MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)

1. Prostata Prøvetagning

1. Saml prostata prøverne på tidspunktet for prostatektomi. Prøven er orienteret ved hjælp af anatomiske vartegn. Den prostata og sædblærer er malet som følger: højre side grøn, venstre side blå.
2. En tilfældig tværgående midtersektion prostata er taget vinkelret på den rektale overflade, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C ^9.
3. Opsparede skiver af enhederne fotokopiering, orienteret (anterior, posterior, højre og venstre), quadrisected. Sektioner skåret med kryostaten.
4. Sektionerne farves med H & E og gennemgået af en patolog at bestemme og afgrænse tumor versus normale områder på de farvede objektglas og et tilsvarende billede. De markerede områder anvendes som en guide at indikere områder, hvorfra at udtrække tumorvæv fra hvilken RNA vil blive udvundet i de efterfølgende trin.

2. Isolering af total RNA, herunder miRNA, fra prøver

1. Sted frosne prostata prøver på tøris og under henvisning til det afgrænsede fotokopi skære en lille del af prostatatumor (mellem 50 og 100 mg).
2. Homogenisere prostata tumorvævet i 1 ml af TRIzol reagens. Mængderne i de følgende trin er baseret på anvendelse af 1 ml TRIzol reagens.

Bemærk: Her har vi anvendt TRIzol Reagens til ekstraktion RNA, men andre kits, som isolerer de små RNA-holdige totalt RNA kan også anvendes.

3. Inkuber de homogeniserede prøver i 5 minutter ved stuetemperatur.
4. Tilsæt 0,2 ml chloroform til prøverne og rystes kraftigt i 15 sekunder. Inkuber prøverne i 3 minutter ved stuetemperatur, centrifugeres ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
5. Overføre farveløs øvre vandige fase til friske rør, og der tilsættes 0,5 ml isopropylalkohol.Inkuber prøverne i 10 minutter ved stuetemperatur, centrifugeres ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
6. Forsigtigt Aspirér supernatanten uden at forstyrre pellet indeholder RNA. Vask RNA-pellet med 1 ml 75% ethanol. Vortex prøven og re-sediment ved centrifugering i 5 minutter ved 7500 xg ved 4 ° C.
7. Omhyggeligt aspirere supernatanten og tørre det RNA-pellet i 5-10 minutter, idet det sikres at RNA-pellet er ikke helt tørt. Genopløses i nuklease-frit vand hensigtsmæssigt pellet størrelse. Måling af koncentrationen af ​​RNA ved hjælp af NanoDrop 1000 spektrofotometer (foranstaltning absorbans ved 260 nm og 280 nm).
8. Kontroller kvaliteten og integriteten af ​​de RNA-prøver ved hjælp af Agilent Bioanalyzer.

3. Revers transkription af RNA

1. Revers transkription af RNA blev udført ved anvendelse miScript Reverse Transcription Kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen). Dette sæt indeholder enrevers transkriptase og en poly (A)-polymerase. Den miScript RT puffer omfatter ^{Mg2 +,} dNTP'er, oligo-dT-primere og tilfældige primere.
2. Anvendes mellem 10 pg og 1 ug af RNA til at syntetisere cDNA. Hvis der anvendes mere end 1 ug RNA, opskalere reaktionen lineært til det ønskede volumen.
3. Fremstille en master-blanding, der indeholder 5X miScript RT puffer (4 gl), miScript Revers transkription Mix (1 ul), og RNase-frit vand for at bringe reaktioner slutvolumen på 20 ul. Også omfatte skabelon RNA (op til 1 pg) i master mix.
4. Inkuber prøverne i 60 minutter ved 37 ° C efterfulgt umiddelbart af en inkubering i 5 minutter ved 95 ° C. Dette trin kan udføres i en PCR maskine, varmeblok eller vandbad. Thermocyclers er den bedst egnede og mest præcise metode. Opbevar cDNA på is i kort sigt, og -20 ° C til langtidsopbevaring.

4. Generering af en standardkurve

1. Forud for experiment med target miRNA er en standardkurve genereret under anvendelse af cDNA'er af kendte koncentrationer af deres grænseovergange (cP) (figur 2).
2. Fremstilling af en række fortyndinger af to-fold, 10-fold, 50-fold, 250-fold, og 1250-fold det oprindelige cDNA i en prøve, der vides at have en væsentlig ekspression af din genet af interesse.
3. Kør PCR, som angivet i afsnit 5 "Real-time PCR til detektion af miRNA", med den ændring, at cDNA er i seriefortyndinger ikke et statisk 40x fortynding.
4. Udføre analyse ved hjælp RelQuant software (Roche) til at generere din standardkurve.

Bemærk: en ny standardkurve skal genereres for hvert gen af ​​interesse.

5. Real-time PCR til påvisning af miRNA

1. Real time PCR for miRNA blev udført under anvendelse miScript SYBR Green PCR Kit og miScript Primer Assay ifølge producentens instruktioner (Qiagen). Forbered en master blanding som indeholder2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, og RNase-frit vand. Forbered en master-blanding for en 20 gl volumen reaktion.
2. Primeren Assay er specifikt for miRNA af interesse. At rekonstituere 10x miScript Primer Assay hætteglasset centrifugeres kort, og der tilsættes 550 pi TE-buffer, pH 8,0. Vortex hætteglasset kort at blande, alikvote primere til mindre mængder, og opbevares ved -20 ° C. To primere er påkrævet. Primere for mål-genet og reference-genet RNU6B er usedas reference-genet.
3. Fortyndes cDNA 40x og opbevares ekstra alikvoter ved -20 ° C.
4. cDNA tjener som template for PCR. Anvend 2 pi 40x fortyndet cDNA og dispensere til 20 ul lys cyklusmekanismens kapillærer (Roche).
5. Tilsæt 18 ul af master mix til hver enkelt kapillær, og centrifuger ved hjælp af en kapillær adapter.
6. Placer kapillærer i en kapillær-baseret Real-Time variator, såsom LightCycler 3.5 Real-Time PCR System med en 32-kapillær karrusel format.
7. Kør PCR cykling som følger:
   At aktivere HotStarTaq polymerase som er i 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, præ-inkuberes ved 95 ° C i 15 minutter.
   Efterfulgt af 50 cykler af:
   Denaturering, 15 s, 94 ° C;
   Annealing, 30 s, 55 ° C;
   Udvidelse, 30 s, 70 ° C.
8. Vælg en prøve for at være kalibratoren, og sæt dens normaliseret målbeløbet til 1. Sammenligne den relative ekspression af miRNA i alle andre prøver til kalibratoren.

Bemærk: Inden for en undersøgelse, bør den samme kalibrering prøven bruges til at opretholde ensartede resultater.

6. Analyse af data

1. Amplifikation kurver for PCR reaktioner afbildet grafisk og numerisk ved Molecular Biochemicals LightCycler softwareversion 3,5 (Roche). Kvantificer reaktioner i "Kvantificering" fanen, ennd eksportere data til en tekstfil.
2. Importer data til RelQuant analyse software (Roche) til at generere kvantificering resultater. Importer separate filer til målgen henvisning gen, og standardkurveprøver data.
3. Angiv placering af kalibrator for både mål og reference gen. Også indeholde positioner prøverne. Data er udtrykt som mål at referenceandelen af ​​forskellige prøver, divideret med det mål at henvisningen forholdet mellem kalibrator. Standardkurven tidligere blev genereret til et bestemt miRNA og rengøring genet anvendes som en referencestandard for at ekstrapolere kvantitative data for miRNA mål ukendte koncentrationer.
4. Tre gentagelser af prøver analyseres som en gruppe og middelkoncentrationer og standardafvigelser for tre eksemplarer beregnes. Hvis en af ​​de tre eksemplarer er i modstrid med resten af ​​sættet, vil blive udelukket af programmet.

7. Repræsentative resultater

Figur 1. Forskellige trin i miScript revers transkription og Real-time PCR.

Figur 2. En standardkurve genereret under anvendelse af en række fortyndinger af to-fold, 10-fold, 50-fold, 250-fold, og 1250-fold den oprindelige cDNA prøve.

Figur 3. Roche Molecular Biochemicals LightCycler Software viser hele oplysninger om eksperimentet grafisk og tekst. Kvantitativ reel-tid-PCR amplifikation plots udviser øget fluorescens i forskellige prøver.

Figur 4. Data blev kvantificeret under anvendelse RelQuant LightCycler analyse software. Normalt tre gentagelser af prøver analyseres som en gruppe og prøver, der producerer klart inkonsistente resultater er udelukket, og middelkoncentrationer og standardafvigelser i tre eksemplarer beregnes.

Afvigende udtryk nogle miRNA har konsekvent fundet i prostatatumorer i forhold til normalt væv ^10, og nogle af disse miRNA blevet nævnt som potentielle hidtil ukendte terapeutiske midler mod prostatacancer ^11. Derfor de afvigende ekspressionsniveauerne af miRNA kan være nyttige diagnostiske og / eller prognostisk biomarkører. Real-Time qPCR metode præsenteret her giver en analyse for nøjagtig kvantificering af miRNA niveauer i prostata tumorvæv. Den miScript PCR anvendt Systemet kan detektere en enkelt nucleotid-forskelle mellem modne miRNA. De miScript miRNA qPCR assays er imidlertid ikke beregnet til påvisning af stem-loop precursor miRNA, som forskellige miScript Precursor Assays er tilgængelige.

Pålideligheden af ​​denne teknik afhænger af kvaliteten af ​​input RNA, således koncentration, integritet og renhed RNA skal testes forud for Real-Time PCR. Desuden ribonucleaser meget stable og let nedbrydes RNA, og dermed ekstra forsigtighed bør tages i håndtering af RNA. Alle reaktioner skal sættes op på isen for at minimere RNA nedbrydning. RNase-hæmmere kan også tilsættes til reaktionsblandingen forud for revers transkription. Handsker skal skiftes hyppigt, mens sterilt og engangs plastvarer skal anvendes under hele proceduren.

Hvis der ikke er PCR-produkt, eller forstærkning kurven opdages sent i Real-Time PCR, kan du prøve at øge antallet af PCR-cyklusser, og sørg for, at cykling programmet omfatter aktivering af HotStarTaq DNA-polymerase i 15 minutter ved 95 ° C. Lav amplifikation kan også være på grund af utilstrækkelig start cDNA-template, således at forsøge at øge mængden af ​​cDNA. Sen amplifikation kan også repræsentere en falsk positiv.