マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

1。肺洗浄を使用してマウスから肺胞マクロファージを（AMɸ）収穫

1. このような実験着と使い捨て手袋、適切な眼の保護、適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してください。
2. 収穫の開始前に完全なAMɸ（cAMɸ）培地を準備します。 Dulbelccoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の222.25 mLのペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）溶液に、β-メルカプトエタノール（2 - メルカプトエタノール）を250μL、熱不活化ウシ胎児血清（FBS）を25 mLの2.5 mLを加える。 cAMɸ媒体が真空下で孔径0.2μmボトルトップフィルタを使用してフィルター滅菌する。
3. 安楽死のチャンバー内のCO ₂窒息により健康なマウスを安楽死させる。 C57BL / 6マウス（6-8週齢）は、このプロジェクトの目的のために使用されていますが、この肺胞洗浄法は、マウスのいずれかの株に行うことができます。圧縮ガスシリンダーを使用して、チャンネルにマウスを置く前に1分間チャンバー内にガスを流すチャンバが完全にCO ₂が充電されることを保証するためにオレンジ色に点灯します。マウスを安楽死させるために少なくとも1分間チャンバー内にマウスを置きます。さらに、1.4で説明したように、マウスの死亡を確認するために物理的な方法として、心臓穿刺を介して各マウスを放血させる。
4. その背中の上にマウスを置く（背側）、70％エタノールでスプレー、胸骨を見つけて、腹部から30度の角度で、胸腔内に約50mm 23ゲージの針を（1 mLシリンジに接続されている）を挿入する。針の適切な配置と、それはマウスの大きさに応じて血液中の0.4から1 mLの間に収集することが可能でなければなりません。バイタルサインの停止のために動物を調べます。
5. 実験台の上に置き、マウス、その腹部（腹側）に横たわっているようにします。作業環境を滅菌するために70％エタノールでスプレーマウス。約半分マウスの背筋皮をつまむ。 70％エタノールで滅菌された解剖はさみを使用して、皮膚を​​通して小さな切開を行います。</ LI>
6. 切開の両側に皮をつかむと、マウスの頭蓋 - 尾軸に沿って反対方向に肌を引き出します。正しく完了したら、皮膚は、基礎となる枝肉から削除されます。
7. マウスの首は現在公開され、筋肉や腺を表示する必要があります。慎重にその組織を切り取って、それによってマウスの喉頭、気管、食道を露出し、鉗子を使用して、マウスの前方に向かって引き出します。頸静脈または頸動脈を切断しないようにしてください。
8. 気管は、現在表示され、その周りの軟骨環を有する組織として識別できます。繊細な鉗子で気管を保持し、ゆっくりと持ち上げると背側に位置して食道から気管を分離します。
9. いずれかが気管が喉頭に後方を保持している場所の前方に小さな切開を行います。切開は約45°度の角度でなされるべきである。これに後退からそれを防ぐことができますとしても、完全に、気管を横断するしないでください体腔。
10. 気管の内腔にカテーテルを挿入するための準備中に、滅菌PBSでトムキャットカテーテルを装着し1ccのシリンジを記入してください。鉗子を用いて気管を保持し、手でコントロールを向上させ、穏やかに気管切開部位に挿入し先端に近いカテーテルを保持します。穏やかに20mm程度気管にカテーテルを挿入します。もう一方の手を解放し、カテーテル管の周囲にある気管を掴む。
11. カテーテルを装着し1 mLのシリンジを用いて、穏やかに肺に室温、滅菌したPBSの0.75 mLを注入し、PBSで穏やかに戻ってシリンジに吸引します。外部からの胸をマッサージしながら、このプロセスを3回繰り返します。カテーテルからシリンジを取り外し、15 mLの遠心チューブに洗浄液を分注する。新鮮なPBSの0.75 mLの注射器を充填し、カテーテルにシリンジを再接続した後、各マウスについて、手順1.9倍1.10を繰り返します。流体の回復はVO未満を取得し、部分的かもしれませんLUMEが注入された。複数のマウス由来の細胞を収集する場合、すべての肺lavagesが実行されるまで、氷の上で採取した細胞で15 mLのチューブを配置します。

2。肺洗浄AMɸハーベストの処理

1. 4時10分℃、250×gで肺胞洗浄液を遠心
2. バイオセーフティキャビネット内の適切な廃棄容器に無菌、上清をデカントを使用します。静かに試験管ラックの上部に遠心管を掻き集めることによって、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を再懸濁するcAMɸ培地1 mLを加える。
3. コー​​ルターカウンターバイアルにISOTON II希釈液の10 mLに細胞を20μLをピペッティングによりコールター粒子カウンタZ1を用いて細胞を列挙します。 、バイアルにZAP-oglobin II溶解試薬の3から4滴を加え穏やかに反転し3〜4倍して、細胞濃度を得るためにカウンターの上にサンプルバイアルをロードします。表示するには、2×10 ⁴の希釈率でカウンタをプログラムしてくださいmL当たりの細胞数として細胞濃度。
4. cAMɸ培地を用いmL当たり2.5×10 ⁵細胞を希釈する。
5. 6ウェル組織培養皿の各ウェルに2.5×10 ⁵細胞/ mL 2 mLを分注します。
6. 細胞がウェルの底に付着できるようにするには、AMɸために6時間、5％CO ₂雰囲気下37℃の加湿インキュベーター内にインキュベートし、培養皿を豊かにする。付着細胞を破壊しないように静かに上清を吸引除去する。
7. 非接着細胞および残骸を削除するには、滅菌PBS（カルシウムとマグネシウムは無料）を使用して、ウェルを洗浄します。各ウェルにcAMɸ培地2mlを追加します。
8. 覚せい剤を添加する前に、5％CO ₂雰囲気下37℃の加湿インキュベーター内に一晩細胞をインキュベートします。この濃縮工程の後、細胞の約87％はマクロファージマーカーCD11bをとF4/80（ 図2c）に対して陽性である。

3。 Polyanhydridの追加電子ナノ粒子およびコントロールトリートメント

1. 無水物の抗溶媒のナノカプセル化^15を介してナノ粒子を作製する。このプロセスでは、ポリマーは塩化メチレンに溶解し、（4°C 25 mg / mLの濃度で）、ペンタン（比1:200塩化メチレン-20°C：ペンタン）で沈殿させた。
2. 滅菌は、正確にマイクログラムの量を測定することができますバランスに紙の重さを使用して無水物ナノ粒子を秤量する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに粒子を追加します。
3. cAMɸ冷たい氷の中にナノ粒子を再懸濁します。計算は、媒体のそれ以上の0.3 mLをナノ粒子の所望の濃度を得るために各ウェルに添加されるように作られています。ナノ粒子がウエルの培養に追加されるまで氷上で再懸濁粒子を保持します。
4. 前のAMɸ文化にナノ粒子を追加する、マイクロチップのベンチトップ超音波を用いた粒子を超音波洗浄します。 70％エタノールとwipinを噴霧してマイクロチップを殺菌超音波処理の前に滅菌キムワイプでg。チューブを氷上に保ちながら、30から45の10〜20ジュールで超音波洗浄します。肉眼的にナノ粒子懸濁液を観察します。粒子が十分に分散されていない場合は、懸濁液は、ナノ粒子が30から45秒のために再度超音波処理する前に、ポリマーのガラス転移温度以下であることを確認するには、1〜2分間氷上で設定することができます。この超音波処理ステップの目的は、十分に50:50 CPTEGとして、ナノ粒子を分散させることです。水性の環境にさらされた場合CPHナノ粒子が凝集してしまう傾向がある。しかし、ナノ粒子のいくつかの小さな凝集体は依然として懸濁液中に残ることがあります。
5. ナノ粒子懸濁液は、（十分に分散する）氷上で保存すべきであり、時期尚早の表面侵食や凝集を防ぐために直ちに使用することができます。
6. インキュベーターからAMɸおよびバイオセーフティキャビネット内の場所を含む培養皿を取り外します。メディ量から約45度の角度とピペットで傾斜プレートええと、その（それは0.3 mLを超えないようにしてください）​​ナノ粒子懸濁液に添加されます。培地を除去したときに接着細胞を乱すことがありません。
7. 渦前に、適切なウェルにそれを追加する簡単に無水物ナノ粒子懸濁液。特定のウェル（S）にナノ粒子懸濁液の量（以上0.3 mL）をピペットでいますが、混在させるピペッティングしていません。このアクションは、井戸からAMɸ付着を切り離すことができます。粒子は井戸の底に沈殿した細胞を連絡させていただきます。このレポートで説明されている研究のために、ナノ粒子の最終濃度AMɸと共培養し、125μg/ mLであった。その後の井戸と、所望の治療群に進みます。そのような培地のみと指定された井戸から200 ng / mLのリポポリサッカライド（LPS）などの正および負の対照群が含まれています。
8. 48時間5％CO ₂雰囲気下で37℃の加湿インキュベーターに培養皿を返します。私たちのlaboratorにおける運動の研究yはそれが発生する転写とタンパク質合成のための十分な時間を許可するように細胞表面マーカーの発現およびサイトカイン分泌の両方を評価するための最適な培養期間であることが48時間を示している。サイトカインの高いレベルは、拡張培養期間（すなわち、72時間）の間に蓄積されていますが、この時点で評価する細胞表面マーカーの発現はサイトカインの上昇の寄与によって混同することができます。観察表面マーカー発現の変化は、ナノ粒子自体の刺激に直接起因するとは限りません。

4。フローサイトメトリーを用いてAMɸアクティベーションを評価する

1. 蛍光活性化セルソーティング（FACS）緩衝液（0.1％アジ化ナトリウムおよび0.1％ウシ血清アルブミン（BSA））0.1 Mリン酸は、従来のナノ粒子Oと共培養されたメッキマクロファージを採取する液（pH7.4）緩衝生理食塩水を準備します。rの覚せい剤。
2. ブロッキングバッファーおよびモノクローナル抗体のワーキング溶液を調製。ブロックバッファを準備するには、FACS緩衝液中で、それぞれ、ラットIgG（Sigma）およびanti-CD16/32（ベイバイオサイエンス）に1 mg / mLと10μg/ mLで希釈します。メーカー推奨濃度またはユーザ最適化された濃度のいずれかにFACS緩衝液で表面マーカー抗体のパネルを希釈します。本研究で示された結果のため、表面マーカーパネルは、MHC II、CD86、CD40およびCIRE（CD209）に対する抗体で構成されています。マクロファージマーカーF4/80とCD11bに対する抗マウス抗体はまた、積極的にデータ解析時にマクロファージ表現型を識別するために、パネルに含まれています。近交系マウスは、しばしば彼らのMHC IIハプロタイプが異なるように、MHC II分子に対する抗体を選択する際には注意する必要があります。選択された抗体は、目的のマウス系統によって発現特定のMHC同種抗原と反応しなければなりません。
3. ナノ粒子および/またはとのインキュベーションの48時間後覚せい剤、20分間氷上に静置細胞培養皿。プレートから付着したマクロファージを削除するには、穏やかに24センチメートルセルスクレーパーで井戸を落とす。
4. 5 mLの血清学的ピペットを使用して、静かに、単一細胞懸濁液を生成するために上下に5回細胞と培地を吸引除去する。独立した5mLのポリスチレンチューブに個々のウェルの内容物をピペットように異なった実験的な治療から細胞を一緒に混合することはありません。
5. 各チューブへのFACS緩衝液2mlを追加します。
6. 10分間、4℃で250×gで細胞のチューブを遠心します。
7. 試験管ラックの上部にチューブを掻き集めることにより上清をデカントし、残留液に静かに再懸濁し、細胞ペレット。
8. モノクローナル抗体の非特異的結合を防ぐために、細胞の各チューブにブロッキングバッファー10μL（4.2で調製）を追加します。渦管と30分間氷上でインキュベートする。
9. 各チューブとincubに希釈したモノクローナル抗体の適切なボリュームを追加する15分間、氷上で暗闇の中で食べました。分析するサンプルが含まれているチューブは、polycromaticパネル（前の抗体の組み合わせの最適化、個々のラボで行われるべきである）の抗体の組み合わせを受信する必要があります。追加の制御グループが正しく個別に単一色を使用して標識した細胞に対応して標識されていない細胞の管を含む、フローサイトメーターで測定パラメータ、および補償管を設定するには、含まれるべきである。正しくフローサイトメトリー分析のためにゲートを設定するには、蛍光マイナスワン（FMO）のコントロールは、取得時に含まれるべきである。 FMOのコントロールは、それぞれのアイソタイプコントロールに置き換えられています1を除いてパネルに使用​​されるすべての蛍光標識抗体で標識した細胞である。正と負の集団（すなわち、単独で陽性対照刺激と培地で処理した細胞の別のアリコート）もFMOと補償制御管に含まれるべきである。
4℃、250×gで各チューブ、ボルテックスと遠心℃にFACS緩衝液2 mLを追加します。
10. 上清をデカントし、試験管ラックの上部にチューブをかき集め、残留液に再懸濁し、細胞ペレット。
11. 抗体パネルは蛍光色素に直接結合しない抗体で構成されていますが、代わりにビオチンに結合している場合は、蛍光標識ストレプトアビジンは、表面マーカーを可視化するために必要とされる。このステップでは、希釈した蛍光標識ストレプトアビジンの適切な量を追加し、氷上で15分間、暗所でインキュベートします。 4.2のように、ストレプトアビジンは、製造元が推奨する濃度になるように、またはユーザが最適化されたものに希釈されます。この手順は、ビオチン化一次抗体を含むパネルが必要になります。
12. 4.10で説明したように洗浄ステップを実行します。
13. 脱イオン水で固定1:3安定BDの適切な量を希釈します。しばらく静かにVOを各チューブに希釈固定液100μLを追加します。細胞の凝集を防ぐためrtexing。 °Cで約一週間のフローサイトメーターで買収する前にラベルを付け、固定した細胞を安定的に4℃で暗所に保存することができます。

5。代表的なデータ

ステップ3.1で作製したナノ粒子は、163の平均直径±24 nmであり、これまでの研究^5,16で得られたものと一致する形態を持っていた。超音波処理の前後に溶液中でナノ粒子は、粒子の適切な分散を確保するために超音波処理の必要性を示すために、 図1に示されています。肺胞を介して得られる収穫AMɸsのフローサイトメトリー分析は、 図2に示されています。抗マウスCD11bを、抗マウスF4/80抗体と同様に対応するFMOコントロールの組み合わせで細胞を標識すると、さらに分析するためにAMɸsとゲーティングを識別し、バックグラウンドの標識を確立することができる。無水物と肺胞マクロファージの治療MHC II、CD40、CD86、およびCIRE（ 図3）の増加、平均蛍光強度で示すように、ナノ粒子は、活性化を高めます。

図1 50:50 CPTEG：CPH（）は前にナノ粒子と超音波の（B）30秒後。

図2フローサイトメトリー（A）のAlexa Fluor®700抗CD11bとPE-Cy7 FMOコントロール、（B）のAlexa Fluor 700 FMO制御とPE-Cy7 anti-F4/80で標識された収穫肺胞マクロファージの分析と（C ）のAlexa Fluor®700抗CD11bとPE-Cy7 anti-F4/80。右上隅にある番号は、二重陽性細胞の割合を表します。

図3蛍光INTENの増加を示すヒストグラム50:50 CPTEGと肺胞マクロファージの共培養後、MHC II（）、CD40（B）、CD86（C）とCIRE（D）の表面発現のためにsity：CPH無水物は、48時間ナノ。ヒストグラムはAMɸFMOコントロールとしてラベルの結果を示している（ ）、未処理のAMɸすべての細胞表面マーカーに対する抗体で標識された（ ）とAMɸナノ粒子を培養し、すべての細胞表面マーカーに対する抗体で標識された（ 。）

単回投与レジメン⁵で鼻腔内に投与した場合、無水物ナノ粒子ワクチンのプラットフォームでは有効性を示している。このワクチン·デリバリー·プラットフォームによって誘発される肺内に常駐貪食細胞集団の活性化を測定することにより、最終的に適応免疫応答を促進するために、その潜在的能力の評価を可能にします。

具体的には、肺胞洗浄液から肺胞マクロファージを採取し、ナノ粒子の異なる製剤でそれらを治療する抗原提示^6,8につながる、マクロファージを活性化するために異なる粒子の化学的性質の能力への洞察を提供しています。さらに、in vitro試験で 、これらはin vivo試験大規模かつ複雑に着手する前に、肺胞マクロファージを活性化するために、これらの微粒子アジュバント製剤の能力を評価するために有用である。実験では、常にsurfacのポジティブコントロール処理を含める必要がありますこのようなLPS、Toll様受容体4のアゴニストとしての電子は、マーカーのアップレギュレーション、。注意は、このプロトコルは、1回の実験で複数の治療に必要な細胞の適切な番号を生成しない可能性がある肺胞マクロファージを採取する前に実験を計画する際に注意する必要があります。肺lavagesしたがって、より多くの治療群を持つ大規模な実験のために十分な細胞数（マウス1匹あたり〜5.0×10 ⁵細胞）を確保するために複数のマウスで実行する必要があります。肺洗浄技術は、他の種について報告されており、利用する流体の量（すなわち、マウスの肺の容量は1 mLで検討されて種に比例するため、ラットの肺の容量は10 mLと人間の肺の容量6 L ¹⁷です。

無水物ナノ粒子は、時期尚早の表面侵食を防止するために策定し、乾燥粉末の形で格納されています。そのため、粒子の凝集の結果、静的な相互作用により、超音波処理は、培養細胞に添加する前に必要です。このSTEPは、一様分布することができ、より再現性のある結果につながります。フローサイトメトリーを用いた肺胞マクロファージの細胞表面マーカーの定量化は、強い自家蛍光信号により複雑になっています。この障害は、FACSの抗体濃度、多色の蛍光色素の組み合わせ、およびフローサイトメトリーのキャプチャパラメータ（すなわち、補正コントロールの使用）を最適化することによって克服することができます。 FMOコントロールは、一度に1つの蛍光パラメータの変更を許可し、各抗体のためにゲートを設定するために有用であり、細胞表面マーカーの発現の正確な定量を可能にします。マウスの系統の違いは、特に抗体、MHC IIのハプロタイプ特異性の選択で考慮すべきである。

これは大きく異なる研究室や研究機関の間で新たな生体材料の比較を容易にするので、それは、肺における抗原提示細胞の活性を決定するために標準化されたメソッドを持つことが重要です。ジェンここで紹介するメソッドを介して肺胞マクロファージの一貫性のある集団レーティング·、ナノ粒子の異なる製剤およびそれらの免疫増強の可能性に関する有用なデータを取得するための最適な条件を提供しています。