Fastgørelse Biologiske Prober til silica Optiske biosensorer Anvendelse silankoblingsmidler

1. Baggrund

Den biotin er fastgjort til overfladen af disse enheder via en simpel, tre-trins proces (figur 1). Først, vi rense overfladen og befolke den med hydroxylgrupper ved at udsætte de enheder, enten ilt plasma eller Piranha løsning. Sekund, bruger vi dampafsætning at fastgøre silankoblingsmidlet termineret med en primær amin til hydroxylgrupperne ved hydrolyse og kondensation reaktion. Tredje lægger vi biotin til overfladen via N-hydroxysuccinimid (NHS)-ester kemi. Vi lede den interesserede læser til vores tidligere arbejde for mere information om udviklingen af disse teknikker, samt en forklaring af vores motivation for at vælge disse teknikker. ⁸

Succes af disse reaktioner kan evalueres ved hjælp af optisk og fluorescensmikroskopi efter tilsætning af den primære amin, såvel som efter tilsætning af den biotin. Mens optisk microscopy kan anvendes til at bestemme, om overfladen funktionalisering protokoller medfører skade på mikrosfæren overflade eller endog kontaminering, der fluorescensmikroskopi anvendes til at verificere kvaliteten og ensartetheden af ​​overfladedækning af biotin-molekyle, såvel som evnen af ​​biotin for overfladen kan binde til (strept) avidin. At evaluere dækning af aminer på overfladen, anvendte vi fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluorescerende farvestof, som reagerer med primære aminer til dannelse af en stabil, covalent thiourinstof binding til mikrosfæren. Texas Red fluorescerende farvestof, som er blevet konjugeret til avidin anvendes til at mærke de biotin-grupper på overfladen gennem biotin-avidin-interaktion. I begge tilfælde blev farvestoffer valgt som kan interagere (gennem enten receptor-ligand-interaktioner eller kovalent binding) med de funktionelle grupper på overfladen.

Her silankoblingsmiddel, der har tre fraspaltelige grupper, og en funktionel gruppe, tilvejebringer broen betlem det uorganiske overflade og organiske probemolekyle. Den primære amin-funktionalitet reagerer kvantitativt med NHS-estere til dannelse af stabile amidbindinger. I dette tilfælde anvender vi en biotin probe-molekyle, hvis valerianesyre sidekæden er blevet modificeret med en NHS-ester-gruppe. Realistisk som helst probe-molekyle, hvortil en NHS-ester-gruppe kan tilsættes til overfladen ved hjælp af de følgende protokoller. Desuden er disse protokoller er generelt og kan anvendes til at funktionalisere helst silica anordningens overflade med biotin.

Den primære udfordring med disse protokoller, er faktisk ikke kemi sig selv, men i behandlingen af ​​silica mikrosfærer. Bemærk, at hele de protokoller, bør mikrosfærerne håndteres af grapsing deres stilke let med skarpe tippes pincet. Dette holder pincetten væk fra mikrosfærerne sig, og giver mulighed for let transport mellem trinnene. Mange trin i protokollen nedenfor er specielt designet til at løse dette faktumeller.

2. Mikrokugle Fabrication

1. Byg opbevaring hus for mikrosfærer.
   1. Ved hjælp af en exacto kniv, en ¼ i tykt stykke pap skåret i en 1 x 1 i kvadrat, tape det på en regelmæssig mellemstore objektglas, og vedlægge en 1 i afsnit af tape, med sine ender mødes for at danne en rulle til pappet.
   2. Dette skaber en platform, hvor mikrosfæren kan hæves og isoleres fra det omgivende miljø, og forhindrer skade på deres overflade.
2. Med saks, skæres en 3 inch sektion af optisk fiber fra en spole af optisk fiber.
3. Ved anvendelse af en No-nik fiber-stripper, den beskyttende polymere overtræk strimlen fra sidste 0,5 inches fra enden af ​​det udskårne stykke af fiberen, så kun silica kernen. Rengør overfladen af ​​en eventuel resterende polymer med en Kimwipe fugtet med methanol ved forsigtigt at tørre fiber med Kimwipe.
4. Ved hjælp af en nøgen fiber spaltekniven, den afisolerede ende, så th trimmepå kun cirka 1 millimeter strippet fiber forbliver på enden af ​​fiberen.
5. Anbring den afisolerede ende af den optiske fiber ind i banen for en CO _2-laser, idet man lodret bringe fiberen således, at dens afisolerede ende vender nedad.
6. Tænde CO _2-laser, og lede det til overfladen af den afisolerede ende af den optiske fiber. Laseren vil smelte den afisolerede ende af fiberen til en kugle med cirka 3,5% effekt i 2 sekunder.
7. Med en pincet fat forsigtigt spindlen (ikke-blottede del af den optiske fiber) af mikrosfæren. Fastgøre skaftet til tapen rullen på mikrosfæren huset. Objektglasset kan selv lagres i en petriskål. Dette muliggør sikker opbevaring af mikrokuglen.

3. Befolke Surface med hydroxylgrupper

1. Brug Piranha løsning:
   1. I en 60 ml polypropylen hætteglas med en hængslet hætte, forberede en Piranha-løsning (70:30 volumen rygende H SO4: H2O ₂ (30 vægt%)) ved tilsætning af 5 ml af hydrogenperoxid til hætteglasset, efterfulgt af 11,6 ml rygende svovlsyre. ADVARSEL: bære syre-handsker.
   2. Overfør objektglasset, holde mindst en mikrosfære, til hætteglasset. Mikrosfæren bør være i kontakt med væsken, men væsken må ikke røre pap. Justere volumenet af opløsningen om nødvendigt.
   3. Fjern forsigtigt objektglasset fra hætteglasset, og sæt det ind i en anden plast hætteglas, der indeholder DDI H ₂ O. Lade prøverne sidde i opløsningen i 5 minutter.
   4. Forsigtigt fjernes objektglasset fra hætteglasset, og placere den i en ovn ved 80 ° C i 10 minutter for at tørre overfladen.
2. Brug af ilt plasma behandling:
   1. Overfør objektglasset indeholdende mindst én mikrosfære til oxygen plasmakammeret.
   2. Indstil ilt presset til 200 mTorr, og magten til 120 W. eksponere prøven til ilt plasma til 2 minutes.
   3. Fjerne objektglas fra plasmakammeret.

4. Fastgørelse silankoblingsmidler til overfladen

1. Placere objektglas, som indeholder mindst én mikrosfære, i en vakuumekssikkator i et stinkskab.
2. Også i stinkskab, skal du åbne silankoblingsmidlet flaske (i dette tilfælde blev aminopropyltrimethoxysilan (APTMS), der anvendes), og placer den åbnede flaske i ekssikkatoren.
3. Sæt låg på vakuum, og fastgør den anden ende med en aspirator eller hus vakuum linje.
4. Tænde husvakuum eller vandlinien, og evakuere den vakuum-exsikkator. Når et vakuum forsegling dannes mellem låget og bunden, påbegynde tidsmåling reaktionen. Dette vil deponere silankoblingsmidlet på overfladen som en tynd film.
5. Efter 15 minutter, skal du slukke for vakuum, og langsomt åbne havnen for at lade luft ind i ekssikkatoren. Til dette koblingsmiddel, er 15 minutter er tilstrækkelig til at danne en unifoRM monolag på overfladen. For andre koblingsmidler, kan den tid, skal justeres.

5. Fastgørelse Biotin til overfladen

1. En time før fastgørelse af biotin fremstilles en 10 mM opløsning af N-hydroxylsuccinimide biotin (NHS-biotin) i vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO) i en 60 mL polypropylen-hætteglas med en hængslet hætte.
   1. Hvis NHS-biotin er blevet lagret koldt, gør det muligt at ækvilibrere til stuetemperatur, før massing den.
   2. Sonikeres opløsningen i 1 time til fuldstændig opløsning af NHS-biotin pulver i opløsningsmidlet.
2. Overfør objektglasset indeholdende mikrokugler ind i en anden plast vial med mikrokuglerne ved bunden, og stængler på toppen af ​​hætteglasset.
3. Overførsel ved hjælp af en plastpipette en passende volumen af ​​NHS-biotin-opløsning langs siden af ​​beholderen, bag objektglas (så opløsningen ikke rører mikrosfære, som det bliver tilsat til hætteglasset). Endd tilstrækkelig opløsning til at dække mikrosfære overflade.
4. Placere hætteglas nu indeholdende mikrokuglerne og NHS-biotin i DMSO-opløsning på en vippende inkubator (vippebakke) i 30 minutter ved stuetemperatur, med den hastighed og hældningsvinklen ved 5 opm og 5 grader.
5. Fjern forsigtigt objektglasset fra hætteglasset, og forsigtigt skubbe den ind i et andet hætteglas fyldt med DDI H ₂ O. Placere hætteglasset på vippebakke i yderligere 10 minutter ved den samme hastighed og hældningsvinkel som før. Gentag dette trin to gange med frisk vand hver gang. Dette hjælper med at fjerne overskydende DMSO fra overfladen, og fjerner enhver fysisk adsorberet biotin, der faktisk ikke transplantat til overfladen.
6. Fjerne objektglas fra hætteglasset, og placere den i en ovn ved 80 ° C i 10 minutter, eller indtil alle vanddråber fjernes fra overfladen.

6. Fluorescerende mærkning af amin-termineret silica

1. Til at mærke de amingrupper til stede efter treatment med APTMS, forberede FITC-opløsning i et mørklagt rum ved at opløse 1 mg FITC i 1 ml vandfri DMSO.
2. Fortyndes opløsningen i 6,1 ved tilsætning af 50 pi af FITC-opløsning til 1 ml 0,1 M natriumbicarbonat-puffer.
3. Placere opløsning i en 60 mL polypropylen-hætteglas med en hængslet hætte, og forsigtigt skubbe amintermineret mikrosfærer, anbragt igen på objektglas, i hætteglasset.
4. Anbring beholderen i et isbad, og lade prøven reagere med FITC-opløsning i mindst 4 timer i mørke.
5. Fjernes overskydende fluorofor gennem to, 10 minutter skylninger af mikrokuglerne i natriumcarbonatpuffer. Som før fylde en 60 mL polypropylen-hætteglas med en hængslet hætte med pufferen, og forsigtigt skubbe objektglasset i opløsningen, idet man, at opløsningen kun omfatter mikrosfæren og ikke pappet huset. Dække hætteglasset med aluminiumfolie og placere hætteglasset på en vippebakke sat til 5 grader og 5 opm, som før.
6. Fjern forsigtigt objektglasset fra hætteglasset, og forsigtigt skubbe den ind i et andet hætteglas fyldt med DDI H ₂ O og dækket med aluminiumsfolie. Placere hætteglasset på vippebakke i yderligere 10 minutter ved den samme hastighed og hældningsvinkel som før. Gentag dette trin to gange med frisk vand hver gang. Dette hjælper med at fjerne overskydende farve fra overfladen.
7. Forsigtigt fjernes objektglasset fra hætteglasset, og tørres i en ovn indstillet til 80 ° C i 10 minutter før imagografi.

7. Fluorescerende mærkning af biotin-termineret silica

1. Fremstilling af en 10 ug / ml opløsning af Texas-Red avidin i phosphatbufret saltvand.
2. Tilsættes til opløsningen til en 60 mL polypropylen-hætteglas med en hængslet hætte, og forsigtigt skubbe objektglas indeholdende en biotin-termineret mikrosfære i opløsningen, således at mikrosfæren er netop dækkes af opløsningen.
3. Reagere i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
4. Fjernes overskydende fluorofor gennem to 10 minutter skylless af mikrosfærerne i PBS-buffer.
   1. Som før fylde en 60 mL polypropylen-hætteglas med en hængslet hætte med pufferen, og forsigtigt skubbe objektglasset i opløsningen, idet man, at opløsningen kun omfatter mikrosfæren og ikke pappet huset.
   2. Dække hætteglasset med aluminiumfolie og placere hætteglasset på en vippebakke sat til 5 grader og 5 opm, som før.
5. Fjern forsigtigt objektglasset fra hætteglasset, og forsigtigt skubbe den ind i et andet hætteglas fyldt med DDI H ₂ O og dækket med aluminiumsfolie. Placere hætteglasset på vippebakke i yderligere 10 minutter ved den samme hastighed og hældningsvinkel som før. Gentag dette trin to gange med frisk vand hver gang. Dette hjælper med at fjerne overskydende farve fra overfladen.
6. Forsigtigt fjernes objektglasset fra hætteglasset, og tørres i en ovn indstillet til 80 ° C i 10 minutter før imagografi.

8. Repræsentative resultater

Korrekt funktionaliserede mikrosfærens kan identificeres ved hjælp af optisk og fluorescensmikroskopi. Hvis overfladen funktionalisering udføres korrekt, bør det resultere i en ensartet, tæt dækning af biotin-molekyler på overfladen og overfladen bør forblive defekt-og kontaminant-fri efter funktionalisering for at opretholde deres høje følsomhed under detektion forsøg. Optisk mikroskopi, kan anvendes til at probe disse, medens fluorescensmikroskopi kan sonde kvaliteten og ensartetheden af ​​overfladedækning. I figur 2, viser vi eksempler på korrekt funktionaliseret mikrosfærer. Disse billeder viser, at der ikke er nogen overflade beskadigelse eller kontaminering som følge af funktionalisering (fig. 2a), og at mikrosfærerne viser en ensartet sammenhængende dækning af enten amingrupper (fig. 2b) eller biotin-grupper (fig. 2c) på overfladen .

Hvis mikrokuglerne ikke er blevet funktionaliseret korrekt, optiske mikrokugle billeder will udviser overfladeforurening, sammenklumpning eller ikke-ensartet dækning, og åbenlyse mangler i overfladen, såsom overfladerevner (figur 3). Her ser vi et almindeligt eksempel på overfladeforurening, som følge af sammenklumpning af reagenser på overfladen.

Figur 1. 3-trins reaktionsskema til fastgørelse probemolekyler til overfladen af silica mikrosfærer. se større figur .

Figur 2. Silica mikrosfærer. a) optisk mikrografi af silica mikrosfære befolket med hydroxylgrupper via udsættelse for oxygenplasma b) fluorescent mikrograf af silica mikrosfære befolket med primære aminer og mærket med FITC farvestof c) fluorescent mikrograf af silica microsphere befolket med biotin og mærket med Texas Red-avidinkonjugat. Genoptrykt med tilladelse fra Soteropulos, CE, Hunt, HK & Armani, AM Bestemmelse af bindingskinetik hjælp hviskegallerimodus mikrokaviteter. Appl. Phys. Lett. 99, fra 103.703 til 103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics. ¹⁷

Figur 3. Optisk mikrografi af ukorrekt funktionaliseret sfære. Her kan du se støv på øverste højre overflade, samt forurening strækker sig væk fra overfladen. Derudover højre side af den optiske mikrosfære viser en lille divot på overfladen.

Som beskrevet i protokollerne, skabte vi et hus platform til at transportere silica mikrosfærerne ved deres stilke hele funktionalisering processen. Dette hus platform blev dannet som en løsning på overfladeforurening og skader, som resulterede fra mikrokuglen kommer i kontakt med væggene i de forskellige beholdere, der anvendes gennem hele funktionalisering processen. Vi indså den største vanskelighed opstod fra konstant påsætning og aftagning individuelle mikrokugler til forskellige beholdere under funktionalisering processen. Det var svært at undgå børstning microsphere mod et objekt, når du flytter hver enkelt med en pincet ved at holde på de stængler. Ved at stabilisere positionen af ​​hver mikrokugle på objektglasset, var vi i stand til blot at bevæge en række af mikrokugler ind og ud af forskellige beholdere ved håndtering af objektglasset, og ikke stammen af ​​mikrokuglen. På denne måde var vi i stand til at funktionalisere mange af disse devICES på samme tid, og vi elimineret forurening og overflade skader forårsaget af forkert håndtering, hvilket resulterer i en ~ 90% succesrate på at skabe ubeskadiget, funktionaliserede mikrokugler.

Som angivet i protokollerne, vi undersøgt to metoder til at hydroxylere silica mikrosfærerne. Mens Piranha løsning normalt bruges til dette, kan det være tidskrævende, og kræver våd kemi. Når du arbejder med mikrokugler, vi bemærkede overlegenhed hydroxylering gennem ilt plasma behandling. Oxygenplasma behandling kræver ingen kontakt med væskeformige opløsninger, ingen tørring og ingen håndtering af silica mikrosfærer. Desuden er det en meget hurtigere fremgangsmåde til at udfylde overfladen med hydroxylgrupper. Vi erkender imidlertid, at ikke alle forskergruppe vil have adgang til ilt plasma-udstyr, og kan derfor nødt til at bruge piranha løsning til at danne den nødvendige hydroxyl funktionalitet. Anvendelsen af ​​enten vil resultere i dannelsen af ​​hydroxylgrupper påoverfladen.

Forebyggelse af forurening under overfladen funktionalisering er et stort problem, men det kan minimeres ved omhyggelig overholdelse af protokollerne. De mest sandsynlige årsager til forurening er dårlig håndtering under funktionalisering, såvel som ukorrekt eller ikke-grundig vask af overfladen efter hver af de reaktionstrin. Dette er især tilfældet i det første reaktionstrin, hvor overfladen er befolket med hydroxylgrupper. Hvis Piranha-opløsning er valgt til denne fremgangsmåde, skal der drages omsorg for grundigt at fjerne eventuelle svovlsyre fra overfladen, og at udtørre mikrosfæren, idet overfladen er nu meget hydrofilt, og vand fra skylningerne klæber til overfladen. Hvis svovlsyre forbliver på overfladen, mikrosfæren bliver "klæbrige" og støv fra laboratoriemiljøet samler sig på overfladen lettere. Derudover vanddråber på overfladen bevirke silankoblingsmidlet til at samles i det område af WatER dråber, der danner et polymert silica glob, der ses som sammenklumpning i de fluorescerende mikrografierne. Hvis overfladen sammenklumpning sker, forhindrer mikrosfæren at blive anvendt i detektion eksperimenter, fordi et stort fald i følsomhed af indretningen. Typisk, når oxygen plasmabehandling anvendes, er overfladen sammenklumpning, såvel som kontaminering, minimeres. Men ikke alle laboratorier har adgang til dette udstyr, så brug af Piranha løsning kan være en nødvendighed.

Endelig har vi fundet det nødvendigt at sonikeres NHS-biotin-opløsning før anvendelse for at opløses fuldstændigt NHS-biotin i DMSO. Når dette trin blev sprunget over, vil NHS-biotin aflejret på overfladen i store klumper via fysisk adsorption, snarere end kovalent binding til overfladen. Disse store klumper er ekstremt vanskelige at fjerne under vasketrinene, men kan forhindres ved passende dispergering i den første opløsning. En time er typisk tilstrækkeligt til dette formål;Hvis disse procedurer er udvidet til andre probemolekyler modificeret med NHS estergrupper, anbefales evaluere opløsningen via dynamisk lysspredning for at sikre fuldstændig opløsning.

De protokoller, der er beskrevet her, repræsenterer et skridt fremad i oversættelsen af ​​plane silica overflade kemier til tre-dimensionelle enheder, hvor kvaliteten af ​​overfladen dækning og enhedens overflade er lige så vigtig for den endelige anvendelse af enhederne. Når disse protokoller anvendes viste fuldt funktionaliserede mikrosfærerne ensartet, tæt dækning af probe-molekyle, uden forurening eller sammenklumpning på overfladen. Denne ensartede overfladedækning muliggør opretholdelse af høje følsomhed, når disse indretninger anvendes i detektion eksperimenter. Anvendelsen af ​​silankoblingsmidler som en bro mellem det uorganiske substrat og biologiske probe-molekyle er enkel og ligetil og kan anvendes, især med godt forstået (og meget cÆLLES) NHS-ester kemi, at befolke optisk Biosensor overflader med probe-molekyler af forskellige typer.