ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

試薬およびソリューション

EMG-2メディア（ロンザ、カタログ番号CC-3162 EBM-2培地とEGM-2 SingleQuotキットサプリメント＆成長因子を含む）

全体SingleQuotキットサプリメント＆成長因子（ロンザ、カタログ番号CC-4176）、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）を添加したEBM-2（ロンザ、カタログ番号CC-3156）と1％（v / v）のペニシリン（10,000 U / ml）を/ストレプトマイシン（10,000μg/ ml）を/アンフォテリシン（25μg/ ml）を。 4℃で1ヶ月まで保存限りECFCのカルチャで使用するための推奨EGM-2ボリュームは、500μl/ウェル、24ウェルプレート用、2ミリリットル/ 6ウェルプレート、5ml/25-cm ^2つのフラスコ、10 ml/75-cm ²フラスコのためのものですそうでないプロトコルで指定された。

コラーゲンI溶液

の滅菌蒸留水495ミリリットルの氷酢酸（17.4N）（0.02 N最終濃度）の0.575ミリリットルを希釈します。滅菌フィルター掃除機0.22-μmの希酢酸uumのろ過システム。 50μg/ mlの最終濃度まで希酢酸に25 mgのラット尾コラーゲンIを追加します。コラーゲンの量は、コラーゲン原液濃度に応じて異なります追加しました。 4℃でヶ月まで保存

I型コラーゲンでコーティングされた組織培養表面の作製

6ウェル組織培養プレート（/ウェル、24ウェルプレート、3ml/25-cm ^2つのフラスコ、8 ml/75-cm ²フラスコに300μlを使用）の各ウェルのI型コラーゲンは溶液の代わりに1ミリリットル。 37℃で一晩に1時間インキュベート℃にI型コラーゲン溶液を除去し、表面を2回洗い、毎回PBSで（24ウェルプレート、6ウェルプレート、5ml/25-cm ^2つのフラスコ、10 ml/75のために2ミリリットル/ウェルのために使用液500 /ウェル-cm ^2のフラスコ）。細胞培養のためにすぐにプレートを使用しています。

FACS染色バッファー

2％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）を添加した生理食塩水（PBS）をリン酸緩衝。店U4で2週間、P℃に

A. ECFC伸長、​​クローニングおよび拡張

1. 単核細胞（MNC）を分離するためにプロセスのサンプルを、室温で実験室に抗凝固剤とトランスポートとしてヘパリンとCB（10 Uヘパリン/ mlの血液）またはEDTAを収集し、即座に（幼児の引渡しの2時間以内）。
2. アリコート15は各50 mlのコニカル遠心チューブにCBのmlと混合するCBとピペットで数回の各チューブにPBS 20 mlを追加します。 20 mlのシリンジに15ミリリットルをFicoll-Paqueを描き、20G針やミキシングカニューレを添付してください。希釈した血液のチューブの底に混合カニューレの先端を置き、慎重にアンダー15ミリリットルはFicoll-Pague。減速ブレーキを設定せず、室温で、チューブを740 xgで30分間遠心します。
3. ピペットを用いて、をFicoll-Paqueと希釈した血漿の間のインターフェイスに位置する低密度の多国籍企業の濁った層を削除します。 50 mlコニカルチューブCONTに多国籍企業を分配する10ミリリットルEGM-2培地をaining。高減速ブレーキ設定で、室温、515 xgで多国籍企業10分間遠心します。
4. 慎重に吸引し、上清を捨てる。二回EGM-2（515×gで10分）、1.25×10 ⁷細胞/ mlのEGM-2で再懸濁する多国籍企業でペレット化した細胞を洗浄する。よく当たりのI（50μg/ ml）を1ミリリットルラットテールコラーゲンタイプを追加し、一晩、プレートをインキュベートすることにより、I型コラーゲンコートした6ウェル組織培養プレートを準備します。ピペット4各ウェルにこのMNC懸濁液のmlおよび37にセルを配置°C、5％CO ₂の加湿インキュベーター。 A.1.5）24時間後（1日目）、ゆっくりとピペットでウェルから使用済み培地を（緩く付着細胞を乱さない）を取り外し、ゆっくりウェルに4ミリリットルEGM-2を追加し、インキュベーターにプレートを返す。 2日目、リフレッシュゆっくりピペットでウェルから培地（緩く付着細胞を乱さない）を削除し、4ミリリットルEGM-2を各ウェルに加えることによって培地。培地交換毎日の国連を繰り返す7日と一日おきにティルECFCコロニーはクローニングのために表示され、その後まで。典型的コロニーは14日、5日と⁷日の間（ 図1）が表示されます。
5. 倒立顕微鏡（倍率10倍）を使用して、石畳の形態を有する典型的なECFCコロニーを可視化し、各コロニーの位置を示すために、ウェルの底面上にマーカーでコロニーの境界をマークします。
6. 14日目に、シリンダー内のセルをカバーするためにクローニングシリンダーとだけで十分TrypLE Expressを使用してPBSと収穫個々のコロニーを、これらの主要なコロニーを2回洗浄する。 PBSの最終的な洗浄を吸引した後、各コロニーの周りに滅菌ゲルコーティングされたクローニングシリンダーを配置し、滅菌ピンセットを用いてプレートにしっかりと押します。シリンダー内の細胞が剥離し始めるまで3〜5分間それぞれクローニングシリンダーとインキュベートに暖かいTrypLE Expressの2〜3滴を追加します。円筒の中心に約250μlのEGM-2培地を追加し、gにピペッティングし、単一の細胞懸濁液をenerate。個々のマイクロ遠心チューブに個別にそれぞれクローニングシリンダーからの単一細胞懸濁液を転送します。
7. 残りのすべての細胞を収集し、それぞれのマイクロ遠心チューブに各シリンダーから洗浄を転送するために約250μlのEGM-2培地でシリンダー2〜3回以内の領域を洗浄する。 5分間卓上遠心機で高速（≤300 xg）で遠心します。
8. 上清を除去し、1.5ミリリットル新鮮なEGM-2培地で細胞ペレットを再懸濁する。 500μLラット尾コラーゲンI（50μg/ ml）を持つプレコート24ウェル組織培養プレートの1ウェルに各チューブからの細胞懸濁液（個々のコロニーからすべてのセルを含む）を転送します。
9. 一日おきに実行するメディアの変化と拡大のためのインキュベータ内に置きます。
10. 細胞がコンフルエントに80から90パーセントに近づいたときに、PBSで細胞を2回洗浄し、各ウェルに500μlのTrypLE Expressの培地を追加し使用済み培地を除去24ウェル組織培養プレートの。細胞は切り上げとデタッチし始めるまで3〜5分間インキュベーター内部にプレートを置きます。洗浄により細胞を収集し、15 mlのチューブにそれらを転送するために各ウェルにEGM-2 1mlを（10％FBSを定義して）を追加します。残りのすべての細胞を回収し、それぞれ15 mlのチューブに各ウェルから洗浄を転送するために1ミリリットルEGM-2培地でよく洗浄します。 5分間、300 xgで細胞を遠心分離します。
11. 培地を除去し、（10％FBS定義付き）1 mlの新鮮なEGM-2培地で細胞ペレットを再懸濁する。血球とトリパンブルー排除を使用してアリコートの生細胞数を取得します。
12. 細胞は再び継代培養の前にコンフルエントに80から90パーセントに近づくまで、メディアは一日おきに変更するとEGM-2培地でコラーゲンIは、プレコート組織培養表面に約5000細胞/ cm ^2を播種して細胞を展開します。

ECFCs の in vitroでの表現型特性の B.：内皮細胞表面抗原の発現クローン増殖能のD単セルアッセイ

1. 内皮細胞表面抗原の発現については、ECFCクローニングおよび拡張のために記載した方法を用いて細胞を回収しTrypLE Expressを使用してセルを取り外します。
2. FACS染色緩衝液（10×10 ⁶細胞/バッファを染色1ミリリットルFACS）で再懸濁細胞は、その後のFcRブロッキング試薬（20μL/ 10×10 ⁶細胞）を追加し、氷上で10分間穏やかにと場所を混ぜる。
3. 各内皮細胞表面抗原とアイソタイプコントロールのマイクロ遠心チューブにこの細胞懸濁液のアリコートを100μl。 1×10 ⁶細胞：内皮細胞抗原（CD31、CD144、CD146、およびCD105）または造血抗原（CD45、およびCD14）を認識し、光から保護氷上で30分間のままに蛍光標識したヒトモノクローナル抗体の適切な量の注意を追加します。各テストは必要ありません。著者らは、通常、2×10 ^4、分析を得るために0.5から 1×10 ⁵細胞/チューブを準備するdのイベント。また、 各試験に使用される抗体の量については、製造元の推奨に従ってください。いくつかの抗体は、最適な抗体濃度を決定するために滴定が必要な場合があります。作者が実行したことをすべての染色は、単一色の染色があります。
4. 氷上でのインキュベーションの30分後、5分間卓上遠心機で、高速で各管を遠心し、上清を除去し、FACS緩衝液で再懸濁細胞ペレット。
5. それぞれの抗原に対して肯定的または否定的染色細胞の割合を決定するためにフローサイトメーターでサンプルを分析する。 ECFCsは、対応するアイソタイプコントロールと比較してCD45とCD14のために一様にCD31、CD144、CD146との正、負染色。
6. クローン増殖能を調べるために、単一細胞アッセイのために、ECFCクローニングおよび拡張のために記述されていたものと同様の方法を用いて細胞を収集するTrypLE Expressを使用して初期の通路（2-3）細胞を切り離します。
7. これらの細胞に感染する強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するレンチウイルス¹⁶および蛍光メトリーによりEGFPを発現する細胞を収集します 。 注意：レンチでの作業は、バイオハザードと考えられ、すべてのバイオ安全注意事項の守らなければなりません。
8. 文化、それらは、ECFC拡大のためのセクションで培養ECFCで説明した。
9. ウェル当たり50μlのラット尾コラーゲンI型（濃度50μg/ ml）を追加し、一晩静置してコラーゲンIコート96ウェルプレートを準備します。 TrypLE Expressを使用してEGFP ⁺ ECFCsを収集し、最終濃度が約10 ⁶細胞/ mlのEGM-2培地に再懸濁します。
10. 一つのEGFP ⁺ ECFC当たり96 ​​ウェルプレートのをソートし、EGM-2をウェルあたり200μlに、最終的な音量を調整するには20セル/秒の低流量でFACSヴァンテージ（ベクトン·ディクソン）、または他の同等のソーターを使用しています。各ウェルに1つだけのセルを受信していることを確認し倒立蛍光顕微鏡を使用しています。Alternativイーリーは、単一の細胞は、FSCとSSCに基づいており、コロニーを染色SYTOX核の色素が細胞スコアと定量化に使用することができますソートすることができます。
11. 5日目と10日目に行われつのメディアの変更（200μlのEGM-2は、マルチチャンネルピペッターを使用）で2週間の期間にわたって、プレートをインキュベートします。培養14日目に、30分間4％パラホルムアルデヒド100μlで細胞を固定する前に、100μlのPBSで各ウェルを洗浄します。 EGFPを発現していないECFCsについては、4℃で一晩SYTOX試薬、緑色蛍光核染料は、以下のパラホルムアルデヒド固定およびインキュベーションを追加します。
12. 14日間培養し、単一細胞から展開内皮細胞数を定量化するために、各ウェルを調べるために蛍光顕微鏡を使用しています。正のように2つ以上の内皮細胞（増殖用）定量分析、スコアの井戸のために、蛍光顕微鏡で視覚的にカウントして合計内皮細胞数のために、さらにそれらを調べます。
13. tを表示するには、2から50まで、51から2000まで、2001年以上と考えられている：彼は、内皮細胞の数とデータ、井戸を得た内皮細胞クラスター、低増殖能（LPP）ECFCs、高い増殖能（HPP） - それぞれECFCs。 ECFCsは14日のための単一細胞レベルで培養すると血管内皮クラスター、LPPS、とHPPSに上昇を与えることによって、クローン増殖能の完全な階層構造を示す^7。

in vivoでの血管形成アッセイにおいて脈管形成のためにECFCの可能性を検討する：ECFCs の in vivo機能解析で C.

1. 以下のゲル材料のそれぞれの総体積（ml）を計算することによってセル化ゲルのインプラントを準備します（カッコ内は最終濃度で）1mlのゲル（2以降のインプラントを生成するように二分されます）にキャストする必要がありました。FBS（10 ％）、EBM-2 10:1（1ミリリットルに最終的な音量を調節）、重炭酸ナトリウム（1.5 mg / ml）を、水酸化ナトリウム（pHを7.4に調整）、HEPES（25mM）の、fibronectiN（100μg/ ml）を、コラーゲンI（1.5 mg / ml）を。
2. ゲル材料の計算後、ECFCクローニングと拡大のために記載されたと同様の方法を用いて細胞を収集するTrypLE Expressを使用してセルを取り外します。血球とトリパンブルーを用いたアリコートの生細胞数を取得します。 50ミリリットル円錐管とペレット515×gで、室温で遠心分離によって細胞内に240万生細胞を転送します。同時に、氷冷50 mlコニカルチューブ（彼らが表示されているのと同じ順序で）計算されたHEPESのボリューム、重炭酸ナトリウム、EBM-2 10:1、FBS、フィブロネクチン、コラーゲンを添加することによりゲルマトリックス溶液を調製。氷の上で解決策を維持しながら、徹底的に混合し、NaOHでpHを7.4に調整します。
3. 遠心分離後の細胞からの上清を捨て、360μlの暖かいEGM-2でペレットを再懸濁し、それにpHのゲルのインプラント最終1 mlを作り、ゲルマトリックス溶液の840μlを調整追加します。まで徐々にゲルマトリックス溶液に細胞を混ぜる細胞が完全にゲル溶液に懸濁させる。
4. 12ウェル組織培養プレート20〜30分間インキュベートしゲルが重合されるまでの、1つのウェルに、この1ミリリットルセル化ゲル懸濁液を移す。静かに2ミリリットル暖かいEGM-2でゲルをカバーし、一晩インキュベートする。
5. すぐに注入する前に、虹彩のはさみを使用して、2つの等しい部分に一晩インキュベートしたゲルを二分し、よくEGM-2培地を含む同じ培養液にゲル片を返します。
6. イソフルラン麻酔を投与することにより、落ち着いた動物（5-6週齢のNOD / SCIDマウス）に動物の手術設備を使用しています。腹部の下の部分を剃ると徹底的にアルコールパッドやbetadineや他の防腐剤と手術部位を清掃してください。その後IACUCと制度ガイドラインに従ってドレープで領域を分離します。
7. 皮膚や腹部の筋肉の間の皮下スペースを公開し、腹部の下腹部に約5 mmの切開を作るために滅菌シャープアイリスはさみを使用して、。上腹部の象限に優れたリーディング15〜20ミリメートル幅のポケットを作成するには、腹部の筋肉から真皮層を介して平滑末端郭清を行います。同じマウスの腹部の別の側面で同様のオープンポケットを作成するために同様の手順を繰り返します。
8. 切開にちょうど尾真皮層を持ち上げることによって腹部ポケットの別の側に半分の腹部ポケットの片側にゲル片とゲルの別の半分の部分を挿入します。
9. ゲルの挿入後、2〜3針はカッティング針に5から0ポリプロピレン縫合糸を使用して、各切開を閉じます。適切にケージのカードにラベルを付けたり、制度やプロトコルの要件に従って、外科手術後のモニタリングおよび鎮痛を実行し、これらの移植ゲル中の細胞は14日のde novo血管を生成することができます。
10. 最後に、ゲルインプラントの収穫は通​​常、マウスを安楽死後14日移植後に実行されます。
11. 綿棒、アルコールパッドを腹部とオリジナルの切開線に尾腹部皮膚を切った。慎重に、ゲルの推定位置に皮膚の尾のフラップを切り出すことによりインプラントを解剖する。その後、ゲルの周りで円周方向に亜鉛固定の場所を切断することによって消費税インプラント（BD Biosciences社は、最適な結果を得るために、製造元の推奨に従ってください）​​、それらを室温で1-2時間のために修正することができます。
12. 標準的な組織化学的プロトコルを使用してパラフィン包埋したゲルを調製し、ゲル内の血管を可視化するために、ヘマトキシリン​​およびエオシン、抗ヒトCD31または抗マウスCD31で染色を行うために、スライドガラス上に5μmの切片を準備します。 ECFCsは、ヒトの血管を生成するためにde novoの脈管形成を受ける セル化ゲルのインプラントで14日^4,8,11のために免疫不全マウスに挿入されます。

D.描写結果

我々は主要なコロニー形態のうち、成長を観察しているこのECFC導出手法を用いて5日目（ 図1）早けれation。アウト成長ECF​​Cのコロニーは、典型的な石畳の外観を示し、クローニングによるコロニーピックアップした後、長期的拡大に> 40集団倍加を生じさせた。拡張されたコロニーは、内皮の抗原を発現するが、（ 図2）造血抗原を発現していませんでした。重要なのは、単一細胞レベル（ 図3）でクローン増殖能の完全な階層を表示します。また、ECFCsは、免疫不全マウス^{4、6、8、11（} 図4）に注入するとき、ホスト赤血球で灌流されているヒトの血管を形成した。

図1。臍帯血細胞のフィコール- Pague密度勾配分離の間培養された多国籍企業。多国籍フォームバフィーコート層からの内皮細胞コロニー形成細胞（ECFCs）の臍帯血と伸長から単核細胞の単離（国籍）。 5から14日以内にECFCコロニーの伸長でラット尾コラーゲンIでコートしたプレートの結果についての文化多国籍企業へのバフィーコート層の分離。伸長ECFCコロニー（矢頭で示される）表示された石畳の形態^7。

図2。内皮細胞および造血細胞表面抗原の発現をin vitroでの代表的な表現型の評価。イムノ臍帯血由来ECFCsのはECFCsは、内皮抗原CD31、CD34、CD144、CD146、FLT-1、Flk-1を、FLT-4、NRP2を発現しますが、ことを明らかにした造血抗原CD45、CD14、CD11bを、cKit、CXCR4またはAC133 ^7、8を発現^しなかった。

図3。 CB派生ECFCsのクローンと増殖能のin vitro定量の代表 。 （A）臍帯血由来ECFCsは2から50セルのクラスタからのアップ> 2001年の植民地に至るまで植民地の階層構造を持つクローンの増殖能を表示します。 （B）コロニー（コロニーはSYTOX、より質の高い写真を撮るために、緑色の蛍光核染料で染色）の階層構造の顕微鏡写真は、後に得られる臍帯血由来ECFCsは14日間の単一細胞レベルで培養した。スケールバーは^{100μm7、8を}表し^ています 。

図4。臍帯血由来ECFCs の in vivo機能解析の代表 。 A）臍帯血由来ECFC含むセル化ゲルのインプラントのH＆E染色では、移植14日後、コラーゲン、フィブロネクチンゲルの形成（ホスト赤血球で満たされた）微小血管を示した。 B）抗ヒトCD31染色（茶色の染色）はさらに、これらの血管の人間の起源を確認します。

推定される内皮前駆細胞の表現型および機能解析は、クローンと連続して再メッキ文化の中で可能である善意の ECFCsを識別し、in vivoでの耐久性と機能的な植込み型血管を生じさせることが重要です。ヒト臍帯血はECFCsと老化や病気の¹⁰のこれらの循環細胞の減少の濃度で濃縮されています。最近の研究では、ECFCは、血管損傷、心筋梗塞、網膜症^{17から19まで}の状況では、血管の修復や再生に重要な役割を果たすことを示唆している。

ここでは、拡張、およびin vitroで同様にヒト臍帯CBからECFCs の in vivo特性評価では、クローニング、導出するためのシンプルかつ効率的な方法論を説明してきました。これらのアプローチは、研究者がクローン増殖能を持ってCBからの善意のEPCを識別し、分離するために有効にして、