Feste Biologiske Sonder til Silica Optiske Biosensorer Bruke silane kopling agenter

1. Bakgrunn

Den biotin er festet til overflaten av disse enhetene gjennom en enkel, tretrinns prosess (figur 1). Først rengjør vi overflaten og fylle den med hydroksylgrupper ved å utsette de enhetene til enten oksygen plasma eller Piranha løsning. I tillegg benytter vi damp avsetning til feste silane koblingen agenten avsluttet med en primær amine til hydroksylgrupper gjennom hydrolyse og kondens reaksjon. Tredje legger vi biotin til overflaten via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester kjemi. Vi retter den interesserte leseren til vårt tidligere arbeid for mer informasjon om utviklingen av disse teknikkene, samt en forklaring på motivasjonen vår for å velge disse teknikkene. ⁸

Suksessen til disse reaksjonene kan evalueres gjennom optisk og fluorescens mikroskopi etter tilsetning av det primære amin, samt etter tilsetning av biotin. Mens optiske microscopy kan brukes til å avgjøre om overflaten funksjonalisering protokollene resulterte i skade på mikrosfære overflaten, eller til og med forurensning, er fluorescens mikroskopi brukes for å kontrollere kvaliteten og ensartethet av overflaten dekning av biotin molekylet, samt evnen til biotin på overflaten til å binde med (strept) avidin. For å vurdere dekningen av aminer på overflaten, brukte vi fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescerende fargestoff, som reagerer med primære aminer å danne stabil, kovalente thiourea sammenheng til mikrosfære. Texas Red fluorescerende fargestoff som har vært konjugert til avidin brukes til å merke biotin grupper på overflaten gjennom biotin-avidin interaksjon. I begge tilfeller ble fargestoffer valgt som kan samhandle (enten via reseptor-ligand interaksjoner eller kovalent binding) med funksjonelle grupper på overflaten.

Her gir silane kopling agent, som har tre forlater grupper og en funksjonell gruppe, broen innsatsenlom den uorganiske og organiske overflaten sonde molekyl. Den primære amin funksjonalitet reagerer kvantitativt med NHS estere å danne stabile amid obligasjoner. I dette tilfellet bruker vi en biotin sonde molekyl som valeriansyre side kjedet har blitt modifisert med en NHS ester gruppe. Realistisk, noen sonde molekyl som en NHS ester gruppe kan legges til overflaten ved hjelp av følgende protokoller. I tillegg er disse protokollene er generelle, og kan brukes til å functionalize noen silika utstyrets overflate med biotin.

Den primære utfordringen med disse protokollene er faktisk ikke i kjemi selv, men snarere i håndteringen av silika mikrosfærer. Vær oppmerksom på at hele protokoller, bør mikrosfærer håndteres av grapsing deres stammer lett med skarpe spisser pinsett. Dette holder pinsetten godt unna mikrosfærer selv, og åpner for enkel transport mellom trinnene. Mange skritt i protokollen under er spesielt utviklet for å møte dette faktumeller.

2. Mikrosfære Fabrication

1. Bygg lagring boliger for mikrosfærer.
   1. Bruke en exacto kniv, kuttet en ¼ i tykt stykke papp til en 1 x 1 i kvadrat, tape dette på en vanlig størrelse glass lysbilde, og fest en 1 i seksjon teip, med endene møtes for å danne en rull , til papp.
   2. Dette skaper en plattform der mikrosfære kan heves og isolert fra omgivelsene, og hindrer skader på overflaten.
2. Ved hjelp av saks, klippe en 3 tommers del av optisk fiber fra en spole med optisk fiber.
3. Ved hjelp av en No-Nik fiber-stripper, strippe den beskyttende polymere belegget fra de siste 0,5 inches av slutten av avkappede fiber, slik at bare silika kjernen. Rengjør overflaten av eventuelle gjenværende polymer med en Kimwipe fuktet med metanol ved å tørke forsiktig av fiber med Kimwipe.
4. Ved hjelp av en naken fiber cleaver, trimme strippet slutt så thpå bare ca 1 millimeter av strippet fiber forblir på slutten av fiber.
5. Plasser strippet enden av optiske fiber inn i banen til en CO _2-laser, ta vare å vertikalt justere fiber slik at dens strippet slutt vender nedover.
6. Slå på CO _2-laser, og lede den til overflaten av strippet slutten av optiske fiber. Laseren vil smelte strippet enden av fiber inn i en sfære med ca 3,5% strøm i 2 sekunder.
7. Ved hjelp av pinsett, nøye tak i stammen (den ikke-nedstrippet delen av optisk fiber) av mikrosfære. Fest stammen til tapen rulle på mikrosfære bolig. Glasset lysbilde kan selv lagres i en petriskål. Dette åpner for sikker lagring av mikrosfære.

3. Fylle overflaten med hydroksylgrupper

1. Bruke Piranha løsning:
   1. I en 60 ml polypropylen hetteglass med et hengslet lokk, utarbeide en piraja løsning (70:30 av volum rykende H 4: H ₂ O ₂ (30 wt%)) ved å tilsette 5 ml hydrogen peroxide til hetteglasset, fulgt av 11,6 mL av rykende svovelsyre. FORSIKTIG: Bruk syre-resistente hansker.
   2. Overfør glass-slide, holder minst en mikrosfære, til hetteglasset. Den mikrosfære bør være i kontakt med væsken, men væsken skal ikke berøre papp. Juster volumet av løsningen hvis nødvendig.
   3. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og sette den inn i en annen plast hetteglass DDI H ₂ O. La prøvene sitte i løsningen i 5 minutter.
   4. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og plasser den en ovn ved 80 ° C i 10 minutter for å tørke overflaten.
2. Bruke oksygen plasma behandling:
   1. Overfør glass-slide inneholder minst ett mikrosfære til oksygen plasma kammeret.
   2. Sett oksygentrykket til 200 mTorr, og kraften til 120 W. avsløre prøven til oksygen plasma for 2 minutes.
   3. Fjern glass-slide fra plasma kammeret.

4. Feste silane kopling agenter til overflaten

1. Plasser glass-slide, som inneholder minst ett mikrosfære, inn i et vakuum eksikkator i en avtrekkshette.
2. Også i avtrekksskap, åpner silane kopling agent flaske (i dette tilfellet ble aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) brukt), og plasser åpnet flasken i eksikkator.
3. Sett på lokket på vakuum eksikkator, og fest utgangsporten til en vifte eller hus vakuum linje.
4. Slå på huset vakuum eller vannlinjen, og evakuere den vakuum eksikkator. Når et vakuum forsegling dannes mellom lokket og bunnen, begynne timingen reaksjonen. Dette vil deponere silane koblingen agenten på overflaten som en tynn film.
5. Etter 15 minutter, slå av vakuum, og sakte åpner porten for å la luft inn i eksikkator. For denne kopling agent, er 15 minutter nok til å danne en uniform monolayer på overflaten. For andre kopling agenter, kan tiden må justeres.

5. Feste Biotin til overflaten

1. Omtrent en time før du fester biotin, utarbeide en 10 mM løsning av N-hydroxylsuccinimide biotin (NHS-biotin) i vannfri Dimetylsulfoksid (DMSO) i en 60 ml polypropylen hetteglass med et hengslet lokk.
   1. Hvis NHS-biotin har vært lagret kaldt, la den nå romtemperatur før masse som det ut.
   2. Sonicate løsningen for en time å fullt oppløse NHS-biotin pulver i oppløsningsvæsken.
2. Overfør glasset lysbildet som inneholder mikrosfære inn i en annen plast hetteglass med mikrosfærer nederst, og stammer på toppen av hetteglasset.
3. Transfer, med en plast pipette, en passende volum av NHS-biotin løsning nedover siden av flasken, bak glass-slide (slik at løsningen ikke berøre mikrosfære som det blir lagt til i hetteglass). Add nok løsning for å dekke mikrosfære overflaten.
4. Plasser hetteglassene nå inneholder mikrosfærer og NHS-biotin i DMSO løsning på en gyngende inkubator (tilt brett) i 30 minutter ved romtemperatur, med den hastighet og helning på 5 rpm og 5 grader, henholdsvis.
5. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og skyv den inn i en annen flaske fylt med DDI H ₂ O. Plasser hetteglasset på tilt skuffen for ytterligere 10 minutter i samme tempo og tilt vinkel som før. Gjenta dette trinnet to ganger med rent vann hver gang. Dette bidrar til å fjerne overflødig DMSO fra overflaten, og fjerner enhver fysisk-adsorbert biotin som gjorde faktisk ikke graft til overflaten.
6. Fjern glass-slide fra hetteglasset, og plasser den i en ovn ved 80 ° C i 10 minutter, eller til alle vanndråper er fjernet fra overflaten.

6. Fluorescerende merking av amin-avbrutt silica

1. Å merke amin gruppene tilstede etter behandlinent med APTMS, forberede FITC løsningen i et mørkt rom ved oppløsning 1 mg FITC i 1 ml vannfri DMSO.
2. Fortynne løsningen i 6.1 ved å legge 50 mL av FITC løsningen til 1 mL 0,1 M natrium bikarbonat buffer.
3. Plasser løsningen i en 60 ml polypropylen hetteglass med et hengslet lokk, og skyv forsiktig amin-avbrutt mikrosfærer, ligger igjen på glasset lysbildet, i hetteglasset.
4. Plasser hetteglasset i et isbad, og la prøven reagerer med FITC løsningen for minimum 4 timer i mørket.
5. Fjern overflødig fluoroforen gjennom to, 10 minutters skylling av mikrosfærer i natriumkarbonat buffer. Som før, fylle en 60 ml polypropylen hetteglass med et hengslet lokk med buffer, og skyv glasset lysbilde i løsningen, tar vare på at løsningen kun dekker mikrosfære, og ikke papp bolig. Dekk hetteglasset med aluminiumsfolie, og legg hetteglasset på en tilt brett satt til 5 grader og 5 rpm, som før.
6. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og skyv den inn i en annen flaske fylt med DDI H ₂ O og dekket med aluminiumsfolie. Plasser hetteglasset på tilt skuffen for ytterligere 10 minutter i samme tempo og tilt vinkel som før. Gjenta dette trinnet to ganger med rent vann hver gang. Dette bidrar til å fjerne overflødig farge fra overflaten.
7. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og tørr i en ovn satt til 80 C i 10 minutter før bildebehandling.

7. Fluorescerende merking av biotin-avbrutt silica

1. Forbered en 10 mikrogram / ml løsning av Texas-Red avidin i fosfatbufret saltvann.
2. Legg løsningen til en 60 mL polypropylen hetteglass med et hengslet lokk, og skyv glasset lysbildet som inneholder en biotin-avbrutt mikrosfære i løsningen, slik at mikrosfære er bare dekket av løsningen.
3. Reager i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
4. Fjern overflødig fluoroforen gjennom to 10 minutters skyllings av mikrosfærer i PBS-buffer.
   1. Som før, fylle en 60 ml polypropylen hetteglass med et hengslet lokk med buffer, og skyv glasset lysbilde i løsningen, tar vare på at løsningen kun dekker mikrosfære, og ikke papp bolig.
   2. Dekk hetteglasset med aluminiumsfolie, og legg hetteglasset på en tilt brett satt til 5 grader og 5 rpm, som før.
5. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og skyv den inn i en annen flaske fylt med DDI H ₂ O og dekket med aluminiumsfolie. Plasser hetteglasset på tilt skuffen for ytterligere 10 minutter i samme tempo og tilt vinkel som før. Gjenta dette trinnet to ganger med rent vann hver gang. Dette bidrar til å fjerne overflødig farge fra overflaten.
6. Fjern forsiktig glass-slide fra hetteglasset, og tørr i en ovn satt til 80 ° C i 10 minutter før bildebehandling.

8. Representative Resultater

Riktig functionalized mikrosfæres kan identifiseres gjennom optisk og fluorescens mikroskopi. Hvis overflaten funksjonalisering blir gjort riktig, bør det resultere i en enhetlig tett dekning av biotin molekyler på overflaten, og overflaten skal være feilfrie og forurensning-fri etter funksjonalisering for å opprettholde sin høye følsomhet under deteksjons eksperimenter. Optisk mikroskopi kan brukes til å undersøke sistnevnte, mens fluorescerende mikroskopi kan undersøke kvaliteten og ensartethet av overflaten dekning. I figur 2, viser vi eksempler på riktig functionalized mikrosfærer. Disse bildene viser at det ikke er noen skade overflaten eller forurensning som skyldes funksjonalisering (Fig. 2a), og at mikrosfærer viser en jevn, stabil dekning av enten amin grupper (Fig. 2b) eller biotin grupper (Fig. 2c) på overflaten .

Hvis mikrosfærer ikke blitt functionalized riktig, den optiske mikrosfære bilder will stille overflate kontaminering, klumper eller ikke-uniform dekning, og åpenbare feil i overflaten, som overflaten sprekker (Figur 3). Her ser vi en vanlig eksempel på overflaten forurensning som følge av klumping av reagenser på overflaten.

Figur 1. 3-trinns reaksjon ordning for feste probe molekyler på overflaten av silika mikrosfærer. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Silica mikrosfærer. a) Optisk micrograph av silika mikrosfære befolket med hydroksylgrupper via eksponering for oksygen plasma, b) Fluoriserende micrograph av silika mikrosfære befolket med primære aminer og merket med FITC fargestoff, c) Fluoriserende micrograph av silika microsphere befolket med biotin og merket med Texas Red-avidin konjugat. Gjengitt med tillatelse fra Soteropulos, CE, Hunt, HK & Armani, AM Fastsettelse av bindende kinetikk med hviskende gallery modus microcavities. Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics. ¹⁷

Figur 3. Optisk micrograph av feil functionalized sfære. Her kan du se støv på øverst til høyre overflaten, samt forurensning utvide fra overflaten. I tillegg viser høyre side av den optiske mikrosfære en liten divot på overflaten.

Som beskrevet i protokollene, skapte vi en bolig plattform ved å transportere silika mikrosfærer av sine stengler hele funksjonalisering prosessen. Dette huset plattformen ble opprettet som en løsning på overflaten forurensning og skader som resultat av mikrosfære komme i kontakt med veggene i de ulike containere som brukes i hele funksjonalisering prosessen. Vi skjønte det største hinderet oppsto fra stadig montering og demontering individuell mikrosfærer til forskjellige beholdere under funksjonalisering prosessen. Det var vanskelig å unngå å børste mikrosfære mot et objekt når du flytter hvert individuelt med pinsett ved å holde i stilkene. Ved å stabilisere plasseringen av hver mikrosfære på glass-slide, kunne vi bare flytte en rekke mikrosfærer i og ut av forskjellige beholdere ved håndtering av glass-slide, og ikke stammen av mikrosfære. På denne måten klarte vi å functionalize mange av disse devICES på samme tid, og vi fjernet forurensning og overflate skader forårsaket av feil håndtering, noe som resulterer i en ~ 90% suksessrate på å skape uskadet, functionalized mikrosfærer.

Som det fremgår av protokollene, utforsket vi to metoder som til hydroxylate silika mikrosfærer. Mens Piranha løsning er ofte brukt for dette, kan det være tidkrevende, og krever våt kjemi. Når du arbeider med mikrosfærer, bemerket vi overlegenhet hydroksylering gjennom oksygen plasma behandling. Oksygen plasma behandling krever ingen kontakt med flytende løsninger, ingen uttørking, og ingen håndtering av silika mikrosfærer. I tillegg er det en mye raskere prosess å fylle overflaten med hydroksylgrupper. Vi forstår at ikke alle forskergruppe vil ha tilgang til oksygen plasma utstyr, og derfor kan være nødvendig å bruke piraja løsning for å danne den nødvendige hydroksyl funksjonalitet. Bruken av enten vil resultere i dannelse av hydroksyl grupper påoverflaten.

Forebygging av forurensning under overflaten funksjonalisering er et stort problem, men det kan minimeres ved forsiktig tilslutning til protokollene. De mest sannsynlige årsakene til forurensning er dårlig håndtering under funksjonalisering, samt utilbørlig eller ikke grundig vask av overflaten etter hver av reaksjons-trinnene. Dette er særlig tilfellet under den første reaksjonen trinnet, der overflaten er befolket med hydroksylgrupper. Hvis piraja løsningen er valgt for denne metoden, må man sørge for å grundig fjerne svovelsyre fra overflaten, og for å tørke mikrosfære, som overflaten er nå svært hydrofile, og vann fra skyllingene klamrer seg til overflaten. Hvis svovelsyre forblir på overflaten, blir mikrosfære "klissete" og støv fra laboratoriet miljøet samler seg på overflaten lettere. I tillegg vanndråper på overflaten føre til silane koblingen agent for å samles i området av wateh dråper, danner en polymer silika glob, som blir sett på som klumper i det fluorescerende mikrografer. Hvis overflaten clumping ikke forekomme, hindrer den mikrosfære fra å bli brukt i deteksjon eksperimenter, på grunn av en stor nedgang i følsomhet for enheten. Vanligvis når oksygen plasma behandling brukes, blir overflaten klumper, samt forurensning, minimeres. Men ikke alle laboratorium har tilgang til dette utstyret, så bruker Piranha løsning kan være en nødvendighet.

Til slutt fant vi det var nødvendig å sonicate NHS-biotin løsning før bruk for å fullt ut oppløse NHS-biotin i DMSO. Når dette trinnet ble droppet, ville NHS-biotin deponere på overflaten i store klumper via fysisk adsorpsjon, snarere enn kovalent binding til overflaten. Disse store klumper er ekstremt vanskelig å fjerne i løpet av de vaske trappen, men kan forebygges ved riktig spredning under den første oppløsning. En time er vanligvis tilstrekkelig for dette formålet;men hvis disse prosedyrene er utvidet til andre probe molekyler modifisert med NHS ester grupper, anbefaler vi evaluere løsningen via dynamisk lysspredning for å sikre full oppløsning.

Protokollene beskrevet her representerer et skritt videre i oversettelsen av planar silika overflaten kjemi som tredimensjonale enheter, hvor kvaliteten på overflaten dekning og enheten overflaten er like viktig for den endelige bruken av enhetene. Når disse protokollene er brukt, viste det fullt functionalized mikrosfærer jevnt tett dekning av sonden molekylet, uten forurensning eller klumper på overflaten. Denne jevn overflate dekningen tillater vedlikehold av høy følsomhet når disse enhetene brukes i deteksjon eksperimenter. Bruken av silane kopling agenter som en bro mellom uorganisk substrat og det biologiske sonden molekylet er enkel og grei, og kan brukes, spesielt med godt forstått (og veldig common) NHS ester kjemi, for å fylle optiske biosensor overflater med probe molekyler av ulike typer.