MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)

1. Prostata Prøvetaking

1. Samle prostata prøvene på tidspunktet for prostatektomi. Prøven er orientert med anatomiske landemerker. Prostata og sædblærene er malt slik: Høyre side grønn, venstre side blå.
2. Et tilfeldig tverrgående midsection av prostata er tatt vinkelrett mot endetarms overflaten, frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C ^9.
3. Banked skiver av prøver er kopierte, orientert (anterior, posterior, høyre og venstre), quadrisected. Seksjoner er kuttet med Cryostat.
4. Seksjonene er farget med H & E og gjennomgått av en patolog for å bestemme og avgrense tumor versus normalt områder på de fargede lysbilder og en tilsvarende bilde. De merkede områdene brukes som en veiledning for å indikere områder hvor å pakke ut svulstvev som RNA skal utvinnes i de etterfølgende trinn.

2. Isolere Totalt RNA, inkludert miRNA, fra Samples

1. Plasser frosne prostata prøver på tørr is og henvise til avgrenset fotokopi, klippe ut en liten del av prostata tumor (mellom 50 til 100 mg).
2. Homogenisere prostata svulstvev i 1 mL TRIzol Reagens. Mengdene i følgende trinn er basert på bruk av 1 mL TRIzol Reagens.

Merk: Her har vi brukt TRIzol Reagens for utpakking RNA, men andre byggesett som isolerer små RNA-holdige total RNA kan også brukes.

3. Inkuber homogeniserte prøvene i 5 minutter ved romtemperatur.
4. Legg 0,2 ml kloroform til prøvene og rist kraftig i 15 sekunder. Inkuber prøver i 3 minutter ved romtemperatur, deretter sentrifuger ved 12 000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
5. Overfør fargeløs øvre vannfasen til ferske rør, og tilsett 0,5 mL isopropylalkohol.Inkuber prøvene i 10 minutter ved romtemperatur, deretter sentrifuger ved 12 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
6. Nøye aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten inneholder RNA. Vask RNA pellet med 1 ml 75% etanol. Virvelen prøven og re-sediment ved sentrifugering i 5 minutter ved 7500 xg ved 4 ° C.
7. Nøye aspirer supernatanten og tørr RNA pellet i 5-10 minutter, noe som gjør at RNA pellet er ikke helt tørt. Re-oppløses i nukleasefritt vann hensiktsmessig å pellet størrelse. Måle konsentrasjonen av RNA bruker NanoDrop 1000 spektrofotometer (måle absorbansen ved 260 nm og 280 nm).
8. Sjekk kvaliteten og integriteten av RNA prøver ved hjelp Agilent Bioanalyzer.

3. Revers transkripsjon av RNA

1. Revers transkripsjon av RNA ble utført ved hjelp miScript Reverse Transcription Kit i henhold til produsentens anvisninger (Qiagen). Dette settet inneholder enreverstranskriptase og en poly (A) polymerase. Den miScript RT Buffer inkluderer Mg ^{2 +,} dNTPs, oligo-dT primere, og tilfeldige primere.
2. Bruk mellom 10 pg og en mikrogram RNA å syntetisere cDNA. Hvis du bruker mer enn ett mikrogram av RNA, skalere opp reaksjonen lineært til riktig volum.
3. Forbered en mester miks som inneholder 5X miScript RT buffer (4 mL), miScript Reverse Transcription Mix (1 mL), og RNase-fritt vann for å få reaksjoner på siste bind av 20 mL. Også mal RNA (opp til 1 mikrogram) i master mix.
4. Inkuber prøvene i 60 minutter ved 37 ° C etterfølges umiddelbart av en inkubasjon i 5 minutter ved 95 ° C. Dette trinnet kan utføres i en PCR maskin, oppvarming blokk, eller vannbad. Thermocyclers er den mest passende og nøyaktig metode. Oppbevar cDNA på is kort sikt, og -20 ° C for langtidslagring.

4. Generere en standardkurve

1. Før kompetanseiment med målet miRNAs, er en standard kurve genereres ved hjelp cDNAs av kjente konsentrasjoner mot sine kryssende punkter (CP) (figur 2).
2. Utarbeide en rekke fortynninger av to-fold, 10 ganger, 50-fold, 250-fold, og 1250 ganger den opprinnelige cDNA av en prøve som er kjent for å ha en betydelig uttrykk av genet av interesse.
3. Kjør PCR som nevnt i § 5 "Real-time PCR for påvisning av miRNA", med den modifikasjon som cDNA er i seriefortynning ikke en statisk 40x fortynning.
4. Utfør analyse ved hjelp RelQuant programvare (Roche) for å generere standard kurve.

Merk: en ny standard kurve må genereres for hvert gen av interesse.

5. Real-time PCR for påvisning av miRNA

1. Real Time PCR for miRNAs ble utført ved hjelp miScript SYBR Grønn PCR Kit og miScript Primer Assay henhold til produsentens anvisninger (Qiagen). Forbered en master mix inneholder2x QuantiTect SYBR Grønn PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, og RNase-fritt vann. Forbered en mester blanding for en 20 mL volum reaksjon.
2. Den Primer analysen er spesifikk for miRNA av interesse. Å gjeninnføre 10x miScript Primer analyse, sentrifuger hetteglasset kort, og legg 550 mL TE buffer, 8,0 pH. Vortex hetteglasset kort til å blande, alikvoter primere til mindre volumer, og oppbevar ved -20 ° C. To primere kreves:. Primere for målet genet og referansen genet RNU6B er usedas referansen genet.
3. Fortynne cDNA 40x og butikk ekstra alikvoter ved -20 ° C.
4. cDNA fungerer som mal for PCR. Bruk 2 mL av 40x fortynnet cDNA og dispensere til 20 mL lyset cycler kapillærer (Roche).
5. Legg 18 mL av master mix til hver kapillært, og sentrifuger ved hjelp av en kapillær adapter.
6. Plasser kapillærer i en kapillær basert Real-Time cycler, slik som LightCycler tre.5 Real-Time PCR System med en 32-kapillær karusell format.
7. Kjør PCR sykkel program som følger:
   For å aktivere HotStarTaq Polymerase som er i 2x QuantiTect SYBR Grønn PCR Master Mix, pre-Inkuber ved 95 ° C i 15 minutter.
   Etterfulgt av 50 sykluser med:
   Denaturering, 15 s, 94 ° C;
   Annealing, 30 s, 55 ° C;
   Extension, 30 s, 70 ° C.
8. Velg en prøve å være kalibratoren, og sette dens normalisert mål utgjør en. Sammenlign relative uttrykk for miRNA i alle de andre prøvene til kalibratoren.

Merk: Innen en studie, bør den samme kalibrering prøven brukes til å opprettholde konsistens av resultater.

6. Analysere data

1. Forsterkningsbehov kurver for PCR reaksjoner er avbildet grafisk og numerisk ved Molecular Biochemicals LightCycler Software versjon 3.5 (Roche). Kvantifisere reaksjoner i "Kvantifisering"-kategorien, ennd eksportere dataene til en tekstfil.
2. Importere data til RelQuant analyse programvare (Roche) for å generere kvantifisering resultater. Importer separate filer for mål gen, referanse-genet, og standardkurve data.
3. Angi plasseringen av kalibrator for både målet og referanse genet. Også angi posisjoner av prøvene. Data er uttrykt som mål å referere forholdet forskjellige prøver dividert med målet til referanse forholdet mellom kalibrator. Standardkurven tidligere generert av en spesiell miRNA og husholdningsgenet brukes som en referanse standard for ekstrapolere kvantitative data for miRNA mål av ukjente konsentrasjoner.
4. Tre replikater av prøvene er analysert som en gruppe, og gjennomsnittlig konsentrasjon og standardavvik i tre eksemplarer beregnes. Hvis en av triplicates er uforenlig med resten av settet, vil det bli ekskludert av programmet.

7. Representative Resultater

Figur 1. Ulike trinnene i miScript revers-transkripsjon og Real-time PCR.

Figur 2. En standard kurve er generert ved hjelp av en rekke fortynninger av to-fold, 10 ganger, 50-fold, 250-fold, og 1250 ganger den opprinnelige cDNA prøven.

Figur 3. Roche Molecular Biochemicals LightCycler Software viser hele opplysninger av eksperimentet grafisk og ved tekst. Kvantitative Real-time PCR forsterkningsbehov tomter viser økt i fluorescens fra ulike prøver.

Figur 4. Data ble kvantifisert ved hjelp RelQuant LightCycler analyse programvare. Vanligvis replikater tre av prøvene er analysert som en gruppe og prøver som produserer tydelig inkonsistente resultater ekskludert og betyr konsentrasjon og standardavvik i tre eksemplarer beregnes.

Avvikende uttrykk for noen miRNAs har vært konsekvent funnet i prostatakreft sammenlignet med normalt vev ^10, og noen av disse miRNAs har blitt navngitt som mulige nye terapeutiske midler mot prostatakreft ^11. Derav avvikende uttrykk nivåer av miRNAs kan være nyttige diagnostiske og / eller prognostisk biomarkører. The Real-Time qPCR metodikk presentert her gir en analyse for nøyaktig kvantifisering av miRNA nivåer i prostata tumorvev. Det miScript PCR systemet som brukes kan oppdage single nukleotid forskjeller mellom modne miRNAs. De miScript miRNA qPCR Analyser imidlertid ikke er ment for påvisning av stamceller løkke forløperen miRNAs, hvor ulike miScript forløperen analysene er tilgjengelig.

Påliteligheten av denne teknikken avhenger av kvaliteten på input RNA, derfor konsentrasjon, integritet, og renhet av RNA bør testes før Real-Time PCR. Videre ribonucleases er veldig stable og lett brytes ned RNA, og dermed ekstra forsiktighet bør utvises ved håndtering av RNA. Alle reaksjoner bør settes opp på isen for å minimere RNA degradering. RNase hemmere kan også legges til reaksjonen før revers transkripsjon. Hansker bør endres ofte, mens sterile og disponibel plasticware må brukes gjennom hele prosedyren.

Hvis det ikke er PCR produktet eller amplifikasjonskurve oppdages sent i Real-Time PCR, prøve å øke antall PCR-sykluser, og sørge for at sykkel program inkluderer aktivering av HotStarTaq DNA polymerase i 15 minutter ved 95 ° C. Lav forsterkning kan også skyldes utilstrekkelig start cDNA mal, derfor prøve å øke mengden av cDNA. Late forsterkning kan også representere en falsk positiv.