回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用

すべての手順は、層流フードでBSL-2の条件下で実行する必要があります。

1。 STLVバイオリアクターを準備する

1. 製造元のプロトコールに従ってSTLVバイオリアクターを組み立てるとバイオリアクターの無菌性を確保するための解毒プロトコルを実行します。ルアーキャップ付きのオープンポートをカバーし、24時間の95％エタノールでSTLVを記入してください。
2. エタノールを除去し、24時間滅菌蒸留水でSTLVを記入してください。
3. 唯一の滅菌蒸留水で1.2を繰り返します。
4. ベンダーによって提供されるツールを使用して、滅菌袋の中に20分間110℃ですべてのネジ、キャップ、センタープラグSTLVから、オートクレーブを緩めます。
5. STLVが冷却されたら、ネジを締めと不妊との完全な解毒を確保するためのステップ1.1から1.4を繰り返します。
6. 各ポートにあらかじめ滅菌一方向のコックにSTLV、ネジを冷却のネジを締めます。
7. 垂直ノブを配置することによって、オープンコック。
8. 無菌性を維持するためにラッパーに戻って10 mLと5 mLのルアーロックシリンジと再スリーブプランジャからプランジャを取り外します。コックの上に注射器（ルアーロックチップシリンジは、このステップに必要とされる）をねじ込みます。
9. ダルベッコを追加するリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）10 mLシリンジにSTLVがいっぱいになって、5 mLシリンジを埋めるために開始されるまで。
10. 各シリンジに無菌のプランジャを交換し、シリンジのプランジャを駆動交互にバイオリアクターで発生した残留気泡を除去します。
11. すべての気泡を除去した後、バイオリアクターに接続されたシリンジのままにしておきます。コックを閉じて、回転垂直プラットフォームにSTLVを添付し、漏れを監視するために24時間の最低回転させます。

2。マイクロキャリアビーズを準備する

1. STLV（1.4）と同じ条件下で50 mLコニカルチューブ、オートクレーブで〜250mgのcytodexマイクロビーズに15 mLのDPBSを追加します。
2. 冷却後、DPBSを削除epitheliを成長させるために使用するメディアを追加するらは、目的の細胞、およびスワール管ビーズを再懸濁する。
3. メディア、さらに2回のステップを洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、ビーズに15mLの増殖培地を追加します。

3。 STLVバイオリアクターへの上皮細胞とビーズを播種

1. あなたは≥1×10 ⁷細胞を得るまでの組織培養フラスコの単層として興味のある上皮細胞を成長させる。フラスコから細胞を（すなわちtrypinsization、EDTA）を削除し、細胞濃度を確立するために細胞をカウントし、トリパンブルー排除染色¹によって細胞の生存率を決定します。
2. 準備されたビーズ（2.3を参照）を含むコニカルチューブに、目的のあなたの上皮細胞の種類（図1A）に応じて、細胞の所望の濃度^{（2×5×10 7}上皮細胞^）2、8を追加^します 。すべての細胞が円錐管を洗浄することによって転送されることを確認してください。
3. STLVからDPBS、シリンジを取り外します。
4. センターポートからプラグを取り外し、上皮cを追加エル/ 10 mLの血清学的ピペットを使用してSTLVにビーズ懸濁液。すべての細胞/ビーズSTLVに転送されていることを確認し、センターポートプラグを交換する円錐管を洗浄します。
5. 無菌性を維持するために戻って、ラッパーで5〜10 mLの注射器と再スリーブプランジャからプランジャを取り外します。オープンコックのポートにシリンジをねじで固定します。メディアとSTLVを埋める、プランジャー、クローズコックを交換してください。
6. 回転なしで30分間、37℃インキュベーター内で新たに播種したSTLVを配置します。
7. オープンコックは、プランジャーを使用して気泡を除去して、[閉じるコック。
8. 20回転（図1B）で37℃、5％CO ₂の加湿インキュベーター回転でSTLVを配置します。文化は、サンプリング変化メディア、または収穫の集計（次のセクションを参照）を除いて24ヘクタール日連続して回転する必要があります。

4。文化の培養、サンプリング、フォトドキュメント

1. 双方向での培養細胞の初期の96から120時間後oreactor、傾斜による変更のメディアSTLVと細胞/ビーズが沈降することができます。 、シリンジを取り外し、両方のコックを開き、サイドポート（ 図1C）からのメディアの〜75％をオフに注ぐ。メディアの細胞代謝に基づいて、メディアの初期シードと96から120時間の培養期間の後、毎日または隔日に変更します。
2. プランジ​​ャの5〜10 mLの注射器のvoidにねじ込み、上記のように再給プロトコルに従う（1.7から1.11）、次にプラットフォームを回転させ所定の位置にSTLVバックを閉じてネジ止めしてください。
3. 毎5-7日間を慎重に2つの1.5 mlチューブにセンターポートから集合体の少量（〜200μL）を除去することによりSTLVに播種後、凝集体の成長と生存率を監視します。集約せん断を避けるために、すべての集合を転送するためのポイントから〜2cmをカットし、滅菌された1000μLピペットチップを使用しています。
4. センタープラグ、新しいシリンジとの交流、上記のようにSTLVに新鮮な培地を追加します（1.7から1.11）を交換し、でSTLVバックを置く回転インキュベーター（3.8を参照）。
5. 上皮細胞は組織培養フラスコ（すなわち、トリプシン処理）から削除された細胞の生存率を監視するためには、ステップ4.3に分注し、2つの1.5 mlチューブの凝集体のいずれかを使用し、同様にビーズから細胞を削除します。 ¹染色トリパンブルー排除法により生存率を監視します。
6. イメージング細胞凝集は、2番目の1.5mLのアリコートを集約し、カットオフ1000μLピペットチップを用いた小型ペトリ皿への転送にメディアの0.5〜1 mLを加える。倒立光学顕微鏡を使用してイメージを集約した（図1D）。

5。集約を転送し、収穫

1. いくつかの上皮細胞のモデルのためには、培養エアレーション^2を増加させる使い捨てHARVに集計を転送する必要があります。約前の分析のための集計を収穫の一週間は、STLVから注射器や栓を取り外し、サイドポートからメディアの〜50％をオフに注ぐ。
2. レムSTLVの中心プラグオベと慎重に中央のポート（図1E）から50 mLコニカルチューブにすべての内容を注ぎます。 5 mLのメディアでSTLVを2回リンスし、凝集体の残りの部分とリンスを兼ね備えています。
3. 5.2で説明されるように集計を転送を続行しますが、50 mLコニカルチューブからHARVへの転送を集計しています。
4. として〜1週間後、またはSTLVからHARVから慎重に収穫凝集体は、（細胞の種類に基づいて）（5.2）の上を行った。集計収穫後の潜在的なアッセイフォーマット、アッセイおよび分析のために、以下を参照してください。

6。集計を含む実施可能性の分析、アプリケーションとアッセイ

1. 様々な実験形式の集計を播種50 mLコニカルチューブから1.5 mLチューブ、24ウェルプレート、または滅菌カットオフ1000μLピペットチップ（図1F）を使用して、96ウェルプレートに集約し、所望の量を転送します。
2. 洗浄とた準備分析用の集計を優先します。凝集体が落ち着いた後にメディアを取り出します。管の中心に直接DPBSを分配するかもあるのですべての集計は、最大攪拌されています。一度凝集体が底に沈殿している、DPBSを削除し、必要に応じて何度でも繰り返します。
3. オフサイトの実験と分析のための輸送を集約し、50 mLの試験管に凝集体の所望の量を追加し、6.2のように凝集体を洗ってください。完全に漏れを避けるためにキャップの周りメディア、キャップ、パラフィルムで50 mLのチューブをご記入ください。しっかりと周囲温度で一晩目的の場所に集計を出荷する。
4. 電子顕微鏡（図2）の集計を修正 。スキャン、送信または免疫電子顕微鏡は、1.5 mLのチューブに150から300μL集計を転送し、DPBS（6.2）で集約を3回洗浄することにより行うことができる。希望の潜伏期間のためのアプリケーション固有の（SEM、TEM、免疫EMなど）を電子顕微鏡固定液200μLを追加します。 aggregatを洗って、修正する削除する2 DPBSと時刻、およびとしてイェルムらに概説進むES 2010年の走査および透過型電子顕微鏡^2。
5. 免疫蛍光顕微鏡画像（図3）。転送〜1.5 mLのチューブと洗浄の集計（6.2）100μLを集約します。 1.5 mlチューブを除いて、単層と同様の条件下で抗体を用いて修正して、ラベルを集計しています。マウント、顕微鏡スライド上にマウントするメディアの1滴を配置するには、一晩の集計、マニキュア液でシールカバースリップ、ドライスライド²以上のカットオフ1000μLピペットチップ、場所のカバースリップをマウントするメディアの上に標識された集計を転送します。
6. MTTアッセイ（図4）を使用して、細胞の生存/増殖を測定する24ウェルプレートに凝集体を移し、625μLのフェノールレッドフリーのメディアとメディアを交換してください。各ウェルに5 mg / mLのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド（MTT）の62.5μLを追加し、37℃で4時間インキュベート℃、は100 mg / mLのSDS-0.01の625μLを追加します。M HClを各ウェルに、一晩インキュベートする。 570 nmの吸光度を読み、式を使用して％の細胞生存率を取得します。

7. 毒性試験 。 24ウェルプレートに凝集体を移し、初期の細胞の生存率/濃度≥2ウェルにトリパンブルー排除を実行します。井戸を複製する濃度の範囲で試験化合物を追加します。細胞の生存率（図5A）の場合は、凝集体を洗って、治療後にトリパンブルー排除を実行します。 TC _50（図5B）の場合は、時間をかけて各濃度のウェルの細胞生存率を取ると毒性濃度^{50％2、15を}決定するためにリードMuenchメソッドを使用します。
8. サイトメトリービーズアレイ（CBA）またはELISA。携帯電話上清を図示任意の実験的なフォーマットで細胞を播種した後に撮影することができます。として培養した細胞と同様にシード凝集体を刺激する単分子膜は、ELISAまたはCBA（図6）により、分析のために-80℃で上清（≥120μL）、および店舗を収集します。
9. RNA分析は1.5 mLのチューブとDPBSで洗浄集合体の凝集体の≥500μLを転送します。 20ゲージ針を用いてライセートのホモジナイズした動物細胞用キアゲンRNAeasyキットとプロトコルを使用して抽出を続行します。ビーズは前の転送上清に、チューブの底に沈殿させるにすることを確認し、スピンカラム（ビーズが低いRNAの収率で得られたカラム·メンブレンを詰まらせます）（図7）に空のビーズを転送しません。
10. タンパク質分析。1.5 mlチューブまたはそれ以上の実験の形式を使用して単層の場合と同じ方法で下の収穫を集計しています。しかし、凝集物の溶解後に、ビーズは、タンパク質のゲルやタンパク質分析の他のフォーム（図8）を実行する前に別のチューブにライセートを解決し、転送することができます。
11. 感染症研究所望の実験的な形式にシードを集計しています。細胞数を列挙し、細胞の生存率を定量化するためにビーズから細胞をトリプシン処理のために少なくとも2つのウェル/サンプルを使用しています。単層（図9）として培養した細胞で実行されるように感染症の選択された多重度で興味のある病原体と凝集体を感染させる。洗浄工程は、6.2のように実行する必要があります。
12. フローサイトメトリー：50 mLの試験管に、洗浄の集計（6.2）、および37℃で5〜10分間2mMのEDTAを加える℃でシードを集約細胞に5から10 mLのメディアを追加し、セルストレーナーを介して細胞を渡します。冷ブロッキング溶液中でポリプロピレンチューブおよび洗浄細胞へ分注し^{1×10 6}細胞（1％PBSでFBS）。抗体で細胞を再懸濁し、メーカーによるとインキュベートします。 PBSで再懸濁し、遠心分離、および分析のためのフィルターチューブに転送細胞（図10）で細胞を洗浄します。

7。代表的な結果

の例STLVバイオリアクターシステムに成長し分化したヒト上皮細胞集合体は、 図2で見ることができます。 SEM像、TEM像はmicroridges、陥入、細胞内の分泌小胞、および頂端表面上の微絨毛が観察できる39日間STLVで育った人間の膣細胞から収集されます。バイオリアクターで増殖させた上皮細胞の in vivoのような特性の更なるデモはムチン（MUC1）を発現する3-D膣細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像（ 図3）および上皮細胞に特異的なマーカー（ESA）と分化することによって観察することができ（インボルクリン、INV）。

に示すように、3次元凝集体が組織に類似した超微細構造の特徴を表示するには、しかし、彼らは多くの生理学的に関連する表現型はまた、化合物の毒性を評価するための優れたプラットフォームとして機能します。 MTTアッセイ、一般的に使用される細胞の生存率を測定するアッセイ、代謝またはproliferaのるには、様々な化学物質及び化合物（ 図4）への毒性を測定するために使用することができます。トリトンX-100、細胞膜を破壊する洗剤は、MTTアッセイを検証するためのポジティブコントロールとして使用されていました。試験化合物による治療後の毒性を測定するための追加の方法は、トリパンブルー排除（ 図5）です。ノノキシノール-9（N-9）で処理した後、膣の凝集体は、単^2、16に比べて子宮頸植モデルに似た毒性応答が、異なるプロファイルを示した。

in vivoでの組織に機能し、同様に通知するバイオリアクターで増殖させた上皮細胞の能力を実証する追加の研究は、 図6に観察することができます。 Toll様受容体（TLR）によって認識される微生物由来分子で刺激すると、凝集体は応答してIL-6 ^1を含む炎症性サイトカインを分泌する。プロゲステロン受容体（PR）の発現、ホルモン刺激に応答する受容体は、また、両方のRNAとタンパク質レベル（ 図7および図8は、それぞれ）で膣の細胞で観察することができます。 3-Dの集計にのみ病原体とホルモン分子に応答する能力を持っているだけでなく、機能的に単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）感染症をサポートすることができません。 HSV-2感染した3-D膣の凝集体の共焦点顕微鏡像（ 図9）は感染を示しています。並列2-D膣上皮細胞の培養は、HSV-2感染によって引き起こされる重篤な細胞破壊の結果として表示されません。 RWV由来の3-D集計は^、9、それぞれ^8、細胞の成長曲線とプラークアッセイを介して細菌やウイルスの複製を定量化するために使用されている。最後に、集合内の個々の細胞の物理的および機能的特性は、フローサイトメトリーにより定量することができる。 exampのためにLEは、個々の膣細胞（ 図10）上にMUC1表面発現を測定するフローサイトメトリーアッセイを採用しています。膣の3-D集合体は単層（67.2％）と比較してMUC1の割合が低い（27.7％）を表明した。単層に比べて3-D集約表面上にMUC1の低い割合が膣管^17、18で観察された細胞から分泌されているMUC1の過半数の結果であるかもしれません。

図1。 RWV由来の凝集体を用いて培養RWVにおけるヒト上皮細胞や潜在的なアプリケーションのための模式図）。上皮細胞は当初、組織培養フラスコ中の単層として栽培されています。一度コンフルエントに、細胞をフラスコから除去し、STLVバイオリアクターにおけるマイクロキャリアビーズと結合されます。スケールバー：80μmのB）STLVは、低fの定数自由落下環境を作成するためのプラットフォーム上で回転させるLUIDのせん断、細胞が付着し、それによって目に見える細胞の凝集体を形成するビーズ上に成長することができます。C）96時間後、STLVのメディアは、細胞代謝に対応するために変更する必要があります。メディア側のポートから注がれ、新鮮なメディアが接続された10 mLの注射器（プランジャーは削除）を介して置換され、シリンジのプランジャを交換して押し出すの泡に使用されます。Dは）〜5日後（d）の凝集体は形成され始める。完了する凝集体形成と細胞分化が発生した凝集体は、7日ごとにサンプリングし、その発達の進行を（3-Dヒト上皮膣細胞の20倍の倍率）を監視する光顕微鏡により撮像された。E）、集計はバイオリアクターから採取されており、 pote 50mLのコニカルチューブに移す。F）の集計を1.5 mLのチューブや実験解析およびアッセイを行うためのマルチウェルプレートフォーマットに播種することができます。G）の概要集約を実施することができますntialアッセイと分析。分析のこの代表的なリストは、すべての潜在的なダウンストリームアプリケーションの徹底的なカタログであることを意味していません。

図2。電子顕微鏡を用いた3次元上皮細胞凝集体の形態学的および構造的特性を調べる。（）3-Dヒト上皮膣細胞集合体の電子顕微鏡（SEM）画像をスキャンしています。スケールバー：200μmの（100）、100μmの（200倍）、50ミクロン（500分）。 （B）細胞内の分泌小胞と絨毛または（C） "細胞プロセス"を指す矢印の付いた3-Dヒト上皮膣細胞集合体の透過型電子顕微鏡（TEM）画像。スケールバー：2μm以下（イェルムらから変更2010年^）2。

g3.jpg "/>
図3。のために（B）抗体は、特定の、固定の32日後、バイオリアクターから採取した人間の3-D膣細胞は、3-D上皮細胞凝集体における接合部の分化と蛋白質マーカーを同定するために使用され、（）ムチン抗体MUC1で染色し共焦点蛍光顕微鏡上皮細胞、ESA、または分化した上皮細胞を認識する（C）抗インボルクリン（INV）抗体。集計は、間接的にアレクサ488二次抗体（緑）で標識した。スケールバー：60μmの（イェルムらから変更2010年^）2。

図4。 MTTアッセイは、細胞生存率を測定するために使用されています。人間の3-D膣集計は24ウェルプレートに播種し、37℃で培地単独（未処理）、または0.01％、0.1％または1.0％のTriton X-100で1時間洗浄剤で処理した° C. Followinグラム処理、メディアが削除されたとMTTアッセイは、細胞生存率を測定するために行われた。 ** P <0.001を表します。片側スチューデントt-検定は、未処理コントロールにトリトンX-100処理した細胞を比較します。

図5。画面の化合物の毒性に3-D上皮細胞凝集体を利用。（）ノンオキシノール-9（N-9）用量依存性の生存曲線の24時間に比べて3-Dのヒト膣上皮細胞モデル（赤線/バー）の後処理コンフルエントな単層（黒線/バー）として成長した同じ細胞型。1.5時間、4時間、8時間、24時間後の治療では、膣上皮細胞の培養（）の（B）N-9 TC _50のレベル。 * P <0.05を表す。片側スチューデントt-検定各露光時間で3-D細胞への単分子膜を比較します。 （イェルムらから変更され、2010年^）2。

/ files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
図6。 Toll様受容体（TLR）アゴニスト刺激に応答して3-D上皮細胞のサイトカイン産生の解析。三次元の人間の膣細胞は、FSL-1（TLR2 / 6）、PIC（TLR3）、FLAG（TLR5）で刺激した、24 hと分泌サイトカインのCL097（TLR7 / 8）フローサイトメトリービーズアレイにより測定した。 IL-6が生成し、測定の代表的炎症性サイトカインとして表示されます。 * P <0.05を表す。PBS群に刺激されたサンプルを比較片側スチューデントt-検定を。 （イェルムらから変更され、2010年^）2。

図7。 3-D上皮細胞の監視の遺伝子発現。 プロゲステロン受容体の半定量的RT-PCR解析（PR）単分子層（ML）または3-Dのヒト膣上皮細胞での発現。GAPDHをローディングコントロールとして表示されます。増幅産物示すように、30サイクルのPCR後に発生した転写産物の発現の結果である。 矢印は3-Dのサンプルで発生したPRのバンドにポイントを率いている。

図8。 3-D上皮細胞のタンパク質発現解析。単層および3-Dのヒト膣上皮細胞の全細胞溶解物（30μg）のウェスタンブロット分析は、抗プロゲステロン受容体（PR）抗体でプローブした。 β-チューブリンは、コントロールをロードするためのプローブとして使用されていました。

図9。三次元ヒト上皮細胞モデルでは、生産的なウイルス感染をサポートしています。HSV-2に感染した3-Dのヒト膣上皮細胞集合体の共焦点蛍光顕微鏡画像が。細胞は2時間、洗浄し、固定の24時間後の感染症（4％PFA）のMOI 1.0で感染し、HSV-2固有のVP5 Cで染色したapsid抗体（緑）と核染色DAPI（青）。スケールバー：50μmである。

図10。フローサイトメトリーによる3次元ヒト上皮細胞モデル内の個々の細胞分析。 （A）単層または（B）3-Dのヒト膣上皮凝集体は、FITCコンジュゲートMUC1抗体（青）、アイソタイプコントロール（緑）、またはPBS（赤）で標識し、EDTAで解離し、そしてFITC式がによって定量したフローサイトメトリー。数字はアイソタイプコントロール染色した細胞からのバックグラウンド蛍光アウトゲーティング後に残ったムチン抗体が陽性に染色されている細胞の割合を表しています。不均一なピークは、これらの細胞の表面上のglycosolationパターンとMUC1の様々なレベルの多数の結果である。

ここに提示RWVバイオリアクター技術の活用は、より生理学的に関連する器官の細胞培養モデルに、現在の細胞培養系を前進させる能力を研究者に提供することがあります。 RWVバイオリアクター細胞培養システムは、タイトジャンクション、ムチン産生、細胞外のプロセス（すなわち微）、および細胞の極性を含む生体のような特性にして3-Dの細胞凝集体を形成する細胞を可能にする低剪断の微小環境を提供します。ここで提示されたデータと例の大半はRWVシステムに成長した膣上皮細胞を使用しているしかし、RWVシステムも小腸および大腸、肺、膀胱、肝臓、扁桃上皮細胞を含む培養他の上皮細胞の種類に使われている3-D器官モデル^{1、7-13、18を}形成^する 。さらに、このシステムは、上皮細胞以外の培養細胞の種類に使用されており、複雑な、multicelの現在開発中lular器官培養モデルは、進行中の^2、18である。

ここで説明するプロトコルは、ガイドとして使用することを意図されており、目的の細胞タイプに基づいて変更する必要があります。 RWVシステム内の培養上皮細胞のためのプロトコルの最も一般的な変更は、初期のセルがSTLVで培養される時間の長さ、意思決定とSTLVからHARVへ集約移転のタイミング、および細胞/ビーズ比が含まれていSTLVに播種。成功した凝集体形成のために考慮されるかもしれないより専門的な変更は、表面積、直径、形状、表面コーティング、密度、電荷、コア材料、気孔率などのマイクロビーズまたは足場のプロパティです。さらに、基本培地、製剤、またはサプリメントの調整は、培養条件を最適化し、凝集体形成を最大化するために必要があるかもしれません。調整はでは、バイオリアクターシステムとそのコンポーネントに対しても行うことができますバイオリアクターの容器のサイズと回転速度をcluding。バイオリアクター内の微小環境の強化された評価のために、灌流培養系は、凝集体形成のために多産の環境を確保するため、培養容器内のpH、酸素とグルコース濃度の連続監視を可能にすることも可能です。培養条件、凝集体形成、細胞分化、それぞれの新しいモデルシステムを特徴づけるとともに、バイオリアクターシステムの初期費用を最適化するために、潜在的に長い時間、このシステムに注目すべき欠点があります。しかし、研究室で実装されているすべての新しい培養系は、同様の欠点があります。

我々と他のヒトの細胞を利用したRWVから派生したモデルは、ヒト^1、2、18に関連しているファッションのワクチン、殺菌剤、生物製剤、医薬品の有効性、毒性、薬物動態を予測するための貴重なツールであることが示されている。目の成功とその柔軟性と組み合わせて本物の人間の応答を生成するためのバイオリアクター培養システムである、RWVバイオリアクターシステムのアプリケーションは、現在腫瘍モデリング、再生医療、組織工学^{2、18から23}などの分野に展開されています。我々は、人間の粘膜組織の構造と機能の両方を複製し、より複雑な多細胞システムを作成するために働いている私たちのRWV生成された粘膜モデルを推進する。しかし、著者は、それが薬やワクチンは、人間の生理的なシステムで持っている複雑な相互作用を再現するために複数のモデルシステムを利用したり、統合する必要があるかもしれないことを認めるものとします。全体的に、RWVバイオリアクターとその実験的なアプリケーションを使用しての私たちの目標は、優れた粘膜組織の生物学と人間の器官のモデルで、環境傷害に対する細胞応答を理解することです。