetrino contenente un biotina terminazione microsfere nella soluzione, in modo che la microsfera è appena coperto dalla soluzione.
3. Reagire per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Rimuovere fluoroforo in eccesso attraverso due, 10 minuti risciacquares delle microsfere in tampone PBS.
   1. Come prima, una cuvetta 60 mL di polipropilene con un tappo incernierato con il tampone, e far scorrere il vetrino nella soluzione, avendo cura che la soluzione copre solo il microsfere, e non l'alloggiamento cartone.
   2. Coprire la fiala con un foglio di alluminio, e posizionare il flaconcino su un vassoio tilt fissato a 5 gradi e 5 giri, come prima.
5. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e dolcemente scivolare in un altro flacone pieno di DDI H ₂ O e coperto con un foglio di alluminio. Posizionare il flaconcino sul vassoio oscillante per altri 10 minuti alla stessa velocità e angolo di inclinazione come prima. Ripetere questa operazione due volte con acqua fresca ogni volta. Questo aiuta a rimuovere il colorante in eccesso dalla superficie.
6. Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e secco in forno a 80 ° C per 10 minuti prima di imaging.

8. Risultati rappresentativi

Microsfere correttamente funzionalizzatis possono essere identificati mediante microscopia ottica ea fluorescenza. Se la superficie funzionalizzazione viene eseguita correttamente, dovrebbe risultare in una copertura uniforme densa di molecole di biotina sulla superficie, e la superficie deve rimanere difetto-e-contaminante libero dopo funzionalizzazione al fine di mantenere la loro sensibilità elevata durante gli esperimenti di rilevamento. Microscopia ottica può essere usato per sondare quest'ultimo, mentre microscopia fluorescente può sondare la qualità e l'uniformità di superficie della copertura. Nella figura 2, mostriamo alcuni esempi di corretta funzionalizzata microsfere. Queste immagini dimostrano che non vi è alcun danno superficiale o contaminazione dovuta alla funzionalizzazione (Fig. 2a), e che le microsfere mostrano una uniforme, copertura coerente delle gruppi amminici (Fig. 2b) o gruppi biotina (Fig. 2c) sulla superficie .

Se le microsfere non sono stati funzionalizzati correttamente, il microsfere ottico immagini will presentano contaminazione superficiale, la copertura aggregazione o non uniforme, e difetti evidenti nella superficie, come crepe superficiali (Figura 3). Qui vediamo un esempio tipico di contaminazione superficiale, derivante da aggregazione dei reagenti sulla superficie.

Figura 1. 3-step schema di reazione per attaccare molecole sonda sulla superficie di microsfere di silice. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Microsfere di silice. a) micrografia ottica di microsfere di silice popolato con gruppi idrossilici attraverso l'esposizione al plasma di ossigeno; b) Micrografia fluorescente di microsfere di silice popolato con ammine primarie e marcato con FITC colorante; c) Micrografia fluorescente di silice microsphere popolato con biotina ed etichettate con Texas Red-avidina coniugato. Ristampato con il permesso Soteropulos, CE, Hunt, HK & Armani, AM Determinazione della cinetica di legame con sussurrano microcavità modalità galleria. Appl. Phys. Lett. 99., 103.703-103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics ^17.

Figura 3. Micrografia ottica della sfera impropriamente funzionalizzata. Qui, potete vedere la polvere sulla superficie in alto a destra, così come la contaminazione si estende dalla superficie. Inoltre, il lato destro della microsfera ottico mostra una zolla piccolo sulla superficie.

Come descritto nei protocolli, abbiamo creato una piattaforma alloggiamento per cui il trasporto di silice microsfere dai gambi durante il processo di funzionalizzazione. Questa piattaforma alloggiamento è stato creato come una soluzione per la contaminazione superficiale e danni che il risultato della microsfera venire in contatto con le pareti dei vari contenitori utilizzati durante il processo di funzionalizzazione. Ci siamo resi conto della difficoltà principale nasce dalla sempre attaccare e staccare i singoli microsfere di diversi contenitori durante il processo di funzionalizzazione. E 'stato difficile evitare spazzolando la microsfere contro un oggetto quando si spostano ciascuno individualmente con le pinzette tenendo sui gambi. Per stabilizzare la posizione di ciascuna microsfera sul vetrino, siamo riusciti a spostare semplicemente un numero di microsfere in e fuori di contenitori diversi gestendo il vetrino, non e lo stelo della microsfera. In questo modo, siamo stati in grado di funzionalizzare molti di questi devgelati allo stesso tempo, e abbiamo eliminato la contaminazione e danni superficiali causati da un uso improprio, risultando in un tasso di successo del 90% ~ di creare integro, funzionalizzata microsfere.

Come indicato nei protocolli, abbiamo esplorato due metodi con cui l'idrossilato microsfere di silice. Mentre soluzione Piranha è comunemente usato per questo, può essere tempo, e richiede chimica liquida. Quando si lavora con microsfere, abbiamo notato la superiorità del idrossilazione con il trattamento al plasma di ossigeno. Il trattamento di plasma di ossigeno non richiede contatto con soluzioni liquide, senza essiccazione, e nessuna movimentazione del microsfere di silice. Inoltre, è un processo molto più veloce per popolare la superficie con gruppi idrossilici. Tuttavia, ci rendiamo conto che non tutti i gruppi di ricerca avranno accesso alle apparecchiature plasma di ossigeno, e quindi potrebbe essere necessario usare la soluzione piranha per formare la funzionalità necessaria idrossile. L'uso di uno o porterà alla formazione di gruppi idrossilici sullala superficie.

La prevenzione della contaminazione durante la funzionalizzazione di superficie è una questione importante, ma può essere minimizzato stretta aderenza ai protocolli. Le cause più probabili di contaminazione sono maneggevolezza durante funzionalizzazione, nonché lavaggio improprio o non accurata della superficie dopo che ciascuna delle fasi di reazione. Questo è particolarmente il caso durante la prima fase di reazione, dove la superficie è popolato con gruppi idrossilici. Se la soluzione Piranha viene scelto per questo metodo, occorre prestare attenzione a rimuovere completamente qualsiasi acido solforico dalla superficie, e da asciugare completamente la microsfere, come la superficie è molto idrofilo, e l'acqua dai risciacqui aderisce alla superficie. Se l'acido solforico rimane sulla superficie, la microsfera diventa "permanente" e la polvere dall'ambiente laboratorio raccoglie sulla superficie più facilmente. Inoltre, le gocce d'acqua sulla superficie che l'agente di accoppiamento di silano a radunarsi nella zona di water goccioline, formando un glob polimerico di silice, che è visto come aggregazione nelle micrografie fluorescenti. Se si verifica aggregazione superficie, impedisce la microsfera venga utilizzato in esperimenti di rilevazione, a causa di una grande goccia nella sensibilità del dispositivo. Tipicamente, quando il trattamento di plasma ad ossigeno, agglomerante superficie, così come la contaminazione, viene minimizzato. Tuttavia, non ogni laboratorio ha accesso a questo dispositivo, in modo da utilizzare la soluzione piranha può essere una necessità.

Infine, abbiamo trovato che era necessario sonicare il NHS-biotina soluzione prima dell'uso per sciogliere completamente il NHS-biotina in DMSO. Quando questo passaggio è stato saltato, la NHS-biotina sarebbe depositare sulla superficie in ciuffi di grandi dimensioni tramite adsorbimento fisico, invece di legare covalentemente alla superficie. Questi grandi ciuffi sono estremamente difficili da rimuovere durante le fasi di lavaggio, ma può essere prevenuta dispersione corretto durante la dissoluzione iniziale. Un'ora è tipicamente sufficiente per questo scopo;tuttavia, se queste procedure sono estese a molecole sonda altre modificate con gruppi estere NHS, si consiglia di valutare la soluzione tramite diffusione della luce dinamica per garantire la completa dissoluzione.

I protocolli dettagliati qui rappresenta un passo avanti nella traduzione di composizioni chimiche planari superficie della silice a tridimensionali dispositivi, dove la qualità della superficie della copertura e la superficie del dispositivo sono ugualmente importanti per l'utilizzazione finale dei dispositivi. Quando questi protocolli sono utilizzati, completamente funzionalizzata microsfere mostrato copertura uniforme densa della molecola sonda, senza contaminazione o grumi sulla superficie. Questa copertura superficie uniforme consente il mantenimento di alte sensibilità quando questi dispositivi vengono utilizzati in esperimenti di rilevamento. L'uso di agenti accoppianti silanici come un ponte tra il substrato inorganico e la molecola sonda biologico è semplice e diretto, e può essere utilizzato, in particolare con il ben compreso (e molto ecCOMUNE) NHS estere chimica, per popolare le superfici biosensori ottici con molecole sonda di vario tipo.